CN105368787A - 一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法 - Google Patents

Abstract

一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，属于兽用生物制品技术领域。其采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液。按本发明方法培养收获的病毒液提高了同胚培养的稳定性，大大降低了批次间差异，为后续疫苗生产工艺提供了优质的抗原液。

Description

一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法。

背景技术

新城疫和禽流感是当今全球范围内最流行的家禽传染病，也是我国所有鸡病中危害最大的两种疾病。二联疫苗的制备，可以一针防治两种传染病，同时可以解决使用多种疫苗分次免疫，造成的鸡群的其它的不良反应，简化免疫程序，降低投入的成本。当前国内生产的新城疫、禽流感二联灭活疫苗基本都是采用鸡胚接种病毒后进行增殖，收获尿囊液制备而成。传统的二联疫苗均由单一疫苗分别生产后混合在一起制成二联疫苗，该工艺费时费力，生产成本较高。同胚培养是近年来兽用生物制品行业提出的生产工艺，即将两种病毒以合适的比例混合后同时接种到鸡胚中进行增殖，该工艺减少了生产工艺环节，缩短的生产周期，减少人力物力投入，大大降低了生产成本。但是截至到目前为止同胚培养的工艺仍存在缺陷，特别是鸡新城疫、禽流感的同胚培养，培养过程中由于病毒之间的互相干扰，两种病毒的含量均不稳定，批次间差异较大，困扰着该品种的生产，严重影响了后期疫苗的品质。

氨基酸，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。维生素是维持机体生命活动必须的一类有机物质，也是保持机体健康的重要活性物质。维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。在体内硒和维生素E协同，能够保护细胞膜，防止不饱和脂肪酸的氧化。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。但是中药多糖的作用并不具有广谱性，同常某种或某几种多糖协同作用具有特异性的活性作用。

本发明基于上述技术背景，提出一种同胚培养的方法及其应用，具体是一种特别适用于鸡新城疫、禽流感病毒同胚培养的方法及其应用，解决了新城疫病毒、禽流感病毒同胚培养稳定性差、批次间差异大的培养难题，提高了两种病毒的稳定性、收获量和病毒滴度。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鸡新城疫、禽流感病毒同胚培养的方法的技术方案，通过该方法，可同时提高两种病毒的稳定性、收获量和病毒滴度。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液为每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合2～4g、维生素组合3～6g、亚硒酸钠0～10mg和复方中药多糖20～50g；

所述的氨基酸组合包括天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺；

所述的维生素组合包括维生素B1、维生素B3和维生素B7；

所述的复方中药多糖由海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参提取得到。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于该稀释液的pH为7.0～7.2。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中得到。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的氨基酸组合中含有：天冬氨酸20～50%、脯氨酸20～40%和谷氨酰胺10～60%，优选为天冬氨酸30～40%、脯氨酸25～35%和谷氨酰胺30～40%。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的维生素组合中含有：维生素B115～35%、维生素B320～50%和维生素B720～50%，优选为维生素B120～30%、维生素B330～40%和维生素B735～45%。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的复方中药多糖按以下步骤制得：

a、按海藻20～40份、地肤子5～20份、桑叶10～30份、牵牛子5～20份和丹参10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。

所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液通过以下步骤制得：

1）磷酸缓冲溶液的配制：按比例称取氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、含6个结晶水的氯化镁溶于双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用；

2）复方中药多糖的制备

a、按比例称取海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉；

3）接种鸡胚用病毒稀释液配制：按比例称取氨基酸组合、维生素组合、复方中药多糖和亚硒酸钠，溶解于步骤1）制得的磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至6.6～7.0之间，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用。

