CN103724420A - 一种猪脾转移因子提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猪脾转移因子提取方法。该方法采用高压均质机快速破碎脾脏组织和细胞，无需冻融步骤，能更有效缩短生产周期；在均质化处理后、过滤前引入有效的固液分离工艺，对物料进行破乳，排出物料中的气体，降低离心难度，再离心得到较清澈的上清液。明显降低了用于膜过滤的料液固形物含量，增加了膜的过滤速率以及使用寿命，与膜过滤技术配合显著缩短了原液生产周期，过程操作方便、自动化程度高，符合规模化生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及一种猪脾转移因子提取方法。
背景技术
转移因子（Transfer factor，简称TF）是淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能，目前其在国外已成为一种应用广泛的增强免疫制剂。
转移因子存在于脾脏的淋巴细胞中，现有技术的转移因子制备方法普遍是将动物脾脏进行绞碎、破坏细胞结构使胞内转移因子释放到浆液中，再将浆液中的转移因子进行分离精制最终得到转移因子产品。
动物脾脏浆液成分复杂，因此动物TF不易分离纯化；动物TF分子量一般在3～15KD，属于小分子多肽，不含蛋白质，含6种以上氨基酸；不同动物和不同抗原特异性TF的分子量、肽分子大小和氨基酸种类略有差别；TF无热原；TF的活性不被胰酶所破坏；TF的活性对热不稳定，在冷冻条件下稳定。
鉴于以上特点，目前制备转移因子的现有技术主要采用透析法（Laurence法）或过滤法。透析法是指对动物脾脏匀浆的上清液进行若干次透析，实现对转移因子的分离纯化，此法操作简单，但生产周期长，操作费用高，难以进行工业化大规模生产；过滤法是先对脾脏组织进行破碎匀浆，再离心取上清液进行过滤，实现对转移因子的分离纯化，此方法较透析法耗时短、机械化程度较高。
在利用过滤法制备猪脾转移因子的实际操作中，由于提取转移因子的原料猪脾脏经组织绞碎，细胞破碎后所得到的物料固含量较高（在30%左右），物料颗粒粒径分布在20μm～80μm之间，且含有大量的脾脏筋膜，这些因素会显著降低膜过滤效率，减少膜的使用寿命，增加生产时间和生产成本，因此现有技术在膜过滤之前普遍先对物料进行预处理，即固液分离工艺。
现有技术的固液分离操作普遍采用离心法来实现，但是由于经细胞破碎的物料高度乳化，气液固三相混合十分均一导致物料中固形物的密度小于液体，因此常规离心法难以对料液实现固液分离，进而影响整体工艺效率。
发明内容
为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种效率更高的猪脾转移因子提取方法，该方法在对脾脏进行绞碎、均质化处理之后结合了有效的固液分离工艺，从而提升了过滤效果整体工艺效率。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种猪脾转移因子提取方法，包括以下步骤：
1)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.1～0.5倍质量的纯化水，经胶体磨充分研磨，而后继续加入纯化水直至本步骤所加入的纯化水总质量为肉糜总质量的1.4～1.6倍为止，混合均匀，即得到匀浆待用；
2)利用高压均质机对步骤1）得到的匀浆进行均质处理，均质处理过程中浆液温度不高于40℃，而后控温至23～27℃，即得到待处理浆液，待用；
3)将步骤2)得到的待处理液进行去乳化处理，得到糜状物，待用；
4)将步骤3)得到的糜状物进行若干次离心，取上清液即为待过滤液，待用；
5)将步骤4)得到的待过滤液利用微滤系统，以0.005～0.5μm孔径进行微滤，收集滤液待用；
6)将步骤5)得到的滤液利用超滤系统，以4～10KD孔径进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。
上述技术方案中，步骤3)和步骤4)可以细化为以下步骤
1)用纯化水配制含有柠檬酸0.2～0.5%(w/v)、柠檬酸钠0.1～0.25%(w/v)、氯化钠0.1～0.25%(w/v)的溶液，控温至23～27℃，即得到处理液，待用；
2)将上述待处理浆液与上述处理液以1:0.8～1:1.2(v/v)的比例混合均匀，得到糜状物，静置1小时；
3)将静置完毕的糜状物用碟片式分离机进行一次分离，过程中温度控制在23～27℃，取上清液待用；
4)将上述上清液用管式离心机进行二次分离，过程中温度控制在23～27℃，取上清液即为待过滤液，待用；
上述技术方案中，步骤1）所述的猪脾脏为新鲜的、去除了结缔组织和脂肪的猪脾脏；步骤1)第一次加入的纯化水量优选为0.2倍质量；步骤1)第二次加入的纯化水量优选为0.9倍质量；步骤2)优选控温至25℃；步骤3)优选控温至25℃；步骤4)的混合比例优选为1:1(v/v)；步骤5)所述一次分离的转速为优选7000rpm；步骤6)所述二次分离的转速优选为14000rpm。
上述微滤系统和超滤系统均自市面购得，操作方法依照设备操作规程实施；纯化水标准参照《中华人民共和国兽药典》的规定；所用试剂均自市面购得。
本发明采用高压均质机快速破碎细胞，无需冻融步骤，能更有效缩短生产周期；在均质化处理后、过滤前引入有效的固液分离工艺，对物料进行去乳化处理，排出物料中的气体，降低离心难度，再离心得到较清澈的上清液。明显降低了用于膜过滤的料液固形物含量，增加了膜的过滤速率以及使用寿命，与膜过滤技术配合显著缩短了原液生产周期，过程操作方便、自动化程度高，符合规模化生产需求。
