CN105833264A - 鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备 - Google Patents

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1）鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感病毒共存种毒的制备，2）抗原的制备，3）抗原离心，4）抗原灭活，5）乳化，最终得到成品三联疫苗。本发明通过优化病毒培养工艺，减少了鸡胚使用量，降低生产成本，提高了劳动效率，提高了三种病毒抗原效价，成品抗原不需浓缩，提高了疫苗稳定性与使用效果。

Description

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备
技术领域
本发明涉及一种禽类灭活疫苗的制备方法，尤其涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法。
背景技术
现有的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法有以下几个步聚：鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三种病毒抗原的制备，抗原的浓缩灭活、成品乳化。现有方法主要存在以下几点缺陷：
1、三种抗原的制备方法是使用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三种种毒分按一定稀释倍数稀释后分别接种到鸡胚中，放置37℃中培养一定时间，然后收取各自时间段的死胚或活胚胚液作为各自抗原。该方法，生产三种抗原需要三份的鸡胚，鸡胚用量大，成本高，而且所花费的人力多，时间长，灭活前的抗原需要浓缩后才能使用，生产成本高。
2、部分二联苗采用两种病毒种毒按一定的稀释比例稀释后同时接种至同一鸡胚中培养，收取鸡胚液，鸡胚液中含有两种抗原，这样虽然用蛋量减少一半，但由于两种病毒临时混合在同一鸡胚中繁殖，会相互干扰，病毒繁殖受影响，收获的鸡胚液病毒效价较低，这种抗原用于乳化二联苗需要对抗原进行较高倍数的浓缩后才能使用，生产成本也较高。
3、乳化：直接将灭活后抗原水相与油相按一定比例混合进行乳化，未采取措施控制水相的酸碱度、水相与油相的温度以及乳化过程中的疫苗温度，成品放置2-8℃时不稳定，时间长时会出现分层现象，保存期较短。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种优化病毒的培养工艺，减少鸡胚使用量，降低生产成本，提高抗原的效价，提高成品疫苗的稳定性以及免疫效果的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感病毒共存种毒的制备：
取符合要求的鸡新城疫种毒、传染性支气管炎种毒、禽流感病毒种毒，这三种种毒分别稀释10000-50000倍，然后将三种稀释后的种毒等量混合接种10-11日龄SPF鸡胚，将接种后的鸡胚置37℃培养48-72小时，培养期间，培养至48小时开始每4-8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及时取出并置于2-8℃冷藏12-24小时，收获死胚胚液，将收获的死胚胚液冷冻7-10天后作为生产抗原用的种毒，即共存病毒种毒；
2)抗原的制备
将共存病毒种毒稀释5000-20000倍，接种10-11日龄鸡胚，置36℃培养48小时，48小时后将温度升至37.5℃继续培养至72小时，48-72小时之间每4-8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及72小时的活胚及时取出并置2-8℃冷藏12-24小时，收获48-72小时的死胚胚液以及培养至72小时的活胚胚液，得到抗原，将抗原置于2-8℃保存，保存时间不超过72小时；如果保存时间超过72小时，抗原效价下降比较明显；
3)抗原离心：将收获的抗原混合于移动罐中，通过管道与连续离心机连接，开启连续离心机离心，去除抗原中的杂质，离心后的抗原用于灭活；
4)抗原的灭活：将上述离心后的抗原置于灭活罐内，吸出数毫升备测毒价，其余抗原加入浓度为10％的甲醛溶液，边加边摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，然后开启灭活罐搅拌器及水箱循环水开始灭活，当灭活罐内液体温度达到37℃时灭活16-20小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，灭活完成后将灭活抗原置2～8℃保存，保存时间不超过30日，否则会影响疫苗的免疫效果；
5)乳化：
制备水相：将灭活后的抗原加入抗原体积4％的吐温，混合均匀作为水相，将水相通过温控系统升温至26-28℃，然后使用酸碱调整水相pH值至6.9-7.1之间；
制备油相：取白油94份，司本-80 6份，混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明，灭菌，得到油相，将灭菌后的油相通过温控系统调节温度至26-28℃；