本发明具有积极有益的效果：

（1）本发明所制备的稀释液，可接种低日龄鸡胚，因低日龄鸡胚组织分化程度较低，与现有技术相比，病毒更易在鸡胚组织中增殖。

（2）本发明所制备的稀释液接种鸡胚后，可提高鸡胚耐受病毒的能力，延长死亡时间，即延长了病毒增殖时间，与现有技术相比提高了病毒滴度2～8倍。

（3）按本发明方法培养收获的病毒液提高了同胚培养的稳定性，大大降低了批次间差异，为后续疫苗生产工艺提供了优质的抗原液。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有：氨基酸组合3g（其中天冬氨酸0.9g、脯氨酸0.9g、谷氨酰胺1.2g）、维生素组合5g（其中维生素B11.5g、维生素B31.75g、维生素B71.75g）、复方中药多糖40g、亚硒酸钠4mg，该稀释液pH为7.0。

一种鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液的制备方法，其步骤是：

（1）磷酸缓冲溶液的配制：按上述磷酸盐缓冲液配方准确称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钙0.1g，含6个结晶水的氯化镁0.1g溶于1000ml双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用。

（2）复方中药多糖的制备

a、按比例称取所述中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次。

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清。

c、采用公知的醇沉法，将b中上清进行醇沉，沉淀为粗制中药多糖。

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清。

e、采用公知的真空减压浓缩法，将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液。

f、采用公知的真空冷冻干燥法，将e中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。

（3）接种鸡胚用病毒稀释液配制：按上述优选稀释液组分数准确称取天冬氨酸0.9g、脯氨酸0.9g、谷氨酰胺1.2g、维生素B11.5g、维生素B31.75g、维生素B71.75g、复方中药多糖40g，亚硒酸钠4mg，按比例溶解于步骤（1）中的1000ml磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至7.0，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用。

实施例2

一种鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液（由氯化钠10g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钠1.2g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.2g溶于1000ml双蒸水中得到）中含有:氨基酸组合4g（其中天冬氨酸2g、脯氨酸0.8g、谷氨酰胺1.2g）、维生素组合6g（其中维生素B12.1g、维生素B31.2g、维生素B72.7g）、复方中药多糖50g（由海藻20份、地肤子5份、桑叶10份、牵牛子5份和丹参10份提取得到）、亚硒酸钠2mg，该稀释液pH为7.0。

一种鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。

实施例3

一种鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液（由氯化钠6g，氯化钾0.05g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钾0.05g，氯化钙0.05g，含6个结晶水的氯化镁0.05g溶于1000ml双蒸水中得到）中含有:氨基酸组合2g（其中天冬氨酸0.4g、脯氨酸0.8g、谷氨酰胺0.8g）、维生素组合3g（其中维生素B10.45g、维生素B31.5g、维生素B71.05g）、复方中药多糖20g（海藻40份、地肤子20份、桑叶30份、牵牛子20份和丹参30份）、亚硒酸钠10mg，该稀释液pH为7.2。

一种鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。

实施例4：一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液。

实施例5：一种鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液的使用方法

1）鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液及其配制，方法同实施例1。

2）接种毒液的配制

（1）开启种毒分别取鸡新城疫种毒和鸡禽流感种毒，无菌条件下开启种毒。

（2）恢复原量用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液将鸡新城疫种毒和禽流感种毒恢复至原量。

（3）稀释种毒用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液将鸡新城疫毒种稀释至5000倍，禽流感种毒稀释至80000倍。

（4）孵育将稀释后毒液分别置于4℃孵育40分钟，备用。

（5）混合将孵育后的鸡新城疫毒液和禽流感毒液按1:1（V:V）比例混合均匀。

2）接种与培养繁殖

（1）接种鸡胚的选择

选择发育良好的10日龄SPF鸡胚，1000枚。

（2）接种

取混合后病毒液，每胚尿囊腔内接种0.1ml。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

（3）孵育和观察

鸡胚接种后，每日照蛋一次，将在60小时前死亡的鸡胚弃去。60小时后，每4～8小时照蛋一次，死亡鸡胚随时取出，直至120小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。

（4）收获

将冷却4～24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（勿使卵黄破裂），吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组。收获后的胚液置于灭菌容器中，加入适宜的抗生素，在2～8℃冰库处理。留样后，结冻保存。在收获胚液的同时，逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。

