CN105367621A - 一种猪脾转移因子制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪脾转移因子制备方法及应用，本发明方法结合使用冷冻破碎、冻融破碎及离心工艺进行转移因子生产，在保证产量的基础上降低了生产温度，能更有效的保证转移因子活性。此外，本发明所制备的转移因子不含蛋白质，属小分子多肽，无热原，活性不被胰酶所破坏，无毒性反应，是一种广泛应用的免疫调节剂，可提高疫苗效价，亦可用于增强动物机体免疫功能，提高生产性能。当联合疫苗使用，能显著增强动物机体免疫力，同时提高疫苗效价水平，缩短机体免疫应答期，延长抗体持续时间。

Description

一种猪脾转移因子制备方法及应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪脾转移因子制备方法及应用。

背景技术

转移因子(Transferfactor，简称TF)是淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，不含蛋白质，是小分子多肽，具有传递免疫信息、调节免疫功能、增强机体免疫功能等作用。TF无热原，不被胰酶所破坏，TF的活性对热不稳定，在冷冻条件下稳定，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能，目前其在国外已成为一种应用广泛的增强免疫制剂。

1、制备工艺

目前制备转移因子的现有技术主要采用透析法(Laurence法)或过滤法。朱天新等先将组织绞碎，再冻融破碎，pH调节-超滤法适合于转移因子的大规模生产；顾平和陈德有使用絮凝剂和助滤剂作用微滤、超滤，工艺操作简单，生产周期短，操作费用低，产量高，可以大规模工业化生产的新工艺。

“口服转移因子”(专利申请号:93121184.0)将新鲜健康猪脾脏匀浆、冻融、透析、过滤除菌，制成转移因子原液；“一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法”(专利申请号:201210136306.0)将免疫后的猪脾脏进行清洗、匀浆、冻融破碎，经过滤、超滤后获得原液；“一种猪脾转移因子注射液的生产方法”(专利申请号:201110126248.9)使用匀浆、低温超声破碎、离心、超滤工艺提取转移因子；“一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法”(专利申请号:200810053541.5)用组织捣碎机、冻融、离心、超滤法制备工艺；“抗流感病毒转移因子的制备”(专利申请号:200610035059.X)用组织捣碎机捣碎、低温冻融、离心、中空纤维管超过滤的制备工艺；“静脉注射用转移因子制备工艺流程”(专利申请号:200410046404.0)使用冻融法和全滤法生产注射液，下游亦使用超滤进行截留筛分。

综上可见，转移因子制备基本包括绞碎、匀浆、冻融破碎、离心、超滤等步骤，由于TF的活性对热不稳定，因此，为了在最大限度保证产物活性，提高产品品质，需要一种低温制备转移因子的方法。

2、转移因子兽医临床应用

刘雁等应用猪脾转移因子注射液联合猪瘟免疫，结果表明，猪瘟免疫配合使用转移因子，可以改善猪机体免疫机能，显著提高抗体滴度；高迎春等研究显示注射TF后，接种减蛋综合征灭活油佐剂疫苗可以显著提高鸡体的免疫水平；潘天彪试验结果指出，使用猪用转移因子对仔猪体重的增加很明显；黄建文等研究表明试验组免疫后产生保护力时间提前，保护期延长，淋巴细胞转化率提高；李富桂等研究指出TF对IBD具有良好的疗效。

大量的试验研究证明，TF对疫苗均具有协同作用，能显著提高机体细胞免疫水平，缩短机体免疫应答期，促进抗体的产生，并延长抗体高峰期，使之维持更长的时间。TF越来越多用于动物临床应用。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪脾转移因子制备方法及应用，以解决现有技术方法所制备的转移因子效价较低。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术方法因操作过程温度较高导致所制备转移因子效价较低。

本发明要解决的再一技术问题是提升疫苗的免疫保护效果。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪脾转移因子制备方法，包括以下步骤：

