CN116024153A - 一种灭活芽孢杆菌的制备方法及其应用 - Google Patents

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CN116024153A CN202211640414.1A CN202211640414A CN116024153A CN 116024153 A CN116024153 A CN 116024153A CN 202211640414 A CN202211640414 A CN 202211640414A CN 116024153 A CN116024153 A CN 116024153A
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杜冰
李伟杰
张余威
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Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一株包含益生菌芽孢杆菌DU106的抗皮肤衰老产品的制备及其应用。具体是将马齿苋提取物加入芽孢杆菌DU106的培养基中，收集菌体，经灭活和裂解处理得到灭活芽孢杆菌DU106。结果表明本发明所得的灭活芽孢杆菌DU106具有较强的体外自由基清除能力；将秀丽隐杆线虫暴露于灭活芽孢杆菌DU106中可提高秀丽隐杆线虫的寿命和、活力和抗氧化能力。此外，细胞实验表明该灭活芽孢杆菌DU106对人类永生化表皮细胞(HaCaT)无毒性，并提高HaCaT细胞中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性。因此，本发明提供的灭活芽孢杆菌DU106具有一定的延缓皮肤衰老的功效，可广泛应用于日用化妆品和生物医药领域，具有广阔的开发前景。

Description

一种灭活芽孢杆菌的制备方法及其应用
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一株包含益生菌芽孢杆菌DU106的抗皮肤衰老产品的制备及其应用。
技术背景：
目前，可商用的益生菌芽孢杆菌种类包括枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等。芽孢杆菌(Bacillus lactics)DU-106是本课题组前期从酸奶中分离出的一株具有极高增殖能力的好氧型产乳酸芽孢杆菌，其基因组缺乏毒力基因，具有良好的发酵性能，因而得到广泛的研究。众所周知，因个体差异原因，活的益生菌在老年、幼年和成年人之间的功效是不同的，并且益生菌的安全性在不同个体之间是有差异的。
皮肤组织是人体衰老发生最明显的征兆之一，衰老机制本质上与抗氧化机制密切相关，当衰老发生时，其细胞内产生大量的自由基，进而攻击正常的细胞，从而加速衰老的发生。大量研究表明灭活芽孢杆菌具有较强的抗氧化能力，被广泛引用于抗炎和抗菌的研究中，而对抗衰老的研究并不多。
灭活益生菌是一种灭活的微生物细胞或细胞组分，可以对使用者产生有益的影响，已引起人们的关注。目前，灭活益生菌的研究多集中在乳酸菌如植物乳杆菌、双歧杆菌和保加利亚乳杆菌等，而对灭活芽孢杆菌的研究仍然缺乏。食药同源的中药中含有大量的活性成分，如黄酮、多酚、萜类等，具有很强的抗氧化和抗衰老活性，对人体健康有多重效应，但这些中药直接食用带来的功效是非常有限的。
为解决该问题，提高中药活性成分的利用率，本发明将中药提取物进行益生菌发酵并富集于益生菌内，后将益生菌灭活，得到富含益生菌次级代谢物和中药活性成分的产品，并评价其抗氧化和抗皮肤衰老活性，以期扩大该益生菌和中药提取物的的应用范围，以满足市场的需求。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种采用马齿苋提取物培养芽孢杆菌，进而获得灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，以及所述灭活芽孢杆菌DU106在抗皮肤衰老或制备抗衰产品中的应用。
本发明提供的技术方案之一，是一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，采用马齿苋提取物培养芽孢杆菌DU106，收集菌体，进行灭菌和裂解处理后，即得灭活芽孢杆菌DU106。具体地，包括如下步骤：
(1)菌株的活化和培养：将芽孢杆菌DU106通过活化和培养后，获得菌体浓度1×109～1×1010CFU/mL的菌液；
(2)马齿苋提取物的制备：马齿苋切碎，加水大火煮沸，转入小火煎煮后过滤，将滤液采用无菌水稀释后备用；
