CN108373501A - 一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，特别是针对禽李氏杆菌病、禽多杀性巴氏杆菌病、禽大肠杆菌病的卵黄抗体(IgY)。所述抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，包括源自禽类卵黄的禽李氏杆菌抗体、禽多杀性巴氏杆菌抗体和禽大肠杆菌抗体。该复合卵黄抗体能够直接作用于机体，其同源性及效用性均高于其它的生物制剂，从而解决了抗生素药物对肉禽蛋禽产品残留物的问题，为有效提高该类产品的质量提供了有利的保证。本发明进一步提供前述复合卵黄抗体的制备方法和用途，该制备方法工艺简单、绿色环保，并且产品杂质含量低、纯度高；制得的复合卵黄抗体能够作为禽类药物或饲料添加剂应用。

Description

一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，特别是针对禽李氏杆菌病、禽多杀性巴氏杆菌病、禽大肠杆菌病的卵黄抗体(IgY)，进一步涉及其制备方法和用途。
背景技术
鸡李氏杆菌病(avian Listeriosos)又称禽单核细胞增多症，是由李氏杆菌引起禽类的一种散发性传染病。鸡感染后主要表现为单核细胞增生性脑膜脑炎、坏死性肝炎和心肌炎等症状。李氏杆菌还易感染家畜和人，重者表现为脑膜脑炎、流产、败血症和单核细胞增多，轻者表现为结膜炎。鸡李氏杆菌病引起鸡散发性败血症，死亡率通常较低，但有时也可高达52％～100％。本病死亡率高低常与是否存在其他疾病混合感染有关。
禽霍乱是多杀性巴氏杆菌说引起的一种急性、热性传染性疾病，是一种呈世界性分布的重要禽细菌性传染病。禽霍乱的急性型常以败血症和出血性炎症为主要炎症；慢性型常表现为皮下结缔组织，关节及各脏器的化脓性病灶，并多与其他疾病混合感染或继发。此类疾病一年四季均可发生，造成的危害贯穿了整个养殖周期，并且很容易发生交叉感染。若得不到有效地控制，将给养禽业造成严重的经济损失。
大肠杆菌是家禽养殖中最为常见的病原菌之一，可引起家禽胚胎死亡、气囊炎、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和输卵管炎等一系列表现。
鸡群发病时应立即采取治疗措施，有条件的地方应通过药敏试验选择有效药物全群给药。磺胺类药物、氯霉素、红霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、喹乙醇均有较好的疗效。对常发地区或鸡场，药物治疗效果日渐降低，本病很难得到有效地控制，却直接导致肉禽类食品抗生素残留、激素残留、重金属残留和农药残留大大超过我国自订的综色无污染标准和国际出口标准另有部分养殖企业采用中药制剂方式对鸡群进行该类疫病的防治，但由于种种原因，中药制剂禽药的效果不甚理想，其主要原因是禽类对中药药剂的吸收不好，药效在鸡体上得不到较好的体现，因而疫病在鸡群中无法从根本上得到控制。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，该复合卵黄抗体具有提取产品无污染且安全高效、价格低廉的特点，并且通过抗体复配实现了协同的防治效果，优于中药药剂和各类抗体单独施用，并且不会产生抗生素所导致的药物超标等问题。进一步地，本发明提供了该抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体的制备方法和用途。
在一个方面，本发明提供了一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，该复合卵黄抗体包括源自禽类卵黄的禽李氏杆菌抗体、禽多杀性巴氏杆菌抗体和禽大肠杆菌抗体。
本发明根据国内兽药及生物制品方向发展的趋势进行研究，针对禽李氏杆菌病、禽多杀性巴氏杆菌病、禽大肠杆菌病等主要靠抗生素药物进行防治的细菌性疫病问题，采用禽李氏杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、禽大肠杆菌复合抗原接种产蛋鸡等禽类，诱导其免疫产生高效价免疫球蛋白，通过富集纯化这些免疫球蛋白以获得复合卵黄抗体制剂。本发明解决了以往生物制剂禽类药物杂质含量过高，免疫球蛋白效果不明显，受制条件多，无法真正进行产业化生产的难点，有效提高了免疫球蛋白的纯度，使其直接作用于机体，其同源性及效用性均高于其它的生物制剂；同时解决了抗生素药物对肉禽蛋禽产品残留物的问题，为有效提高该类产品的质量提供了有利的保证。
在另一个方面，本发明进一步提供了前述抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1、准备包括禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原、禽大肠杆菌抗原在内的复合菌体抗原；
S2、对产卵雌性禽类注射该复合菌体抗原，在诱导其免疫反应后收集其卵；
S3、提取并纯化该卵的卵黄抗体，得到抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体。
进一步地，步骤S1中，以白油佐剂乳化所述禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原，得到所述复合菌体抗原；所述白油佐剂与三种抗原的体积比为3:1；所述禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原的重量比为1:1:1。
进一步优选，步骤S1中，禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原通过以下方法制备：