1)取猪脾脏绞碎得到匀浆液；

2)将步骤1)所述匀浆液于-25～-15℃速冻，而后于35～40℃速融，如此反复冻融6～8次；

3)将步骤2)冻融后的匀浆在10～15℃条件下8000～10000r/min离心，取上清液；

4)将步骤3)所述上清液超滤，取滤液即为猪脾转移因子溶液。

作为优选，所述猪脾脏是去除了筋膜、油脂的脏器实体。

作为优选，步骤1)中所述脾脏先用生理盐水清洗，再用注射水清洗，而后再绞碎得到匀浆液；在此基础上进一步优选的，所述注射水的温度是5～10℃。

作为优选，步骤1)中所述的绞碎，是先利用绞肉机粗绞1遍并加入脾脏总质量0.5～1倍的注射水混匀，而后再利用胶体磨精绞2～3遍，并加入脾脏总质量0.5～1倍的注射水混匀；在此基础上进一步优选的，所述的绞肉机粗绞，绞肉机孔板的孔径是3～5mm。

作为优选，步骤2)中冻融的总时间小于6h。

作为优选，步骤4)所述的超滤，所用膜组件是内压式膜组件。

作为优选，步骤4)所述的超滤，所用膜组件材质是PVDF。

作为优选，步骤4)所述的超滤，其截留分子量是5KDa。

本发明同时提供了上述转移因子用于提高疫苗效价的应用；作为优选，其应用方式是接种疫苗后体内注射转移因子。

本发明制备的转移因子系一种以健康猪脾脏为原料，经破碎、离心、超滤后制备的含有多肽、核糖等活性物质的制剂，用于提高动物机体免疫力，提高免疫效果。其应用动物包括家禽(鸡、鸭、鹅等)、家畜(猪、牛、羊等)，以及宠物(犬、猫等)。

猪脾脏呈扁长条形，色泽均匀一致，无充血、结节、出血点及肿胀等，具有一定的弹性和硬度，被膜呈灰白色，浅褐色或微灰红色，切面呈深红色，实质柔软，较脆，无腐败变质，有固有的气味。本发明中，可以从屠宰场收集健康猪脾脏，剪去筋膜和大块油脂，用注射水配制的0.9％生理盐水清洗2～3遍，注射水冲洗1遍，1～2kg/份包装后于-15℃冻存，用于后续制备。

以本发明方法制备得到转移因子溶液，可以作为原料药进一步制备生物制品，例如可以经检测合格进行配药、无菌分装、检验、包装、入库等流程，检验合格并批准后，上市销售。剂型优选为注射液。

配合疫苗使用或单独使用时，可以以0.1～2.0ml的用量注射转移因子注射液(规格：多肽≥1.5mg/ml；核糖≥50μg/ml)，提高疫苗滴度和动物生长性能。

本发明结合使用冷冻破碎、冻融破碎及离心工艺进行转移因子生产，在保证产量的基础上降低了生产温度，能更有效的保证转移因子活性。

此外，本发明方法用健康猪脾脏为原料，经去脂肪、细胞破碎、离心、超滤制备的转移因子溶液，不含蛋白质，是小分子多肽，无热原，活性不被胰酶所破坏，无毒性反应，是一种广泛应用的免疫调节剂，可提高疫苗效价，亦可用于增强动物机体免疫功能，提高生产性能。当联合疫苗使用，能显著增强动物机体免疫力，同时提高疫苗效价水平，缩短机体免疫应答期，降低养殖中疾病发生风险。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1(转移因子注射液制备)

(1)领料根据生产计划领取冻存原料50kg，进入生产区除去外包装；

(2)粗绞按冻肉绞肉机操作规程，冻肉绞肉机粗绞，使用3mm筛，出料加入0.5倍8℃注射水混合，搅拌成流体状；

(3)精绞按胶体磨操作规程，胶体磨研磨粗绞液2～3遍，加入1倍8℃注射水，混匀，收获精绞液123kg；

(4)冻融精绞液以-20℃→37℃反复冻融6次；

(5)离心冻融料液在10℃下，经10000r/min离心，去除沉淀，收获上清，共83kg；

(6)超滤离心上清经超滤装置(截留分子量5KDa)超滤，收集透过液，共79kg，即为半成品；

(7)半成品检验留样检测，剩余无菌过滤至4℃无菌罐，暂存；

(8)配药半成品检验合格，多肽含量为3.8mg/ml，核糖含量为116.3μg/ml；按成品含量要求：多肽含量≥1.5mg/ml，核糖含量≥50.0μg/ml，半成品用注射水稀释2.3倍，pH值调节约为7.0，共配制181.7kg；