具体实施方式
实施例1
1)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；
2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；
3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍；
4)每2份混合，加入0.1倍质量（1.2kg）的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨1遍，放入洁净盛料桶，共装5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；
5)每桶加入1.4倍质量（16.8kg）的纯化水，搅拌制成匀浆；
6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质1遍，在线控制浆液温度处于35～40℃，而后控温至23℃，即得到待处理浆液，待用；
7)用纯化水配制含有柠檬酸0.2%(w/v)、柠檬酸钠0.1%(w/v)、氯化钠0.1%(w/v)的溶液，控温至23℃，即得到处理液，待用；
8)将步骤6)得到的待处理浆液与步骤7)得到的处理液以1:0.8（v:v=99L:79.2L）混合混匀，得到糜状物，静置1h；
9)将步骤8)得到的糜状物用碟片式分离机以6000rpm的转速离心，过程中温度控制在25℃，取上清液待用；
10)将步骤9)得到的上清液用管式离心机以12000rpm的转速进行二次离心，过程中温度控制在26℃，控制进料速度在400L/h，如物料升温过快则用管式离心机自带降温装置通4℃冷却水进行降温，控制物料温度在35℃，离心完毕取上清液即为待过滤液，待用；
11)按照微滤系统（孔径150KD，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，进行微滤液收集，收集30L微滤液，不断加入纯化水稀释，直至收集300L微滤液；
12)按照超滤系统（孔径4KD，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，微滤液浓缩，收集透过液共310kg，即为转移因子原液。
实施例2
1)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；
2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；
3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍；
4)每2份混合，加入0.25倍质量（3kg）的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨1遍，放入洁净盛料桶，共装5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；
5)每桶加入1.15倍质量（13.8kg）的纯化水，搅拌制成匀浆；
6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质2遍，在线控制浆液温度处于30～35℃，而后控温至25℃，即得到待处理浆液，待用；
7)用纯化水配制含有柠檬酸0.35%(w/v)、柠檬酸钠0.2%(w/v)、氯化钠0.2%(w/v)的溶液，控温至25℃，即得到处理液，待用；
8)将步骤6)得到的待处理浆液与步骤7)得到的处理液以1:1（v:v=150L:150L）混合混匀，得到糜状物，静置1h；
9)将步骤8)得到的糜状物用碟片式分离机以7000rpm的转速离心，过程中温度控制在23℃，取上清液待用；
10)将步骤9)得到的上清液用管式离心机以14000rpm的转速进行二次离心，过程中温度控制在24℃，控制进料速度在400L/h，如物料升温过快则用管式离心机自带降温装置通4℃冷却水进行降温，控制物料温度在35℃，离心完毕取上清液即为待过滤液，待用；
11)按照微滤系统（孔径200KD，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，进行微滤液收集，收集30L微滤液，不断加入纯化水稀释，直至收集300L微滤液；
12)按照超滤系统（孔径6KD，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，微滤液浓缩，收集透过液共289kg，即为转移因子原液。
实施例3
1)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；
2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；
3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍；
4)每2份混合，加入0.5倍质量（6kg）的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨1遍，放入洁净盛料桶，共装5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；