混合乳化：将油相与水相按体积比2.5-3：1混合，在26-28℃进行乳化，得到鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗。
所述步骤1)，三种种毒稀释前的病毒效价分别为：新城疫种毒病毒效价≥108.9EID50/0.1ml，传染性支气管炎种毒病毒效价≥106.9EID50/0.1ml，禽流感种毒病毒效价≥108.1EID50/0.1ml。
所述步骤5)油相的灭菌操作为121℃灭菌30min。
所述步骤5)混合乳化的具体步骤如下：将油相导入乳化罐内，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，然后缓慢加入水相，再以3000-3500r/min的转速乳化30-60min，乳化时通过温控系统将乳化罐内的温度控制在26-28℃进行乳化。乳化后，取样lOml于离心管内，以3000转/分钟离心15分钟，不应有分层现象。
本发明采用以上技术方案，改进鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗抗原的制备方法，培养新城疫、传染性支气管炎、禽流感共存病毒作为种毒，将三种共存病毒种毒接种入鸡胚，调整培养工艺，在同一鸡胚中繁殖三种病毒抗原，并改进乳化工艺环节(如水相pH值、水相与油相的温度及乳化过程的温度等)，最终得到成品三联灭活疫苗。
现有技术生产二联、三联疫苗，生产抗原时将两种种毒按一定比例简单混合后接种鸡胚生产抗原，该方法由于两种种毒病毒混合在一起时会相互影响，产生拮抗作用，接种鸡胚生产的抗原效价低，而本发明方法是先将三种规定效价的种毒按一定的稀释倍数稀释后等量混合，接种鸡胚，收获规定时间的死胚胚液，进行冷冻后，让三种病毒在一起适应共存后当作种毒，再接种鸡胚，三种病毒就能够在鸡胚中繁殖，而不会相互影响，因此，本发明方法生产的抗原效价高。
本发明通过优化病毒培养工艺，减少了鸡胚使用量，降低生产成本，提高了劳动效率，提高了三种病毒抗原效价，成品抗原不需浓缩，提高了疫苗稳定性与使用效果。
具体实施方式
一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感病毒共存种毒的制备：
取鸡新城疫种毒、传染性支气管炎种毒、禽流感病毒种毒，其中，新城疫种毒病毒效价≥108.9EID50/0.1ml，传染性支气管炎种毒病毒效价≥106.9EID50/0.1ml，禽流感种毒病毒效价≥108.1EID50/0.1ml；
将这三种种毒分别稀释10000-50000倍，然后将三种稀释后的种毒等量混合接种10-11日龄SPF鸡胚，将接种后的鸡胚置37℃培养48-72小时，培养期间，培养至48小时开始每4-8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及时取出并置于2-8℃冷藏12-24小时，收获死胚胚液，将收获的死胚胚液冷冻7-10天后作为生产抗原用的种毒，即共存病毒种毒；
2)抗原的制备
将共存病毒种毒稀释5000-20000倍，接种10-11日龄鸡胚，置36℃培养48小时，48小时后将温度升至37.5℃继续培养至72小时，48-72小时之间每4-8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及72小时的活胚及时取出并置2-8℃冷藏12-24小时，收获48-72小时的死胚胚液以及培养至72小时的活胚胚液，得到抗原，将抗原置于2-8℃保存，保存时间不超过72小时；
3)抗原离心：将收获的抗原混合于移动罐中，通过管道与连续离心机连接，开启连续离心机离心，去除抗原中的杂质，离心后的抗原用于灭活；
4)抗原的灭活：将上述离心后的抗原置于灭活罐内，吸出数毫升备测毒价，其余抗原加入浓度为10％的甲醛溶液，边加边摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，然后开启灭活罐搅拌器及水箱循环水开始灭活，当灭活罐内液体温度达到37℃时灭活16-20小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，灭活完成后将灭活抗原置2～8℃保存，保存时间不超过30日；
5)乳化：
制备水相：将灭活后的抗原加入抗原体积4％的吐温，混合均匀作为水相，将水相通过温控系统升温至26-28℃，然后使用酸碱调整水相pH值至6.9-7.1之间；
制备油相：取白油94份，司本-80 6份，混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明，然后121℃灭菌30min，得到油相，将灭菌后的油相通过温控系统调节温度至26-28℃；
混合乳化：将油相导入乳化罐内，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，然后缓慢加入水相，再以3000-3500r/min的转速乳化30-60min，其中油相与水相的体积比为2.5-3：1，乳化时通过温控系统将乳化罐内的温度控制在26-28℃进行乳化，得到鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗。