(3)将芽孢杆菌DU106菌液、马齿苋提取物加入培养基中进行培养，培养至OD600nm为0.8～1.2，即得到富含马齿苋活性成分的芽孢杆菌DU106；
(4)离心收集菌体，并采用NaCl溶液洗涤2-3次，之后将菌体重悬于NaCl溶液中进行灭菌处理；
(5)灭菌完成的菌体冷却至室温后，加入溶菌酶并进行超声破碎，即得灭活芽孢杆菌DU106。
进一步地，所述芽孢杆菌DU106，保藏编号为GDMCC No:60621。
进一步地，步骤(1)中，菌株活化和培养采用的培养基为LB培养基；LB液体培养基(％)：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.1％，其余为水，121℃灭菌15min。
进一步地，步骤(2)中，马齿苋提取物的制备方法为：称取1～5份干燥马齿苋，切碎，加入100份水，大火煮沸，转入小火煎煮30min，过滤得滤液，用无菌水补足到100份即得马齿苋提取物，备用；
进一步地，步骤(3)中，每100-150份LB液体培养基，加入10-15份马齿苋提取物和1-1.5份芽孢杆菌DU106菌液；
进一步地，步骤(3)中，培养条件为：30-37℃，暗处静置培养24～72h，至OD600nm为0.8～1.2；
进一步地，步骤(4)中，6000×g离心15～20min，收集菌体；
进一步地，步骤(4)中，在离心收集的菌体中加入50-100倍重量的0.9％ NaCl溶液洗涤菌体，洗涤完成后，6000×g离心15～20min，收集菌体，重复2～3次；
进一步地，步骤(4)中，最终将菌体重悬于100倍重量的0.9％ NaCl溶液中，121℃，30min灭菌处理；
进一步地，步骤(5)中，灭菌完成的菌体冷却至室温后，加入5％～10％(V/V)10mg/mL溶菌酶，震荡反应30min后于超声细胞破碎仪中破碎(功率400W，间隔10s，共计30min)，即得所述的灭活芽孢杆菌DU106。
本发明提供的技术方案之二，是由上述方法制备获得的灭活芽孢杆菌DU106。
本发明提到的技术方案之三，是上述灭活芽孢杆菌DU106的应用，特别是在制备抗衰老产品中的应用。
本发明提到的技术方案之四，是芽孢杆菌DU106在抗衰老中的应用，特别是在制备抗衰老产品中的应用。
有益效果：
对本发明制备的灭活芽孢杆菌DU106进行功能性评价，利用体外抗氧化、秀丽隐杆线虫模型和HaCaT细胞模型评价灭活芽孢杆菌DU10的皮肤抗衰老效果。结果表明，该灭活芽孢杆菌DU106具有较强的抗氧化能力，显著延长了秀丽隐杆线虫的寿命和抗氧化水平；此外，细胞实验表明该灭活芽孢杆菌DU106对人类永生化表皮细胞(HaCaT)无毒性，并提高HaCaT细胞中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，从而达到延缓皮肤衰老的效果。
可知，本发明的灭活芽孢杆菌DU106具有延缓皮肤衰老的功效，为该益生菌在化妆品、保健品和医药等行业的应用提供理论基础，具有广泛的发展前景。
附图说明：
图1灭活芽孢杆菌DU106对自由基清除率效果评价。
图2灭活芽孢杆菌DU106对秀丽隐杆线虫运动能力影响其中，A：线虫自发运动，不需要触碰刺激；B：线虫必须受到触碰刺激才运动；C：线虫受到触碰刺激后只摆头或尾。
图3灭活芽孢杆菌DU106对秀丽隐杆线虫体内抗氧化能力影响其中，标记不同字母代表具有显著差异(P＜0.05)。
图4灭活芽孢杆菌DU106对HaCaT细胞的影响
其中，标记不同字母代表具有显著差异(P＜0.05)。
具体实施方式：
为使本发明实现的技术手段、达成目的与功效易于理解，以下结合具体实例对本发明进行进一步描述。但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明及实施例涉及的部分培养基如下：
LB琼脂培养基(％)：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.1％、琼脂1.5％，其余为水，121℃灭菌15min。
LB液体培养基(％)：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.1％，其余为水，121℃灭菌15min。
本申请所述涉及的芽孢杆菌DU106，全称为芽孢杆菌(Bacillus lactics)DU-106，已于2019年3月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏编号为GDMCCNo:60621。地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；邮编510075。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1一种具有增强的抗皮肤衰老活性的灭活芽孢杆菌的制备方法
