CN111303252A - 一种规模化生产胚毒类抗原的净化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种规模化生产的胚毒类抗原的纯化方法，能够对灭活抗原液中残存的变性杂蛋白进行彻底清除，进一步提高疫苗的安全性。本发明的方法，首先将胚毒类灭活抗原由甲醛灭活时的温度进行降温操作；再将降温的灭活抗原进行静置，然后将静置后的灭活抗原以13000g～16000g离心力高速离心，获得的上清液为纯化的胚毒类抗原。本发明的方法使残存的杂蛋白先通过变温致杂蛋白变性析出，再借助离心的方法，去除杂蛋白的同时，保持目的抗原的完整结构。

Description

一种规模化生产胚毒类抗原的净化方法
技术领域
本发明属于疫苗抗原制备技术领域，具体涉及一种规模化生产的胚毒类抗原的净化方法，即一种针对规模化生产条件下，经过甲醛灭活的胚毒类抗原的纯化方法。
技术背景
针对目前规模化生产条件下，包括禽流感病毒在类的胚毒类抗原在甲醛灭活前虽然经过现有的离心、浓缩纯化工序，以去除部分杂质，但抗原液经过甲醛灭活后，残存的杂蛋白发生结构改变，造成变性。
在现有疫苗制备领域，有些疫苗制备过程中，在甲醛灭活后会直接进入后续油乳剂灭活疫苗配苗乳化环节；也有少数生产过程中会利用过滤的原理，采用不锈钢网在有压力的前提下对灭活抗原进行过滤。
但经过研究和实践发现，上述简单的过滤方法无法彻底去除变性的杂蛋白。因为灭活后杂蛋白性状发生变化，在有压力的情况下会分解成小颗粒物质，以逃避不锈钢网的截留，制成的疫苗会随着储存时间的延长，杂蛋白依然会出现聚集现象，严重影响疫苗的外观品质，给用药动物造成巨大的应激反应的同时，会降低目的抗原的免疫效果。
发明内容
本发明针对现有的工艺无法彻底解决灭活后抗原液中残存的变性杂蛋白问题，提供了一种规模化生产的胚毒类抗原的纯化方法，能够对灭活抗原液中残存的变性杂蛋白进行彻底清除，进一步提高疫苗的安全性。
本发明所提供的规模化生产的胚毒类抗原的纯化方法，包括如下的步骤：
S1：将胚毒类灭活抗原由甲醛灭活时的温度进行降温操作；
所述的甲醛灭活时的温度，为36～37℃；
所述的降温操作，是将灭活抗原的温度降至2～15℃；
作为优选，是在在1小时内时间内降温至2～15℃；
S2：将降温的灭活抗原进行静置，静置的时间为7～14d；
所述的静置温度为2～15℃；
S3：将静置后的灭活抗原以13000g～16000g离心力高速离心，获得的上清液为纯化的胚毒类抗原；
所述的离心，优选为借助碟片式高速离心机。
其中胚毒类抗原，包含有鸡新城疫抗原、禽流感抗原、传染性支气管炎抗原、鸡减蛋综合征抗原等。
本发明的方法具有如下的优点：
1、从蛋白质学角度，使残存的杂蛋白先通过变温致杂蛋白变性析出，再借助离心的方法，去除杂蛋白的同时，保持目的抗原的完整结构。
2、本发明采用碟片式高速离心机去除变性杂蛋白，是由于传统管式离心机不带有定期排渣功能，以致随着离心量的加大和时间的延长，管壁残渣不断增厚，严重影响后续待离心液的纯化效果。而碟片式高速离心机大大提高了抗原的纯化效果。
附图说明
图1：抗原纯化前后浊度OD600区别图，
图2：抗原纯化前后HA效价区别图，
图3：规模化生产灭活抗原离心(纯化)前后浊度(OD600)区别图，
图4：规模化生产灭活抗原离心(纯化)前后HA区别图。
具体实施方式
申请人在生产实践中发现，在现有的通过在压力情况下的过滤工艺，不但不能彻底去除残存杂蛋白，而且容易破坏灭活抗原的完整结构。因为禽流感病毒等微生物表面镶嵌许多如血凝素(HA)等有效抗原表位，该表位经过甲醛灭活后，柔韧度降低，变脆，此时如经过不锈钢网之类的硬质材料过滤后宜发生抗原表位的脱落。破坏目的抗原的完整结构，从而影响目的抗原的免疫原性。
