CN104383536A - 一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液及其制备方法。其配方在于，包括以下按照体积比计算的原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液95-105、辛酸0.2-0.3、甲醛0.2-0.3、硫柳汞0.01-0.02；还包括800-1000单位/毫升口服液的青链霉素。制备时采用高免蛋全蛋得到澄清卵黄抗体口服液。这种方法制备的卵黄抗体口服液不仅使生产过程中损失少、免疫活性物质强多、生物活性高、无临床副作用，同时，含有蛋清中大量的各种蛋白质，可以减少口服时对抗体的不良影响。

Description

一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液及其制备方法

技术领域

本发明属于禽类用生物制品技术领域，涉及一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液及其制备方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎病是养鸭业中常见的疾病，容易大范围内爆发，二者有时会混合感染，给治疗增加了难度。防治方法很多，其中蛋黄抗体是最有效的治疗鸭发生病毒病的方法。

鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，主要危害20日龄以内的雏鸭，雏鸭日龄越小，死亡率越高，最高死亡率可达90%-95%，并且所有的抗菌素对本病无效。我国在1958年发现本病，20世纪80年代初期起本病在我国再次流行，此后，各地疫情此起彼伏，疫情能够被鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制；1997年后，本病在某些地区出现较严重的流行，其疫情不能被标准鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗完全地控制，怀疑有I型鸭病毒性肝炎病毒变异株出现。

卵黄抗体IgY是的一种免疫球蛋白Ig，IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但结构上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空间构象。卵黄抗体具有很多优越性。（1）由于鸟类与哺乳类动物种系发生学的差距，鸟类更适于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体。卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fc受体结合，这在免疫诊断中具有重要意义。（2）卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项试验表明，IgY具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热。卵黄抗体较易保存，4℃条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。（3）卵黄抗体量大，成本低，便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上。总的来讲，卵黄抗体对动物没有毒副作用，用卵黄抗体治疗动物疾病不但避免了血清价格昂贵、产量低的缺点，而且可以避免血清在治疗过程中引起的副作用，是一种很有前途的新型免疫球蛋白制剂。因此，卵黄抗体在禽畜疾病诊断、治疗和预防的应用越来越多。目前卵黄抗体的制备及生产工艺已经成熟，可以保质保量的生产。

发明内容

本发明提供一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液及其制备方法，解决注射用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体使用不方便的问题。

本发明目的是通过以下形式实现的：

一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液，包括以下按照体积比计算的原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液95-105、辛酸0.2-0.3、甲醛0.2-0.3、硫柳汞0.01-0.02；还包括800-1000单位/毫升口服液的青链霉素。

制备步骤是：

1）采用鸭病毒性肝炎病毒灭活疫苗对鸡只进行强化免疫：采用三次免疫程序，每次间隔10天，每只鸡每次疫苗用量为2ml，当抗体效价达到1：（128-256）时，进行高免蛋收集；

2）使用0.1-0.2%新洁尔灭对高免蛋进行消毒；

3）将2）中高免蛋的全蛋液进行乳化，乳化时间7-10min，然后加入pH为4.2-4.3的、温度为4-6℃的盐酸酸化水，盐酸酸化水的加入量为全蛋液体积的5.5-6.5倍，混匀后，降温至3-5℃，静置18-24小时；

4）取3）中的上层清液，升温到25-32℃，加入辛酸，搅拌1-2h，然后静置10-12h，过滤；其中辛酸体积量：上层清液体积量为（0.2-0.3）：（95-105）；

5）加入甲醛、硫柳汞、青链霉素，使卵黄抗体的全蛋水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞的体积比为（95-105）：（0.2-0.3）：（0.2-0.3）：（0.01-0.02），青链霉素的含量为800-1000单位/毫升口服液；

6）分装，保存。

步骤4）过滤时依次通过1.0mm、0.45mm、0.22mm的滤膜进行过滤。

本发明通过对高免蛋全蛋提取、低温酸化处理、辛酸处理后得到澄清卵黄抗体口服液。本发明将全蛋使用到卵黄抗体的提取中，可以直接在临床上进行口服使用，蛋清中含有大量的各类蛋白质，可充分利用高免蛋的价值，提高动物机体的免疫力和应激能力，生物利用度高，具有生物活性不受影响的优点。