a:菌株的活化和培养
a1：用接种环从冻存管中刮取少量芽孢杆菌DU106接种于LB琼脂培养基中37℃培养24h。
a2：用接种环挑取a1所述的芽孢杆菌DU106的单菌落于LB液体培养基中37℃扩大培养24h。
a3：在波长为600nm处测定a2中的LB液体培养基的吸光值，使吸光值处于0.8～1.2之间，此时菌体浓度达到1×109CFU/mL。
b:马齿苋提取物制备
b1：称取1份干燥马齿苋，切碎，加入100份水，大火煮沸，转入小火煎煮30min。最后溶液过滤，滤液用无菌水补足到100份，备用。
c:菌株与马齿苋提取物共培养及灭活菌制备
c1:按重量份数取LB液体培养基100份，加入10份马齿苋提取物和1份a3中获得的芽孢杆菌DU106菌液，30℃于暗处静置培养72h，在波长600nm处测定吸光值1.0，即得到富含马齿苋活性成分的芽孢杆菌DU106。
c2:当c1中培养液的吸光值处于1.0时，6000×g离心20min，收集菌体。
c3：c2中收集的菌体用其100倍重量的0.9％ NaCl溶液冲洗，冲洗完成后，6000×g离心20min，收集菌体，该冲洗步骤重复3次。
c4：最后一次冲洗并离心的菌体立即重悬于100倍重量的0.9％ NaCl溶液中。并将重悬的菌体置于121℃，30min灭菌处理。
c5：将c4中灭菌完成的菌体冷却至室温后，加入10％(V/V)10mg/mL溶菌酶震荡反应30min后，于超声细胞破碎仪中破碎(功率400W，间隔10s，共计30min)，即得灭活芽孢杆菌DU106产品。本发明不同批次获得产品浓度在15-22mg/mL左右。
a1中所述的琼脂培养基如下：
LB琼脂培养基(％)：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.1％、琼脂1.5％，其余为水，121℃灭菌15min。
a2和c1中所述的液体培养基如下：
LB液体培养基(％)：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.1％，其余为水，121℃灭菌15min。
c5中，V/V含义：加入10mg/mL溶酶体的体积与c4中所得菌体体积之比。
实施例2一种具有增强的抗皮肤衰老活性的灭活芽孢杆菌的制备方法
将实施例1中步骤c1的马齿苋提取物的制备方法由b1替换为以下的步骤b2，其余均与实施例1保持一致，制备获得实施例2灭活芽孢杆菌DU106产品。
b2：称取3份干燥马齿苋，切碎，加入100份水，大火煮沸，转入小火煎煮30min。最后溶液过滤，滤液用无菌水补足到100份，备用。
实施例3一种具有增强的抗皮肤衰老活性的灭活芽孢杆菌的制备方法
将实施例1中步骤c1的马齿苋提取物制备方法b1替换为以下的步骤b3，其余均与实施例1保持一致，制备获得实施例3灭活芽孢杆菌DU106产品。
b3：称取5份干燥马齿苋，切碎，加入100份水，大火煮沸，转入小火煎煮30min。最后溶液过滤，滤液用无菌水补足到100份，备用。
对照例1：一种灭活芽孢杆菌的制备方法
将实施例1步骤c1中所述的10份马齿苋提取物替换为10份无菌蒸馏水，培养至OD600nm＝1.0，其余均与实施例1保持一致，制备获得对照例1灭活芽孢杆菌DU106产品。
对照例2：以实施例3中b3所得马齿苋提取物为对照例2样品。
实验例4：体外抗氧化效果评价
4.1试验分组
Vc组：试验样品为维生素C
对照例1组：试验样品为对照例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
对照例2组：试验样品为对照例2制备的马齿苋提取物样品。
实施例1组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
实施例2组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
实施例3组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
将上述样品分别由原浓度稀释成0.5、1、2、3、4、5mg/mL的样品进行后续实验。
4.2试验方法
4.2.1DPPH·清除能力
实验组取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，加入2mL 0.2mmol/L的DPPH溶液，充分摇匀后，4000rpm离心6min,静置30min,以无水乙醇为参比组调零，在517nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率按照公式如下计算。
DPPH自由基清除能力＝[1-(AS-AC)/A0]×100％