5)每桶加入1.1倍质量（13.2kg）的纯化水，搅拌制成匀浆；
6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质3遍，在线控制浆液温度处于25～30℃，而后控温至27℃，即得到待处理浆液，待用；
7)用纯化水配制含有柠檬酸0.5%(w/v)、柠檬酸钠0.25%(w/v)、氯化钠0.25%(w/v)的溶液，控温至27℃，即得到处理液，待用；
8)将步骤6)得到的待处理浆液与步骤7)得到的处理液以1:1.2（v:v=225L:270L）混合混匀，得到糜状物，静置1h；
9)将步骤8)得到的糜状物用碟片式分离机以8000rpm的转速离心，过程中温度控制在27℃，取上清液待用；
10)将步骤9)得到的上清液用管式离心机以16000rpm的转速进行二次离心，过程中温度控制在27℃，控制进料速度在400L/h，如物料升温过快则用管式离心机自带降温装置通4℃冷却水进行降温，控制物料温度在35℃，离心完毕取上清液即为待过滤液，待用；
11)按照微滤系统（孔径0.5μm，上海立昌环境工程有限公司）操作规程，进行微滤液收集，收集30L微滤液，不断加入纯化水稀释，直至收集300L微滤液；
12)按照超滤系统（孔径10KD，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，微滤液浓缩，收集透过液共308kg，即为转移因子原液。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种猪脾转移因子提取方法，包括以下步骤：
1)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.1～0.5倍质量的纯化水，经胶体磨充分研磨，而后继续加入纯化水直至本步骤所加入的纯化水总质量为肉糜总质量的1.4～1.6倍为止，混合均匀，即得到匀浆待用；
2)利用高压均质机对步骤1）得到的匀浆进行均质处理，均质处理过程中浆液温度不高于40℃，而后控温至23～27℃，即得到待处理浆液，待用；
3)将步骤2)得到的待处理液进行去乳化处理，得到糜状物，待用；
4)将步骤3)得到的糜状物进行若干次离心，取上清液即为待过滤液，待用；
5)将步骤4)得到的待过滤液利用微滤系统，以0.005～0.5μm孔径进行微滤，收集滤液待用；
6)将步骤5)得到的滤液利用超滤系统，以4～10KD孔径进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。
2.根据权利要求1所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.1～0.5倍质量的纯化水，经胶体磨充分研磨，而后继续加入纯化水直至本步骤所加入的纯化水总质量为肉糜总质量的1.4～1.6倍为止，混合均匀，即得到匀浆待用；
2)利用高压均质机对步骤1）得到的匀浆进行均质处理，均质处理过程中浆液温度不高于40℃，而后控温至23～27℃，即得到待处理浆液，待用；
3)用纯化水配制含有柠檬酸0.2～0.5%(w/v)、柠檬酸钠0.1～0.25%(w/v)、氯化钠0.1～0.25%(w/v)的溶液，控温至23～27℃，即得到处理液，待用；
4)将步骤2)得到的待处理浆液与步骤3)得到的处理液以1:0.8～1:1.2(v/v)的比例混合均匀，得到糜状物，静置1小时；
5)将步骤4)静置完毕的糜状物用碟片式分离机进行一次分离，过程中温度控制在23～27℃，取上清液待用；
6)将步骤5)得到的上清液用管式离心机进行二次分离，过程中温度控制在23～27℃，取上清液即为待过滤液，待用；
7)将步骤6)得到的待过滤液利用微滤系统，以0.005～0.5μm孔径进行微滤，收集滤液待用；
8)将步骤7)得到的滤液利用超滤系统，以4～10KD孔径进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于步骤1）所述的猪脾脏为新鲜的、去除了结缔组织和脂肪的猪脾脏。
4.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子提取方法，其特征在于步骤1)第一次加入的纯化水量为0.2倍质量。
5.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子提取方法，其特征在于步骤1)第二次加入的纯化水量为0.9倍质量。
6.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子提取方法，其特征在于步骤2)控温至25℃。
7.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子提取方法，其特征在于步骤3)控温至25℃。
8.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子提取方法，其特征在于步骤4)的混合比例为1:1(v/v)。
9.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子提取方法，其特征在于步骤5)所述一次分离的转速为7000rpm。
10.根据权利要求1或2所述的一种猪脾转移因子提取方法，其特征在于步骤6)所述二次分离的转速为14000rpm。
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