具体实施方式

实施例1：

一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液的配方包括以下原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液95 L、辛酸0.2 L、甲醛0.3 L、硫柳汞0.02 L，以及1000单位/毫升口服液的青链霉素。

其制备方法包括以下步骤：

1）采用市售的鸭病毒性肝炎病毒灭活疫苗进行强化免疫，每只鸡每次疫苗用量为2ml，每次间隔10天，进行三次免疫程序，当抗体效价达到1：256时，开始收集高免蛋。

2）将收集高免蛋整理，0.2%新洁尔灭消毒，备用。

3）水稀释法酸化处理：将2）步高免蛋全蛋打入巴氏罐体内进行充分乳化，乳化时间7min，然后将乳化后的全蛋液加入pH为4.2、温度为4℃的盐酸酸化水，盐酸酸化水加入量为全蛋液体积的6倍，混匀，放置4℃环境中18小时静置沉淀，取上清液；盐酸酸化水是在水中加入盐酸使其PH值达到4.2。

4）辛酸处理；将步骤3）的上清液，即含卵黄抗体的全蛋水溶液进行称量，升温到25℃，加入辛酸，充分混匀1h，然后静置10h；其中，按体积比，上层清液：辛酸=95：0.2；

5）对步骤4）所得澄清液依次用1.0mm、0.45mm、0.22mm的滤膜过滤，留取滤液；

6）向步骤5)所得滤液加入甲醛、硫柳汞、青链霉素；按体积比，含卵黄抗体的全蛋全蛋水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞=95：0.2：0.3：0.02；青链霉素在该口服液中的含量为1000单位/毫升；

7）分装，保存。

为确定卵黄抗体口服液在常温下的放置有效期，做了以下试验：将本品保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散（AGP）法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表1。

表1.常温放置口服液不同时间段效价的变化

结果显示：卵黄抗体在常温的保存下可以存放16个月。

质量标准：

[性状]本品为淡黄色液体。

[无菌检验] 按《中国兽药典》进行，无菌生长。

[支原体检验] 按《中国兽药典》进行，无支原体生长。

[外源病毒检验] 按《中国兽药典》进行，符合规定。

[安全检验] 用7日龄雏鸭5只，各口服5羽份，观察2周，应全部健活。

[效力检验] 

1）保护力检测：用7日龄雏鸭30只，其中10只，每只口服2羽份卵黄抗体，另20只对照隔离饲养。24h，取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DPV稀释后病毒液，记录96h死亡情况，试验组的保护率在95%以上，攻毒对照组死亡率在95%以上，空白对照组雏鸭无任何变化。

2）治愈力测定：用7日龄雏鸭120只，40只作阴性对照，80只点眼接种DPV稀释的病毒液，感染12h后，其中40只，每只口服本品2羽份，每日1次，连续3日，另40只做阳性对照，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情况，攻毒阳性对照组死亡率在90%以上，治疗组存活率在93%以上，健康阴性对照组40只无任何变化。

实施例2：

一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液的配方包括以下原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液105 L、辛酸0.2 L、甲醛0.2 L、硫柳汞0.01 L，以及800单位/毫升口服液的青链霉素。

其制备方法包括以下步骤：

1）采用市售的鸭病毒性肝炎病毒灭活疫苗进行强化免疫，每只鸡每次疫苗用量为2ml，每次间隔10天，进行三次免疫程序，当抗体效价达到1：128时，开始收集高免蛋。

2）将收集高免蛋整理，0.1%新洁尔灭消毒，备用。

3）水稀释法酸化处理：将2）步高免蛋全蛋打入巴氏罐体内进行充分乳化，乳化时间10min，然后将乳化后的全蛋液加入pH为4.3、温度为6℃的盐酸酸化水，盐酸酸化水加入量为全蛋液体积的5.5倍，混匀，放置3℃环境中24小时静置沉淀，取上清液；盐酸酸化水是在水中加入盐酸使其PH值达到4.3。

4）辛酸处理；将步骤3）的上清液，即含卵黄抗体的全蛋水溶液进行称量，升温到32℃，加入辛酸，充分混匀2h，然后静置12h；其中，按体积比，上层清液：辛酸=105：0.2；