其中：AS为实验组吸光度；AC为用无水乙醇替代DPPH溶液的对照组吸光度；A0为用无水乙醇替代样品溶液的空白组吸光度。
4.2.2羟自由基清除能力
实验组取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，依次加入6mmol/L的FeSO4溶液和6mmol/L H2O2溶液各2mL，摇匀后静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸2mL，摇匀后室温避光静置30min，在510nm测其吸光度。羟自由基清除率按照公式如下计算。
羟自由基清除能力＝[1-(AS-AC)/A0]×100％
其中：AS为实验组吸光度；AC为用蒸馏水替代水杨酸的对照组吸光度；A0为用蒸馏水替代样品溶液的空白组吸光度。
4.2.3ABTS阳离子清除能力
实验组取7.4mmol/L ABTS储备液2mL与2mL的2.6mmol/L K2S2O8混匀，室温放置14h后，用95％乙醇稀释至室温下734nm处吸光度为0.700±0.035，即获得ABTS工作液。将2.0mLABTS工作液分别与1mL不同浓度的样品溶液混匀，室温静置20min后，在734nm处测定吸光度，ABTS阳离子自由基清除率按照公式如下计算。
羟自由基清除能力＝[1-AS/A0]×100％
其中：AS为实验组吸光度；A0为用蒸馏水替代样品溶液的空白组吸光度。4.2.4超氧阴离子清除能力
实验组向25℃的4mL 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)中加入1.0mL6mmol/L的邻苯三酚和1mL不同浓度的样品，在25℃下水浴5min，最后加入2滴浓盐酸终止反应，在320nm处测定吸光度。超氧阴离子自由基清除率按照公式如下计算。
超氧阴离子自由基清除能力＝[1-AS/A0]×100％
其中：AS为实验组吸光度；A0为用蒸馏水替代样品溶液的空白组吸光度。
4.3试验结果
由图1可知，灭活芽孢杆菌DU106在0.5～5mg/mL的浓度范围内对DPPH、羟自由基、ABTS阳离子自由基和超氧自由基的清除率随着浓度的增加而增强，且实施例的自由基清除效果强于对照例1和对照例2。说明，添加马齿苋提取物培养的芽孢杆菌DU106抗氧化能力增强。当实施例3样品浓度稀释为5mg/mL时，灭活芽孢杆菌DU106对羟自由基和ABTS阳离子自由基的清楚能力与维生素C相当，其清除率超过80.0％以上。实验结果表明，本发明采用马齿苋提取物培养的灭活芽孢杆菌DU106拥有良好的体外抗氧化效果，且效果优于单独使用马齿苋提取物或单独使用芽孢杆菌DU106，为后续抗衰老试验提供依据。
实验例5：秀丽隐杆线虫实验评价
5.1试验方法：
5.1.1试验分组
对比例：试验样品为蒸馏水。
对照例1组：试验样品为对照例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
对照例2组：试验样品为对照例2制备的马齿苋提取物样品。
实施例1组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
实施例2组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
实施例3组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
上述样品在体系中的浓度由原浓度稀释为5mg/mL进行后续实验。
5.1.2线虫同期化培养
N2野生型秀丽隐杆线虫充分培养后，将NGM板上的虫卵用线虫M9缓冲液冲洗至无菌离心管中，3000rpm离心1min，弃去上清液，加入1mL次氯酸钠裂解液裂解3min，使虫体裂解。裂解后3000rpm离心1min，弃去上清液，加入1mL M9缓冲液反复冲洗3次。最后将沉淀与少量M9缓冲液混匀，滴入NGM培养基中，约48h后虫卵基本发育成L4期幼虫，完成同期化操作。
5.1.3线虫寿命测定
挑取同期化L4期N2野生型秀丽隐杆线虫于滴于含有5mg/mL样品和1×109cfu/mL大肠埃希氏菌OP50的NGM培养基中(每组3次平行，每个平行30条线虫)，每隔2天转移至新的NGM培养基中，并记录各组死亡线虫数，记录线虫生存、死亡及剔除实验的条数，直至所有组线虫全部死亡。同时在第0、4、8、12、16天评价线虫的运动能力，评价标准：①线虫自发运动，不需要触碰刺激，记为A；②线虫必须受到触碰刺激才运动，记为B；③线虫受到触碰刺激后只摆头或尾，记为C。
5.1.4体内抗氧化活性测定