（5）病毒悬液检验

无菌检验：经处理过的胚液，每组分别取样，按《无菌检验或纯粹检验操作规程》进行无菌检验，应无细菌生长。

病毒含量测定：按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作10倍系列稀释至10^-4，分别取1ml于2只灭菌试管中，第一只管加入等量鸡新城疫阳性血清，第二只加入等量禽流感阳性血清，室温中和1小时（中间摇1次），第一管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:16者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应不低于10⁷EID₅₀。第二管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:160（微量法1:128）者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应不低于10⁸EID₅₀。

比较例1：采用上述稀释液稀释病毒接种鸡胚与常用稀释液稀释病毒接种鸡胚各项指标的比较。

1）本发明鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液配制，方法同实施例1。

2）常用病毒稀释液及其配制，即生理盐水，按常规技术进行配制。

3）鸡胚接种与培养繁殖

（1）接种鸡胚的选择：选择发育良好的10日龄SPF鸡胚，2000枚；

（2）接种：将2000枚10日龄SPF鸡胚分为2组，第一组采用本发明病毒稀释液按实施例4进行操作接种，第二组采用常规技术配制的病毒稀释液进行病毒稀释和接种，两组稀释倍数相同，接种方法同实施例4。

（3）孵育和观察、收获、病毒悬液检验，其方法均同实施例4。

4）两组方法接种鸡胚后死亡集中时间与数量，见表1。

第一组：为本发明组，采用10日龄鸡胚接种。

第二组：为常规技术稀释液组，采用10日龄鸡胚接种。

5）两组方法接种鸡胚后病毒收获量及其病毒含量，见表2。

比较例2：采用上述稀释液稀释病毒接种鸡胚与常用稀释液稀释病毒接种鸡胚批次间稳定性比较。

按比较例1方法连续进行三批鸡新城疫、禽流感病毒的同胚培养实验，实验结果见表3。

综上所述，与传统技术相比，采用本发明方法可提高病毒含量5～50倍，同时还提高了鸡胚液收获量20%～30%，更重要的是本发明方法所生产的鸡新城疫、禽流感病毒同胚培养物稳定性极高，批次间几乎无差异，解决了同胚培养稳定性差的难题。

实施例2-3中得到的稀释液进行比较例1、比较例2相同的试验，其最终结果也能够达到与比较例1相同的技术效果，可提高病毒含量5～50倍，同时还提高了鸡胚液收获量20%～30%。

Claims (8)

1.一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液。

2.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液为每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合2～4g、维生素组合3～6g、亚硒酸钠0～10mg和复方中药多糖20～50g；

所述的氨基酸组合包括天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺；

所述的维生素组合包括维生素B1、维生素B3和维生素B7；

所述的复方中药多糖由海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参提取得到。

3.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于该稀释液的pH为7.0～7.2。

4.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中得到。

5.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的氨基酸组合中含有：天冬氨酸20～50%、脯氨酸20～40%和谷氨酰胺10～60%，优选为天冬氨酸30～40%、脯氨酸25～35%和谷氨酰胺30～40%。

6.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的维生素组合中含有：维生素B115～35%、维生素B320～50%和维生素B720～50%，优选为维生素B120～30%、维生素B330～40%和维生素B735～45%。

7.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的复方中药多糖按以下步骤制得：

a、按海藻20～40份、地肤子5～20份、桑叶10～30份、牵牛子5～20份和丹参10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。

8.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液通过以下步骤制得：

1）磷酸缓冲溶液的配制：按比例称取氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、含6个结晶水的氯化镁溶于双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用；

2）复方中药多糖的制备

a、按比例称取海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉；

3）接种鸡胚用病毒稀释液配制：按比例称取氨基酸组合、维生素组合、复方中药多糖和亚硒酸钠，溶解于步骤1）制得的磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至6.6～7.0之间，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用。