(i)培养禽李氏杆菌抗原：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得到纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得到禽李氏杆菌抗原；
(ii)培养多杀性巴氏杆菌抗原：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得到多杀性巴氏杆菌抗原；
(iii)培养大肠杆菌抗原：将菌种接种于麦康凯琼脂平板，置37℃培养24h。得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得到大肠杆菌抗原。
进一步优选，步骤S2具体为：
S201、基础免疫：选用产卵雌性禽类隔离饲养，进行皮下多点注射前述复合菌体抗原，注射量0.5-1ml/只；
S202、强化免疫：基础免疫10-15天后，进行强化免疫，注射前述复合菌体抗原，注射量0.5-1.0ml/只；
S203、超强化免疫：强化免疫10-21天后，超强化免疫1-3次，每次注射前述复合菌体抗原，注射量1.0-2.0ml/只，以保持抗体滴度；
S204、在超强化免疫15-30天之后，收集含有复合抗体的禽卵。
进一步优选，步骤S3具体为：
S301、用去离子水稀释卵黄并混匀，调节pH值至5-5.5，并在4℃下静置6-12h，取上清液；
S302、向S301的上清液中加入非离子表面活性剂，至非离子表面活性剂的终浓度为1.2wt.％，并在4℃静置6-12h，过滤后取上清液；
S303、向S302的上清液中加入有机酸并缓慢搅拌，并在4℃下静置6-12h，离心分离后弃去沉淀，得到复合卵黄抗体。
更进一步优选，步骤S3具体为：
S311、用4倍体积的去离子水稀释卵黄并混匀，再用醋酸调节pH至5-5.5，并在4℃静置6-12h，取上清液；
S312、向S311的上清液加入泊洛沙姆，至泊洛沙姆的终浓度为1.2％，并在4℃静置6-12h，经微孔滤器过滤后取上清液；
S313、向S313的上清液中加入0.2wt.％的辛酸，并缓慢搅拌，4℃静置6-12h，然后以10000r/min的转速离心30min后弃去沉淀，得到复合卵黄抗体。
上述步骤中，制备得到的复合卵黄抗体中，卵黄抗体的纯度在90％以上。
更进一步优选步骤S3还包括：
S300、将含有复合抗体的禽卵在1wt.％的新洁尔灭溶液中浸泡30min后，洗净捞出、自然晾干，将鸡蛋打壳后弃掉蛋清，将蛋黄在无菌纱布上滚动吸干水分后收集备用。
(方法制备得到的复合IgY)
在另一个方面，本发明进一步提供了前述抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体在制备用于治疗禽类因禽李氏杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、禽大肠杆菌单一和/或混合感染引起的疾病的禽类药物或饲料添加剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、提供一种复合卵黄抗体，使其直接作用于机体，其同源性及效用性均高于其它的生物制剂，从而解决了抗生素药物对肉禽蛋禽产品残留物的问题，为有效提高该类产品的质量提供了有利的保证。
2、进一步提供前述复合卵黄抗体的制备方法，该制备方法工艺简单、绿色环保，并且产品杂质含量低、纯度高，最大限度地维持了免疫球蛋白的效果。
3、本发明还提供了前述复合卵黄抗体作为禽类药物或饲料添加剂中的应用，不仅可以针对单一抗原菌体进行防治，还能依赖多抗体的协同效果，起到联防联治的作用，增强了防治效果。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
按照以下步骤制备复合菌体抗原：
(i)培养禽李氏杆菌：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得到纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得菌体抗原；
(ii)培养多杀性巴氏杆菌：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得菌体抗原；
(iii)培养大肠杆菌：将菌种接种于麦康凯琼脂平板，置37℃培养24h。得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得菌体抗原；
以白油佐剂乳化所述禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原，得到复合菌体抗原；所述白油佐剂与三种抗原的体积比为3:1；所述禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原的重量比为1:1:1。
使用前述得到的复合菌体抗原对产卵母鸡进行免疫以制备抗体，步骤如下：
(1)对产卵母鸡的免疫：
(i)基础免疫：选用健康的产卵母鸡隔离饲养，进行皮下多点注射上述菌体复合抗原，注射量0.5ml/只
(ii)强化免疫：基础免疫10天后，进行强化免疫，注射上述菌体复合抗原，注射量1ml/只；
(iii)超强化免疫：强化免疫21天后需超强化免疫2次，每次注射上述菌体复合抗原，注射量1.5ml/只，以保持抗体滴度；
(iv)在超强化免疫20天之后，收获高免鸡蛋。
(2)卵黄抗体的提取
(i)将高免鸡蛋浸泡在1％的新洁尔灭溶液中，浸泡半小时后洗净捞出放在消毒后的塑料蛋托上，自然晾干。将鸡蛋打壳后弃掉蛋清，将蛋黄在无菌纱布上滚动吸干水分后收于大烧杯中，等待做进一步处理；