挑取同期化L4期线虫于滴有含5mg/mL样品和1×109cfu/mL大肠埃希氏菌OP50的NGM培养基中(每组3次平行，每个平行50条线虫)，持续5天，干预结束后，用M9缓冲液将各组线虫冲洗并离心收集虫体(3000rpm离心1min)。加入研磨珠冷冻研磨(50Hz，30min)，3000rpm/min离心5min，取上清液备用。根据试剂盒说明测定上清液中ROS水平、超氧化物歧化酶活性(SOD)、过氧化氢酶活性(CAT)和谷胱甘肽水平(GSH)。
5.2试验结果
5.2.1灭活芽孢杆菌DU106对秀丽隐杆线虫寿命及运动能力影响
如表1所示，对比例和对照例中线虫的中位生存时间大约为14天和15天，而实施例1、2、3中秀丽隐杆线虫中位生存时间为15.85～18.37天，表明其有效延长了秀丽隐杆线虫的平均寿命，且实施例2的平均寿命显著高于对比例(P＜0.05)，同时，对照例1和对照例2中秀丽隐杆线虫的最长寿命为28天，而实施例3中秀丽隐杆线虫的最长寿命达31天，有效延缓了秀丽隐杆线虫的衰老。由图2可知，对比例、对照例1和对照例2的秀丽隐杆线虫的运动能力较实施例的运动能力弱，尤其是在第12天之后，能更明显得看出运动能力的差距。结果表明，灭活芽孢杆菌DU106能有效延缓秀丽隐杆线虫的平均寿命，同时增强秀丽隐杆线虫的运动能力，且经马齿苋提取物培养的芽孢杆菌DU106显示出更强的抗衰老效果。
表1灭活芽孢杆菌DU106对秀丽隐杆线虫寿命的影响
Figure BDA0004008689920000091
注：*P＜0.05，与对比例比较
5.2.2灭活芽孢杆菌DU106对秀丽隐杆线虫体内抗氧化能力影响
众所周知，抗氧化能力与衰老息息相关，衰老会导致机体内自由基堆积，氧化应激增强，而提高抗氧化能力能够帮助机体清除多余自由基，从而达到抗衰老的效果。研究表明体内CAT和SOD对清除体内自由基，减缓氧化应激至关重要，GSH是一种强的还原剂，若机体内存在大量自由基，则GSH的水平会下降。
如图3所示，对比例中线虫体内GSH水平为72.15μmol/mgprot，显著低于其它实验组的GSH水平(P＜0.05)；与对照例1和对照例2相比，实施例提高了秀丽隐杆线虫体内CAT和SOD的水平，呈剂量依赖性。说明加入马齿苋提取物培养提高了灭活芽孢杆菌DU106的体内抗氧化能力。由此可见，本发明提供的灭活芽孢杆菌DU106通过增强秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶的水平，进而延长秀丽隐杆线虫寿命和活力，达到抗衰老的效果。
实验例6：HaCaT细胞实验评价
6.1实验方法
实验分组：
对照例1组：试验样品为对照例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
对照例2组：试验样品为对照例2制备的马齿苋提取物样品。
实施例1组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
实施例2组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
实施例3组：试验样品为实施例1制备的灭活芽孢杆菌DU106。
采用DMEM培养基将上述样品分别由原浓度稀释至成0.1mg/mL后进行后续实验。
6.1.1细胞培养
将人类永生化表皮细胞(HaCaT)置于37℃，5％ CO2的三气培养箱中培养，培养条件：HaCaT细胞专用培养基(含15％胎牛血清)。
6.1.2细胞增殖活性
采用CCK-8法测定HaCaT细胞增殖活性；当细胞密度达到1×104个/孔后，接种于96孔板培养24h，接着用磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入100μL上述由DMEM培养基稀释至0.1mg/mL的样品作为培养基，设置对比例(只加DMEM培养基，不含样品)。继续培养24h后，每孔加入CCK-8工作液，于培养箱内避光孵育2h后用酶标仪检测各实验组在450nm处的吸光度计算细胞存活率。
6.1.3灭活芽孢杆菌DU106对衰老模型HaCaT细胞的影响
当HaCaT细胞密度达到1×104个/孔后，接种于96孔板培养24h，接着用磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入上述由DMEM培养基稀释至0.1mg/mL的样品作为培养基继续培养24h。接着用磷酸盐缓冲液冲洗2次，最后加入300μmol/L的叔丁基过氧化氢(TBHP)孵育2h。在上述实验的基础上，设置对比例1(采用等量DMEM培养基替换TBHP，其余保持不变)和对比例2(加不含样品的DMEM培养基，其余保持不变)。
TBHP作用2h后，磷酸盐缓冲液冲洗2次，超声破碎细胞。按照各试剂盒的操作方法分别测定SOD和CAT的活力。
6.2实验结果