(9)无菌灌装规格10ml/瓶(多肽含量≥1.5mg/ml，核糖含量≥50.0μg/ml)，共生产18130瓶；

(10)成品检验成品抽检，合格放行。

实施例2(转移因子注射液制备)

(1)领料根据生产计划领取冻存原料60kg，进入生产区除去外包装；

(2)粗绞按冻肉绞肉机操作规程，冻肉绞肉机粗绞，使用5mm筛，出料加入0.8倍10℃注射水混合，搅拌成流体状；

(3)精绞按胶体磨操作规程，胶体磨研磨粗绞液2～3遍，加入0.7倍10℃注射水，混匀，收获精绞液147kg；

(4)冻融精绞液以-20℃→37℃反复冻融8次；

(5)离心冻融料液在15℃下，经8000r/min离心，去除沉淀，收获上清，共106kg；

(6)超滤离心上清经超滤装置(截留分子量5KDa)超滤，收集透过液，共101kg，即为半成品；

(7)半成品检验留样检测，剩余无菌过滤至4℃无菌罐，暂存；

(8)配药半成品检验合格，多肽含量为4.1mg/ml，核糖含量为143.6μg/ml；按成品含量要求：多肽含量≥1.5mg/ml，核糖含量≥50.0μg/ml，半成品用注射水稀释2.7倍，pH值调节约为7.0，共配制272.7kg；

(9)无菌灌装规格10ml/瓶(多肽含量≥1.5mg/ml，核糖含量≥50.0μg/ml)，共生产27210瓶；

(10)成品检验成品抽检，合格放行。

实施例3(转移因子注射液制备)

(1)领料根据生产计划领取冻存原料50kg，进入生产区除去外包装；

(2)粗绞按冻肉绞肉机操作规程，冻肉绞肉机粗绞，使用5mm筛，出料加入1倍7℃注射水混合，搅拌成流体状；

(3)精绞按胶体磨操作规程，胶体磨研磨粗绞液2～3遍，加入0.7倍7℃注射水，混匀，收获精绞液124kg；

(4)冻融精绞液以-20℃→37℃反复冻融7次；

(5)离心冻融料液在10℃下，经9000r/min离心，去除沉淀，收获上清，共86.5kg；

(6)超滤离心上清经超滤装置(截留分子量5KDa)超滤，收集透过液，共83kg，即为半成品；

(7)半成品检验留样检测，剩余无菌过滤至4℃无菌罐，暂存；

(8)配药半成品检验合格，多肽含量为4.0mg/ml，核糖含量为133.2μg/ml；按成品含量要求：多肽含量≥1.5mg/ml，核糖含量≥50.0μg/ml，半成品用注射水稀释2.6倍，pH值调节约为7.0，共配制215.8kg；

(9)无菌灌装规格10ml/瓶(多肽含量≥1.5mg/ml，核糖含量≥50.0μg/ml)，共生产21530瓶；

(10)成品检验成品抽检，合格放行。

实施例4(本发明方法所制备的转移因子注射液对禽流感疫苗效价的提高作用)

(1)分组购买30日龄蛋鸡，设正常免疫组、转移因子组和不免疫组，每组10只，共30只。

(2)方法除不免疫组外，其余蛋鸡均使用某厂生产的重组禽流感病毒灭活疫苗(R6株)免疫，同时转移因子组按0.1ml/羽腿部肌肉注射转移因子注射液，分别于接种后7、14、21、28d各组鸡采集血液，分离血清，测定R6血清型抗体效价。

(3)结果和讨论抗体效价测定结果见表1。正常免疫组和转移因子组的抗体分别在28天左右达最高峰，转移因子组可缩短机体免疫应答期，促进抗体的产生，提高抗体效价。

表1禽流感R6型抗体效价(n＝10)

注：数据为平均值±标准差。

实施例5(本发明方法所制备的转移因子注射液对猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫效果影响)

(1)分组选择猪场，未免疫断奶仔猪，设正常免疫组、转移因子组，每组50头，共100头；

(2)方法所有组按猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗使用说明免疫，同时转移因子组配合应用转移因子注射液，2ml/头；免疫后28天，每组随机抽取5头，对每头仔猪进行前腔静脉采血，然后及时分离血清，冷冻保存，备用，用猪蓝耳病毒IgG抗体诊断试剂盒检测OD450值的大小，以判断抗体水平的高低。

