CN107007841A - 一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于转移因子制备技术领域，提出一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，包含以下步骤：原材料的制备、预处理、破碎、冻融、提取、超滤、除菌、包合、分装，冻干，最终即得包合动物用转移因子粉剂。本发明的创新点在于：一方面在制备前将原材料进行特殊处理，即：制备前对供脾猪给予以特异的免疫增强处理，给仔猪免疫一组包含若干类畜禽病原微生物抗原表位的多肽类组合抗原，使制备的转移因子既具有增强非特异性免疫的功能也具有提高特异性抗病原微生物的功能；另一方面利用环糊精包被技术解决了现有转移因子口服时容易被胃酸破坏、利用率低的技术问题；这俩项均解决了现有技术中长久以来未解决的技术难题。

Description

一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法
技术领域
本发明属于转移因子制备技术领域，涉及一种环糊精包合多价特异性猪转 移因子制备方法。
背景技术
畜禽病毒性疾病严重地威胁着广大养殖户甚至整个国民经济的发展，我国 每年因畜禽病毒感染造成的损失可达数百亿元，提高动物自身免疫力是解决动 物病毒感染的一个主要途径，在增强动物机体免疫力的药物中，转移因子经受 了长时间的检验，是具有广泛代表性的药品之一，目前，现有转移因子存在有 效成分低，口服时容易被胃酸破坏的技术问题。
发明内容
本发明提出一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，解决了上述 技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的，包含以下步骤：
(1)原材料的制备：选健康无病史且予以免疫增强处理的猪宰杀，取脾脏 于冰上，冷冻保存；
(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，剪去其筋膜及脂肪组织， 再用冷三蒸水洗涤干净；
(3)破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入冷的生理盐水，用高速组织捣碎 机破碎，制得匀浆液；
(4)冻融：将匀浆液置于冷冻后再融化，进行若干次交替冻融；
(5)提取：加入冷生理盐水，置于冰冻离心机中进行离心分离，取上层血 红色液体，再用漏斗过滤，取滤液；
(6)超滤：将步骤(5)中的滤液用中空纤维管加压超滤，得到滤液；
(7)除菌：将步骤(6)中超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，得到猪 转移因子；
(8)包合：将羟丙基-β-环糊精和猪转移因子按5:1的比例恒温30℃条件下 搅拌2小时进行包合；
(9)分装，冻干，即得包合动物用转移因子粉剂。
进一步，本发明的更优方案为：所述步骤(1)中，对供脾猪在取脾前予以 特异的免疫增强处理，给仔猪免疫一组包含若干类畜禽病原微生物抗原表位的 多肽类组合抗原，使制备的转移因子既具有增强非特异性免疫的功能也具有提 高特异性抗病原微生物的功能。
进一步，所述步骤(1)中所宰杀猪具体为6月龄猪，冷冻温度为－20℃。
进一步，冷的生理盐水的加入体积为猪脾脏体积的2倍份，高速组织捣碎 机破碎工艺具体为采用在冰冻的条件下以1000rpm捣碎3次，每次3min
进一步，所述步骤(4)中，冷冻温度具体为－80℃，融化方式和温度具体 为水浴30℃，交替冻融次数具体为10次。
进一步，所述步骤(5)中，加入冷生理盐水的体积具体为物料体积的3倍， 冰冻离心机的离心工艺具体为在5℃以4000rpm离心30分钟，过滤漏斗具体为 G2砂心漏斗。
进一步，所述步骤(6)中，中空纤维管具体为截流值为6000道尔顿的中 空纤维管，得到的滤液具体为分子量小于6000道尔顿的转移因子。
进一步，所述步骤(7)中，滤膜孔径具体为0.22μm。
本发明原理及有益效果为：
1、本发明是经羟丙基-β-环糊精包合后的转移因子粉剂，使转移因子的运输、 保存和使用更加方便，另外转移因子粉剂添加到饲料中或溶解到水中饮用均可， 应用前景广泛。
2、利用羟丙基-β-环糊精包合转移因子是长久以来未解决的技术问题，因为 一般会降低转移因子的有效成分，本发明经过了大量的实验研究，得到了有效 成分较高的羟丙基-β-环糊精包合转移因子，本发明还将在这种研究基础上扩大 包合物，使产品的抗病毒效果更加突出，经包合后的转移因子口服时不易被胃 酸破坏，原有性质不变，还能提高生物利用度，使转移因子在胃液中仍能保持 较高的有效成分，同时转移因子无毒副作用，使用剂量小，本发明转移因子确 定动物合适用量为0.2mg/kg。
3、本发明中，羟丙基-β-环糊精是β-环糊精的一种羟烷基化衍生物，是一种 水溶性的、非还原性的、不易被酸水解的白色结晶性粉末，其分子结构独特， 具有分子胶囊结构，药物进入其中间的空筒结构所形成的包合物仍保留原来的 化学性质，经渗透、扩散作用，包合物中的药物被溶出而发挥药效。
4、本发明中，采用冷冻干燥法，搅拌使转移因子达到最佳包合，通过大量 试验及分析可知，转移因子和羟丙基-β-环糊精比例为1:5，包合温度为30℃，包 合时间为2小时，使药物具有较高的稳定性。
5、本发明可以使生物对药物的吸收显著增加，并能减轻对胃肠或肌肉组织 的损伤，转移因子经羟丙基-β-环糊精包合后，不但溶解度高，释放速度快，而 且与未经包合的转移因子相比，血液中的药物浓度水平明显提高。
6、本发明中，在制备转移因子的前期，对供脾猪在取脾前予以特异的免疫 增强处理：给仔猪免疫一组包含多种猪常见病原微生物抗原表位的多肽类组合 抗原，使制备的转移因子既具有增强非特异性免疫的功能也具有提高特异性抗 病原微生物的功能，特异的免疫处理实现了使制备的转移因子的有效成分得到 提升的效果，同时可以预防普通的和流行等多种动物疾病，具体为给仔猪免疫 若干种流行疾病以及常见疾病的抗原，使制备的转移因子具有免疫流行疾病以 及常见疾病的功能。