5）对步骤4）所得澄清液依次用1.0mm、0.45mm、0.22mm的滤膜过滤，留取滤液；

6）向步骤5)所得滤液加入甲醛、硫柳汞、青链霉素；按体积比，含卵黄抗体的全蛋全蛋水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞=105：0.2：0.2：0.01；青链霉素在该口服液中的含量为800单位/毫升；

7）分装，保存。

为确定卵黄抗体口服液在常温下的放置有效期，做了以下试验：将本品保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散（AGP）法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表1。结果见表2。

表2.常温放置注射液不同时间段效价的变化

结果显示：卵黄抗体在常温的保存下可以存放16个月。

质量标准：

[性状]本品为淡黄色液体。

[无菌检验] 按《中国兽药典》进行，无菌生长。

[支原体检验] 按《中国兽药典》进行，无支原体生长。

[外源病毒检验] 按《中国兽药典》进行，符合规定。

[安全检验] 用7日龄雏鸭5只，各口服5羽份，观察2周，应全部健活。

[效力检验] 

1）保护力检测：用7日龄雏鸭30只，其中10只，每只口服2羽份卵黄抗体，另20只对照隔离饲养。24h，取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DPV稀释后病毒液，记录96h死亡情况，试验组的保护率在95%以上，攻毒对照组死亡率在92%以上，空白对照组雏鸭无任何变化。

2）治愈力测定：用7日龄雏鸭120只，40只作阴性对照，80只点眼接种DPV稀释的病毒液，感染12h后，其中40只，每只口服本品2羽份，每日1次，连续3日，另40只做阳性对照，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情况，攻毒阳性对照组死亡率在90%以上，治疗组存活率在95%以上，健康阴性对照组40只无任何变化。

实施例3：

一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液的配方包括以下原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液100 L、辛酸0.3 L、甲醛0.3 L、硫柳汞0.02 L，以及1000单位/毫升口服液的青链霉素。

其制备方法包括以下步骤：

1）采用市售的鸭病毒性肝炎病毒灭活疫苗进行强化免疫，每只鸡每次疫苗用量为2ml，每次间隔10天，进行三次免疫程序，当抗体效价达到1：256时，开始收集高免蛋。

2）将收集高免蛋整理，0.2%新洁尔灭消毒，备用。

3）水稀释法酸化处理：将2）步高免蛋全蛋打入巴氏罐体内进行充分乳化，乳化时间8min，然后将乳化后的全蛋液加入pH为4.3、温度为5℃的盐酸酸化水，盐酸酸化水加入量为全蛋液体积的6.5倍，混匀，放置5℃环境中20小时静置沉淀，取上清液；盐酸酸化水是在水中加入盐酸使其PH值达到4.3。

4）辛酸处理；将步骤3）的上清液，即含卵黄抗体的全蛋水溶液进行称量，升温到30℃，加入辛酸，充分混匀2h，然后静置11h；其中，按体积比，上层清液：辛酸=100：0.3；

5）对步骤4）所得澄清液依次用1.0mm、0.45mm、0.22mm的滤膜过滤，留取滤液；

6）向步骤5)所得滤液加入甲醛、硫柳汞、青链霉素；按体积比，含卵黄抗体的全蛋全蛋水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞=100：0.3：0.3：0.02；青链霉素在该口服液中的含量为1000单位/毫升；

7）分装，保存。

用7日龄雏鸭100只，第一组50只作本产品组，第二组50只作为市售卵黄抗体液射液产品组，隔离饲养，点眼接种DPV稀释的病毒液，表现出临床症状时，开始治疗，第一组每只口服本品2ml，每日1次，连续3日，第二组市售产品（精制鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，青岛宝依特，201410005）2 ml，每日1次，连续3日。治疗后72h，记录各组发病及治疗情况。表3。

表 3 实验情况

实施例4：

一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液的配方包括以下原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液103 L、辛酸0.3 L、甲醛0.2 L、硫柳汞0.01 L，以及1000单位/毫升口服液的青链霉素。

其制备方法包括以下步骤：

1）采用市售的鸭病毒性肝炎病毒灭活疫苗进行强化免疫，每只鸡每次疫苗用量为2ml，每次间隔10天，进行三次免疫程序，当抗体效价达到1：128时，开始收集高免蛋。

2）将收集高免蛋整理，0.1%新洁尔灭消毒，备用。

3）水稀释法酸化处理：将2）步高免蛋全蛋打入巴氏罐体内进行充分乳化，乳化时间9min，然后将乳化后的全蛋液加入pH为4.3、温度为6℃的盐酸酸化水，盐酸酸化水加入量为全蛋液体积的5.5倍，混匀，放置5℃环境中22小时静置沉淀，取上清液；盐酸酸化水是在水中加入盐酸使其PH值达到4.3。