乳化后，取样lOml于离心管内，以3000转/分钟离心15分钟，不应有分层现象。
实施例1
一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感病毒共存种毒的制备：
取鸡新城疫种毒、传染性支气管炎种毒、禽流感病毒种毒，其中，新城疫种毒病毒效价≥108.9EID50/0.1ml，传染性支气管炎种毒病毒效价≥106.9EID50/0.1ml，禽流感种毒病毒效价≥108.1EID50/0.1ml；
将鸡新城疫种毒稀释10000倍，传染性支气管炎种毒稀释30000倍，禽流感病毒种毒稀释50000倍，然后将这三种稀释后的种毒等量混合接种10-11日龄龄SPF鸡胚，将接种后的鸡胚置37℃培养72小时，培养期间，培养至48小时开始每8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及时取出并置于2℃冷藏12小时，收获死胚胚液，将收获的死胚胚液冷冻7天后作为生产抗原用的种毒，即共存病毒种毒；
2)抗原的制备
将共存病毒种毒稀释5000倍，接种10-11日龄鸡胚，置36℃培养48小时，48小时后将温度升至37.5℃继续培养至72小时，48-72小时之间每8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及72小时的活胚及时取出并置2℃冷藏12小时，收获48-72小时的死胚胚液以及培养至72小时的活胚胚液，得到抗原，将抗原置于2℃保存，保存时间不超过72小时；
3)抗原离心：将收获的抗原混合于移动罐中，通过管道与连续离心机连接，开启连续离心机离心，去除抗原中的杂质，离心后的抗原用于灭活；
4)抗原的灭活：将上述离心后的抗原置于灭活罐内，吸出数毫升备测毒价，其余抗原加入浓度为10％的甲醛溶液，边加边摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，然后开启灭活罐搅拌器及水箱循环水开始灭活，当灭活罐内液体温度达到37℃时灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，灭活完成后将灭活抗原置2℃保存，保存时间不超过30日；
5)乳化：
制备水相：将灭活后的抗原加入抗原体积4％的吐温，混合均匀作为水相，将水相通过温控系统升温至26℃，然后使用酸碱调整水相pH值至6.9；
制备油相：取白油94份，司本-80 6份，混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明，然后121℃灭菌30min，得到油相，将灭菌后的油相通过温控系统调节温度至26℃；
混合乳化：将油相导入乳化罐内，以500r/min的转速搅拌10min，然后缓慢加入水相，再以3000r/min的转速乳化30min，其中油相与水相的体积比为2.5：1，乳化时通过温控系统将乳化罐内的温度控制在26℃进行乳化，得到鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗。
乳化后，取样lOml于离心管内，以3000转/分钟离心15分钟，不应有分层现象。
采用本发明方法制备鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗，减少了生产用原材料(鸡胚用量节约四分之三)，缩短了生产周期，提高了生产效率，抗原不需浓缩，大大降低生产成本，具体见表1。其中，旧方法是指三种抗原的制备方法是使用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三种种毒分按一定稀释倍数稀释后分别接种到鸡胚中，放置37℃中培养一定时间，然后收取各自时间段的死胚或活胚胚液作为各自抗原。
表1
本实施例制备的三联疫苗与现有技术方法制备的三联疫苗性能对比如表2所示。
表2
由表2可知，采用本发明方法制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗，其稳定性好，可以延长保存期，疫苗的免疫效果好。
实施例2
一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感病毒共存种毒的制备：
取鸡新城疫种毒、传染性支气管炎种毒、禽流感病毒种毒，其中，新城疫种毒病毒效价≥108.9EID50/0.1ml，传染性支气管炎种毒病毒效价≥106.9EID50/0.1ml，禽流感种毒病毒效价≥108.1EID50/0.1ml；
将鸡新城疫种毒稀释30000倍，传染性支气管炎种毒稀释50000倍，禽流感病毒种毒稀释10000倍，然后将这三种稀释后的种毒等量混合接种10-11日龄SPF鸡胚，将接种后的鸡胚置37℃培养60小时，培养期间，培养至48小时开始每6小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及时取出并置于8℃冷藏24小时，收获死胚胚液，将收获的死胚胚液冷冻7天后作为生产抗原用的种毒，即共存病毒种毒；