如图4A所示，使用CCK-8法对灭活芽孢杆菌DU106进行毒性研究，结果表明各实验组灭活芽孢杆菌DU106对HaCaT细胞都没有毒性，不影响细胞增殖，且存活率都大于90％。
TBHP是一种可在多种细胞系中诱导氧化应激及细胞损伤的氧化剂，可诱导细胞产生ROS，从而使所介导的生物分子损伤会导致细胞凋亡及衰老。如图4B和图4C所示，仅使用TBHP处理的对比例2的HaCaT细胞的CAT和SOD活力均显著低于对比例1(P＜0.01)，说明造模成功。然而，当使用马齿苋或灭活芽孢杆菌DU106处理后，其HaCaT细胞中CAT和SOD的活力相较于对比例2显著提高(P＜0.01)，并呈浓度依赖性，与对照例1和对照例2相比，本发明提供的加入不同份量的马齿苋提取物培养获得的灭活芽孢杆菌DU106具有更好的抗衰老活性，由此说明，本发明提供的灭活芽孢杆菌DU106可通过提高HaCaT细胞中抗氧化酶的活力达到延缓皮肤细胞衰老的效果。
6.3实验结论
本发明制备的灭活芽孢杆菌DU106浓度在0.1mg/mL时对HaCaT细胞无毒性。此外，本发明制备的灭活芽孢杆菌DU106减轻了TBHP诱导的衰老HaCaT细胞CAT和SOD活力的下降，灭活芽孢杆菌DU106通过提高CAT和SOD的活力以减轻自由基损伤细胞，这有利于延缓HaCaT细胞的衰老，其效果优于单独马齿苋提取物和未添加马齿苋提取物培养的灭活芽孢杆菌DU106。基于此，灭活芽孢杆菌DU106可应用在护肤化妆品中，从而延缓诸如面部皮肤、手部皮肤等部位的皮肤衰老。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (10)

1.一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，其特征在于，采用马齿苋提取物培养芽孢杆菌DU106，收集菌体，进行灭菌和裂解处理后，即得灭活芽孢杆菌DU106；具体包括如下步骤：
(1)菌株的活化和培养：将芽孢杆菌DU106通过活化和培养后，获得菌体浓度1×109～1×1010CFU/mL的菌液；
(2)马齿苋提取物的制备：马齿苋切碎，加水大火煮沸，转入小火煎煮后过滤，将滤液采用无菌水稀释后备用；
(3)将芽孢杆菌DU106菌液、马齿苋提取物加入培养基中进行培养，培养至OD600nm为0.8～1.2，即得到富含马齿苋活性成分的芽孢杆菌DU106；
(4)离心收集菌体，并采用NaCl溶液洗涤2-3次，之后将菌体重悬于NaCl溶液中进行灭菌处理；
(5)灭菌完成的菌体冷却至室温后，加入溶菌酶并进行超声破碎，即得灭活芽孢杆菌DU106；
所述芽孢杆菌DU106，保藏编号为GDMCC No:60621。
2.如权利要求1所述的一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，马齿苋提取物的制备方法为：称取1～5份干燥马齿苋，切碎，加入100份水，大火煮沸，转入小火煎煮30min，过滤得滤液，用无菌水补足到100份即得马齿苋提取物，备用。
3.如权利要求1所述的一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，每100-150份LB液体培养基，加入10-15份马齿苋提取物和1-1.5份芽孢杆菌DU106菌液。
4.如权利要求1所述的一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，培养条件为：30-37℃，暗处静置培养24～72h，至OD600nm为0.8～1.2。
5.如权利要求1所述的一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，在离心收集的菌体中加入50-100倍重量的0.9％NaCl溶液洗涤菌体，洗涤完成后，离心收集菌体，重复2～3次。
6.如权利要求1所述的一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，最终将菌体重悬于100倍重量的0.9％NaCl溶液中，121℃，30min灭菌处理。
7.如权利要求1所述的一种灭活芽孢杆菌DU106的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，灭菌完成的菌体冷却至室温后，加入5％～10％体积的10mg/mL溶菌酶，震荡反应30min后于超声细胞破碎仪中破碎，即得所述的灭活芽孢杆菌DU106。
8.权利要求1-7任意一项所述方法制备的灭活芽孢杆菌DU106。
9.权利要求9所述灭活芽孢杆菌DU106在制备抗衰老产品中的应用。
10.芽孢杆菌DU106在抗衰老中的应用，其特征在于，是在制备抗衰老产品中的应用。
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