4）辛酸处理；将步骤3）的上清液，即含卵黄抗体的全蛋水溶液进行称量，升温到28℃，加入辛酸，充分混匀2h，然后静置12h；其中，按体积比，上层清液：辛酸=103：0.3；

5）对步骤4）所得澄清液依次用1.0mm、0.45mm、0.22mm的滤膜过滤，留取滤液；

6）向步骤5)所得滤液加入甲醛、硫柳汞、青链霉素；按体积比，含卵黄抗体的全蛋全蛋水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞=103：0.3：0.2：0.01；青链霉素在该口服液中的含量为1000单位/毫升；

7）分装，保存。

实施例5：

一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液的配方包括以下原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液97 L、辛酸0.2 L、甲醛0.3 L、硫柳汞0.01 L，以及800单位/毫升口服液的青链霉素。

其制备方法包括以下步骤：

1）采用市售的鸭病毒性肝炎病毒灭活疫苗进行强化免疫，每只鸡每次疫苗用量为2ml，每次间隔10天，进行三次免疫程序，当抗体效价达到1：256时，开始收集高免蛋。

2）将收集高免蛋整理，0.2%新洁尔灭消毒，备用。

3）水稀释法酸化处理：将2）步高免蛋全蛋打入巴氏罐体内进行充分乳化，乳化时间10min，然后将乳化后的全蛋液加入pH为4.2、温度为4℃的盐酸酸化水，盐酸酸化水加入量为全蛋液体积的6倍，混匀，放置5℃环境中24小时静置沉淀，取上清液；盐酸酸化水是在水中加入盐酸使其PH值达到4.2。

4）辛酸处理；将步骤3）的上清液，即含卵黄抗体的全蛋水溶液进行称量，升温到30℃，加入辛酸，充分混匀2h，然后静置12h；其中，按体积比，上层清液：辛酸=97：0.2；

5）对步骤4）所得澄清液依次用1.0mm、0.45mm、0.22mm的滤膜过滤，留取滤液；

6）向步骤5)所得滤液加入甲醛、硫柳汞、青链霉素；按体积比，含卵黄抗体的全蛋全蛋水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞=97：0.2：0.3：0.01；青链霉素在该口服液中的含量为800单位/毫升；

7）分装，保存。

Claims (3)

1.一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液，其特征在于：包括以下按照体积比计算的原料：含卵黄抗体的全蛋水溶液95-105、辛酸0.2-0.3、甲醛0.2-0.3、硫柳汞0.01-0.02；还包括800-1000单位/毫升口服液的青链霉素。

2.一种如权利要求1所述鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液的制备方法，其特征在于具体步骤是：

1）采用鸭病毒性肝炎病毒灭活疫苗对鸡只进行强化免疫：采用三次免疫程序，每次间隔10天，每只鸡每次疫苗用量为2ml，当抗体效价达到1：（128-256）时，进行高免蛋收集；

2）使用0.1-0.2%新洁尔灭对高免蛋进行消毒；

3）将2）中高免蛋的全蛋液进行乳化，乳化时间7-10min，然后加入pH为4.2-4.3的、温度为4-6℃的盐酸酸化水，盐酸酸化水的加入量为全蛋液体积的5.5-6.5倍，混匀后，降温至3-5℃，静置18-24小时；

4）取3）中的上层清液，升温到25-32℃，加入辛酸，搅拌1-2h，然后静置10-12h，过滤；其中辛酸体积量：上层清液体积量为（0.2-0.3）：（95-105）；

5）加入甲醛、硫柳汞、青链霉素，使卵黄抗体的全蛋水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞的体积比为（95-105）：（0.2-0.3）：（0.2-0.3）：（0.01-0.02），青链霉素的含量为800-1000单位/毫升口服液；

6）分装，保存。

3. 根据权利要求2所述的鸭病毒性肝炎卵黄抗体口服液的制备方法，其特征在于：步骤4）过滤时依次通过1.0mm、0.45mm、0.22mm的滤膜进行过滤。