因此，本发明提供了一种规模化生产的胚毒类抗原的纯化方法，能够更有效的去除灭活疫苗中的杂蛋白。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：建立方法
本发明所建立的方法，包括如下的步骤：
1.1变温处理：
选择禽流感病毒H5N1亚型Re-8株灭活抗原，HA为10Log2，浊度OD600值0.604，将其由灭活状态的36～37℃，迅速降至2～15℃。
设立不变温，直接不锈钢网过滤对照组。
1.2静置：
将灭活抗原在2～15℃环境下，静置7～14d。目的在于彻底将残存的杂蛋白析出，并保持稳定。
静置日期的选定，即考虑了杂蛋白的去除效率，又避免了目的抗原蛋白的损失(图1)。
1.3高速离心:
将变温处理的灭活抗原液，借助碟片式高速离心机，在恒温(2～10℃)条件下，以13000g～16000g离心力高速离心，彻底去除残存的杂蛋白。
因传统管式离心机不带有定期排渣功能，以致随着离心量的加大和时间的延长，管壁残渣不断增厚，严重影响后续待离心液的纯化效果。而此系统，在整个离心纯化过程，采用数字化控制技术，优化了排渣程序，定期定量进行离心残渣的排除，从而大大提高了抗原的纯化效果。
使用本发明的方法，禽流感病毒H5N1亚型Re-8株灭活抗原纯化后浊度(OD600)得到显著的下降(见图1)，从图1来看，变温离心后的抗原浊度(OD600)从0.604降至0.385，下降比例达36.3％，与处理前抗原浊度差异显著；而常规不锈钢网过滤工艺处理的抗原浊度下降15.7％，与处理前差异不显著。同时抗原的血凝价(HA)基本无变化，间接反应目的抗原纯净度提高。相反，如采用传统的不锈钢网在有压力的前提下进行过滤纯化，浊度OD600下降不明显，HA下降半个滴度(从10.0log2降至9.5log2)。表明传统的纯化工艺不仅没有彻底去除杂蛋白，反而破坏了抗原的血凝素结构，影响抗原的免疫效果(图2)。
实施例2：规模化生产
依据实施例1建立的方法，在禽流感灭活苗车间选取禽流感病毒H5N1亚型Re-8株抗原作为研究对象，连续试用9批，每批次分别对抗原纯化前后进行取样，监测浊度(OD600)和HA(见图3、图4)。从9批灭活抗原变温离心前后监测的数据来看，OD600值由离心前的0.5～0.7降至离心后的0.3～0.4。HA效价未出现明显变化；表明本发明的方法能够用于大规模生产应用。

Claims (7)

1.一种胚毒类抗原的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
S1：将胚毒类灭活抗原由甲醛灭活时的温度进行降温操作；
S2：将降温的灭活抗原进行静置，静置的时间不少于7～14d；
S3：将静置后的灭活抗原以13000g～16000g离心力高速离心，获得的上清液为纯化的胚毒类抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S1中甲醛灭活时的温度为36～37℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S1中的降温操作，是将灭活抗原的温度降至2～15℃。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的降温操作，是在在1小时内时间内降温至2～15℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的静置温度为2～15℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3中所述的离心为借助碟片式高速离心机进行离心。
7.其中胚毒类抗原，包含有鸡新城疫抗原、禽流感抗原、传染性支气管炎抗原、鸡减蛋综合征抗原等。
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