2)抗原的制备
将共存病毒种毒稀释20000倍稀释，接种10-11日龄鸡胚，置36℃培养48小时，48小时后将温度升至37.5℃继续培养至72小时，48-72小时之间每6小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的死鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及72小时的活胚及时取出并置8℃冷藏24小时，收获48-72小时的死胚胚液以及培养至72小时的活胚胚液，得到抗原，将抗原置于8℃保存，保存时间不超过72小时；
3)抗原离心：将收获的抗原混合于移动罐中，通过管道与连续离心机连接，开启连续离心机离心，去除抗原中的杂质，离心后的抗原用于灭活；
4)抗原的灭活：将上述离心后的抗原置于灭活罐内，吸出数毫升备测毒价，其余抗原加入浓度为10％的甲醛溶液，边加边摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，然后开启灭活罐搅拌器及水箱循环水开始灭活，当灭活罐内液体温度达到37℃时灭活20小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，灭活完成后将灭活抗原置8℃保存，保存时间不超过30日；
5)乳化：
制备水相：将灭活后的抗原加入抗原体积4％的吐温，混合均匀作为水相，将水相通过温控系统升温至28℃，然后使用酸碱调整水相pH值至7.1；
制备油相：取白油94份，司本-80 6份，混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明，然后121℃灭菌30min，得到油相，将灭菌后的油相通过温控系统调节温度至28℃；
混合乳化：将油相导入乳化罐内，以800r/min的转速搅拌15min，然后缓慢加入水相，再以3500r/min的转速乳化60min，其中油相与水相的体积比为3：1，乳化时通过温控系统将乳化罐内的温度控制在28℃进行乳化，得到鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗。
乳化后，取样lOml于离心管内，以3000转/分钟离心15分钟，不应有分层现象。
本实施例制备的三联疫苗与现有技术方法制备的三联疫苗性能对比如表3所示。其中，旧方法是指三种抗原的制备方法是使用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三种种毒分按一定稀释倍数稀释后分别接种到鸡胚中，放置37℃中培养一定时间，然后收取各自时间段的死胚或活胚胚液作为各自抗原。
表3
由表3可知，采用本发明方法制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗，其稳定性好，可以延长保存期，疫苗的免疫效果好。
实施例3
一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感病毒共存种毒的制备：
取鸡新城疫种毒、传染性支气管炎种毒、禽流感病毒种毒，其中，新城疫种毒病毒效价≥108.9EID50/0.1ml，传染性支气管炎种毒病毒效价≥106.9EID50/0.1ml，禽流感种毒病毒效价≥108.1EID50/0.1ml；
将鸡新城疫种毒稀释50000倍，传染性支气管炎种毒稀释10000倍，禽流感病毒种毒稀释30000倍，然后将这三种稀释后的种毒等量混合接种10-11日龄SPF鸡胚，将接种后的鸡胚置37℃培养72小时，培养期间，培养至48小时开始每4小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及时取出并置于5℃冷藏18小时，收获死胚胚液，将收获的死胚胚液冷冻7天后作为生产抗原用的种毒，即共存病毒种毒；
2)抗原的制备
将共存病毒种毒稀释10000倍稀释，接种10-11日龄鸡胚，置36℃培养48小时，48小时后将温度升至37.5℃继续培养至72小时，48-72小时之间每4小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及72小的活胚及时取出并置5℃冷藏18小时，收获48-72小时的死胚胚液以及培养至72小时的活胚胚液，得到抗原，将抗原置于5℃保存，保存时间不超过72小时；
3)抗原离心：将收获的抗原混合于移动罐中，通过管道与连续离心机连接，开启连续离心机离心，去除抗原中的杂质，离心后的抗原用于灭活；
4)抗原的灭活：将上述离心后的抗原置于灭活罐内，吸出数毫升备测毒价，其余抗原加入浓度为10％的甲醛溶液，边加边摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，然后开启灭活罐搅拌器及水箱循环水开始灭活，当灭活罐内液体温度达到37℃时灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，灭活完成后将灭活抗原置5℃保存，保存时间不超过30日；
5)乳化：
制备水相：将灭活后的抗原加入抗原体积4％的吐温，混合均匀作为水相，将水相通过温控系统升温至27℃，然后使用酸碱调整水相pH值至7.0；