(ii)用4倍的去离子水稀释卵黄，混匀，再用醋酸调节pH至5.2左右，4℃静置8h，取上清液；
(iii)继续向步骤(ii)中的上清液加入泊洛沙姆至泊洛沙姆的终浓度为1.2％，4℃静置9h，经微孔滤器过滤后取上清液；
(iv)再向步骤(iii)中的上清液中加入0.2％的辛酸，并缓慢搅拌，4℃静置10h，然后以10000r/min的转速离心30min，弃沉淀，可得到纯度90％以上的IgY。
实施例2
将实施例1制备得到的复合卵黄抗体与饲料混合，对肉鸡进行投喂，复合卵黄抗体占饲料的质量百分比为0.05-0.5％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (11)

1.一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，其特征在于，所述复合卵黄抗体包括源自禽类卵黄的禽李氏杆菌抗体、禽多杀性巴氏杆菌抗体和禽大肠杆菌抗体。
2.根据权利要求1所述的抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、准备包括禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原、禽大肠杆菌抗原在内的复合菌体抗原；
S2、对产卵雌性禽类注射该复合菌体抗原，在诱导其免疫反应后收集其卵；
S3、提取并纯化该卵的卵黄抗体，得到抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，以白油佐剂乳化所述禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原，得到所述复合菌体抗原；所述白油佐剂与三种抗原的体积比为3:1；所述禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原的重量比为1:1:1。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，禽李氏杆菌抗原、禽多杀性巴氏杆菌抗原和禽大肠杆菌抗原通过以下方法制备：
(i)培养禽李氏杆菌抗原：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得到纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得到禽李氏杆菌抗原；
(ii)培养多杀性巴氏杆菌抗原：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得到多杀性巴氏杆菌抗原；
(iii)培养大肠杆菌抗原：将菌种接种于麦康凯琼脂平板，置37℃培养24h。得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，得到大肠杆菌抗原。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：
S201、基础免疫：选用产卵雌性禽类隔离饲养，进行皮下多点注射前述复合菌体抗原，注射量0.5-1ml/只；
S202、强化免疫：基础免疫10-15天后，进行强化免疫，注射前述复合菌体抗原，注射量0.5-1.0ml/只；
S203、超强化免疫：强化免疫10-21天后，超强化免疫1-3次，每次注射前述复合菌体抗原，注射量1.0-2.0ml/只，以保持抗体滴度；
S204、在超强化免疫15-30天之后，收集含有复合抗体的禽卵。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3具体为：
S301、用去离子水稀释卵黄并混匀，调节pH值至5-5.5，并在4℃下静置6-12h，取上清液；
S302、向S301的上清液中加入非离子表面活性剂，至非离子表面活性剂的终浓度为1.2wt.％，并在4℃静置6-12h，过滤后取上清液；
S303、向S302的上清液中加入有机酸并缓慢搅拌，并在4℃下静置6-12h，离心分离后弃去沉淀，得到复合卵黄抗体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S3具体为：
S311、用4倍体积的去离子水稀释卵黄并混匀，再用醋酸调节pH至5-5.5，并在4℃静置6-12h，取上清液；
S312、向S311的上清液加入泊洛沙姆，至泊洛沙姆的终浓度为1.2％，并在4℃静置6-12h，经微孔滤器过滤后取上清液；
S313、向S313的上清液中加入0.2wt.％的辛酸，并缓慢搅拌，4℃静置6-12h，然后以10000r/min的转速离心30min后弃去沉淀，得到复合卵黄抗体。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤S3还包括：
S300、将含有复合抗体的禽卵在1wt.％的新洁尔灭溶液中浸泡30min后，洗净捞出、自然晾干，将鸡蛋打壳后弃掉蛋清，将蛋黄在无菌纱布上滚动吸干水分后收集备用。
9.根据权利要求2-8任一项所述的制备方法制备得到的复合卵黄抗体。
10.根据权利要求1或9所述的复合卵黄抗体，其特征在于，卵黄抗体的纯度在90％以上。
11.根据权利要求1、9或10所述的复合卵黄抗体在制备用于治疗禽类因禽李氏杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、禽大肠杆菌单一和/或混合感染引起的疾病的禽类药物或饲料添加剂中的应用。
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