(3)结果和讨论抗体效价测定结果见表2，结果显示：猪脾转移因子注射液与猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗联合具有协同作用，能有效提高免疫后仔猪的抗体水平，增强疫苗的免疫效果。

表2猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗抗体效价(n＝5)

注：数据为平均值±标准差；按10％抽样。

实施例6：(本发明方法所制备的转移因子注射液对宠物的治疗效果)

(1)分组和方法选择动物医院，对发病宠物(猫、犬)统计记录，患有相同疾病的犬、猫分为正常治疗组和转移因子组，转移因子组为正常治疗结合转移因子注射液使用，转移因子注射液以1ml/只肌肉注射，连续3～5日。

(2)结果和讨论统计治疗结果，见表3，统计结果显示：宠物犬、猫结合使用转移因子注射液进行治疗，提高治疗率。

表3转移因子注射液对宠物治疗效果统计

实施例7：(本发明方法所制备的转移因子注射液对鸡生产性能影响)

(1)分组和方法购买1日龄AA白羽肉鸡20只，随机分为2组，每组10只。一组为正常生长组，肌肉注射0.1ml灭菌PBS，正常饲养；一组为转移因子组，每只肌肉注射0.1ml转移因子注射液，正常饲养。每周称量各组鸡只体重，观察7周，比较体重变化。

(2)结果和讨论鸡只生长性能观察结果如表4。结果显示：鸡只注射转移因子后，其生长性能提高，每周的平均体重均高于正常组，可增加经济效益。

表4各组体重记录(n＝10)

注：数据为平均值±标准差。

实施例8(转移因子注射液制备)

一种猪脾转移因子制备方法，包括以下步骤：

1)取猪脾脏绞碎得到匀浆液；

2)将步骤1)所述匀浆液于-25～-15℃速冻，而后于35～40℃速融，如此反复冻融6～8次；

3)将步骤2)冻融后的匀浆在10～15℃条件下8000～10000r/min离心，取上清液；

4)将步骤3)所述上清液超滤，取滤液即为猪脾转移因子溶液。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述猪脾脏是去除了筋膜、油脂的脏器实体。

步骤1)中所述脾脏先用生理盐水清洗，再用注射水清洗，而后再绞碎得到匀浆液。

步骤1)中所述的绞碎，是先利用绞肉机粗绞1遍并加入脾脏总质量0.5～1倍的注射水混匀，而后再利用胶体磨精绞2～3遍，并加入脾脏总质量0.5～1倍的注射水混匀。

步骤2)中冻融的总时间小于6h。

步骤4)所述的超滤，所用膜组件材质是PVDF。

步骤4)所述的超滤，其截留分子量是5KDa。

实施例9(转移因子注射液制备)

一种猪脾转移因子制备方法，包括以下步骤：

1)取猪脾脏绞碎得到匀浆液；

2)将步骤1)所述匀浆液于-25～-15℃速冻，而后于35～40℃速融，如此反复冻融6～8次；

3)将步骤2)冻融后的匀浆在10～15℃条件下8000～10000r/min离心，取上清液；

4)将步骤3)所述上清液超滤，取滤液即为猪脾转移因子溶液。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取猪脾脏绞碎得到匀浆液；

2)将步骤1)所述匀浆液于-25～-15℃速冻，而后于35～40℃速融，如此反复冻融6～8次；

3)将步骤2)冻融后的匀浆在10～15℃条件下8000～10000r/min离心，取上清液；

4)将步骤3)所述上清液超滤，取滤液即为猪脾转移因子溶液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述猪脾脏是去除了筋膜、油脂的脏器实体。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述脾脏先用生理盐水清洗，再用注射水清洗，而后再绞碎得到匀浆液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述注射水的温度是5～10℃。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的绞碎，是先利用绞肉机粗绞1遍并加入脾脏总质量0.5～1倍的注射水混匀，而后再利用胶体磨精绞2～3遍，并加入脾脏总质量0.5～1倍的注射水混匀。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的绞肉机粗绞，绞肉机孔板的孔径是3～5mm。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中冻融的总时间小于6h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)所述的超滤，所用膜组件材质是PVDF。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)所述的超滤，其截留分子量是5KDa。

10.权利要求1所述转移因子用于提高疫苗效价的应用。