制备油相：取白油94份，司本-80 6份，混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明，然后121℃灭菌30min，得到油相，将灭菌后的油相通过温控系统调节温度至27℃；
混合乳化：将油相导入乳化罐内，以600r/min的转速搅拌10min，然后缓慢加入水相，再以3000r/min的转速乳化45min，其中油相与水相的体积比为2.8：1，乳化时通过温控系统将乳化罐内的温度控制在27℃进行乳化，得到鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗。
乳化后，取样lOml于离心管内，以3000转/分钟离心15分钟，不应有分层现象。
本实施例制备的三联疫苗与现有技术方法制备的三联疫苗性能对比如表4所示。其中，旧方法是指三种抗原的制备方法是使用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三种种毒分按一定稀释倍数稀释后分别接种到鸡胚中，放置37℃中培养一定时间，然后收取各自时间段的死胚或活胚胚液作为各自抗原。
表4
由表4可知，采用本发明方法制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗，其稳定性好，可以延长保存期，疫苗的免疫效果好。

Claims (6)

1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1)鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感病毒共存种毒的制备：
取符合要求的鸡新城疫种毒、传染性支气管炎种毒、禽流感病毒种毒，将这三种种毒分别稀释10000-50000倍，然后将三种稀释后的种毒等量混合接种10-11日龄SPF鸡胚，将接种后的鸡胚置37℃培养48-72小时，培养期间，培养至48小时开始每4-8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及时取出并置于2-8℃冷藏12-24小时，收获死胚胚液，将收获的死胚胚液冷冻7-10天后作为生产抗原用的种毒，即共存病毒种毒；
2)抗原的制备
将共存病毒种毒稀释5000-20000倍，接种10-11日龄鸡胚，置36℃培养48小时，48小时后将温度升至37.5℃继续培养至72小时，48-72小时之间每4-8小时照蛋一次，弃去48小时前死亡的鸡胚，将48小时后死亡的鸡胚及72小时的活胚及时取出并置2-8℃冷藏12-24小时，收获48-72小时的死胚胚液以及培养至72小时的活胚胚液，得到抗原，将抗原置于2-8℃保存；
3)抗原离心：将收获的抗原混合于移动罐中，经过连续离心机离心，去除抗原中的杂质；
4)抗原的灭活：将上述离心后的抗原置于灭活罐内，加入浓度为10%的甲醛溶液，混合均匀，甲醛溶液的最终浓度为0.1%，然后开启灭活罐搅拌器及水箱循环水开始灭活，当灭活罐内液体温度达到37℃时，灭活16-20小时，灭活完成后将抗原置于2～8℃保存；
5)乳化：
制备水相：将灭活后的抗原加入抗原体积4%的吐温，混合均匀作为水相，将水相通过温控系统升温至26-28℃，然后使用酸碱调整水相pH值至6.9-7.1之间；
制备油相：取白油94份，司本-80 6份，混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明，灭菌，得到油相，将灭菌后的油相通过温控系统调节温度至26-28℃；
混合乳化：将油相与水相按体积比2.5-3：1混合，在26-28℃进行乳化，得到鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤1），三种种毒稀释前的病毒效价分别为：新城疫种毒病毒效价≥108.9EID50/0.1ml，传染性支气管炎种毒病毒效价≥106.9EID50/0.1ml，禽流感种毒病毒效价≥108.1EID50/0.1ml。
3.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤2）制备得到的抗原置于2-8℃保存的时间不超过72小时。
4.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤4）灭活后的抗原置于2～8℃保存的时间不超过30日。
5.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤5）油相的灭菌操作为121℃灭菌30分钟。
6.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤5）混合乳化的具体步骤如下：将油相导入乳化罐内，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，然后缓慢加入水相，再以3000-3500r/min的转速乳化30-60min。
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