7、本发明中，一方面在制备前将原材料进行特殊处理，即：制备前对供脾 猪给予以特异的免疫增强处理，另一方面利用环糊精包被技术解决了现有转移 因子口服时容易被胃酸破坏、利用率低的技术问题。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实 施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前 提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，包含以下 步骤：
(1)原材料的制备：选健康无病史且予以免疫增强处理的猪宰杀，取脾脏 于冰上，冷冻保存；
(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，剪去其筋膜及脂肪组织， 再用冷三蒸水洗涤干净；
(3)破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入冷的生理盐水，用高速组织捣碎 机破碎，制得匀浆液；
(4)冻融：将匀浆液置于冷冻后再融化，进行若干次交替冻融；
(5)提取：加入冷生理盐水，置于冰冻离心机中进行离心分离，取上层血 红色液体，再用漏斗过滤，取滤液；
(6)超滤：将步骤(5)中的滤液用中空纤维管加压超滤，得到滤液；
(7)除菌：将步骤(6)中超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，得到猪 转移因子；
(8)包合：将羟丙基-β-环糊精和猪转移因子按5:1的比例恒温30℃条件下 搅拌2小时进行包合；
(9)分装，冻干，即得包合动物用转移因子粉剂。
进一步，本发明的更优方案为：所述步骤(1)中，对供脾猪在取脾前予以 特异的免疫增强处理，给仔猪免疫一组包含若干类畜禽病原微生物抗原表位的 多肽类组合抗原，使制备的转移因子既具有增强非特异性免疫的功能也具有提 高特异性抗病原微生物的功能。
进一步，所述步骤(1)中所宰杀猪具体为6月龄猪，冷冻温度为－20℃。
进一步，冷的生理盐水的加入体积为猪脾脏体积的2倍份，高速组织捣碎 机破碎工艺具体为采用在冰冻的条件下以1000rpm捣碎3次，每次3min
进一步，所述步骤(4)中，冷冻温度具体为－80℃，融化方式和温度具体 为水浴30℃，交替冻融次数具体为10次。
进一步，所述步骤(5)中，加入冷生理盐水的体积具体为物料体积的3倍， 冰冻离心机的离心工艺具体为在5℃以4000rpm离心30分钟，过滤漏斗具体为 G2砂心漏斗。
进一步，所述步骤(6)中，中空纤维管具体为截流值为6000道尔顿的中 空纤维管，得到的滤液具体为分子量小于6000道尔顿的转移因子。
进一步，所述步骤(7)中，滤膜孔径具体为0.22μm。
实施例一：一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，包含以下步 骤：
(1)原材料的制备：选健康无病史的免疫增强处理6月龄猪宰杀，取脾脏 于冰上，转移置－20℃保存；
(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，用剪刀剪去其筋膜及脂 肪组织，再用冷三蒸水洗涤干净；
(3)破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻 的条件下用高速组织捣碎机以1000rpm捣碎3次，每次3min，制得匀浆液；
(4)冻融：冷冻温度具体为－80℃，融化方式和温度具体为水浴30℃，交 替冻融次数具体为10次；
(5)提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5℃以4000rpm 离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
(6)超滤：将步骤(5)中的滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维管加 压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；
(7)除菌：将步骤(6)中超滤得到的滤液用孔径为0.22μm的滤膜加压过 滤除菌，得到猪转移因子；
(8)包合：将羟丙基-β-环糊精和猪转移因子按5:1的比例恒温30℃条件下 搅拌2小时进行包合；
(9)分装，冻干，即得包合动物用转移因子粉剂。
实施例二：一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法为：实施例一 步骤(1)中，对供脾猪在取脾前予以特异的免疫增强处理，给仔猪免疫一组包 含若干类畜禽病原微生物抗原表位的多肽类组合抗原，使制备的转移因子既具 有增强非特异性免疫的功能也具有提高特异性抗病原微生物的功能，具体为给 仔猪免疫若干种流行疾病以及常见疾病的抗原，使制备的转移因子具有免疫流 行疾病以及常见疾病的功能，其他步骤同实施例一。
实施例一和实施例二按照上述制备方法制备后，对比市场上现有转移因子 (即为对照组)，对转移因子的有效成分进行测量，测量方法采用紫外分光光度 法，测量260nm和280nm样品吸光度的比值，从而判定样品的有效成分，吸光度 比值越高，则有效成分越高，260nm和280nm样品吸光度的比值测量结果如表1所示，每个样品平行做5组实验，取平均值：
表1 260nm和280nm吸光度比值测量结果
由表1的测量结果可知，实施例一和实施例二的吸光度比值的测量结果均大 于对照组的测量结果，说明本发明实施例一和实施例二制备的转移因子的有效 成分均高于对照组，另外实施例二的转移因子的有效成分相较于实施例一来说 较高，因为实施例二对供脾猪在取脾前予以特异的免疫增强处理，使制备的转 移因子的有效成分得到了提升。
为了验证转移因子是否容易被胃酸破坏，对实施例一、实施例二以及对照 组的样品置于一定PH值的溶液中，一段时间后测量转移因子的有效成分，胃液 的PH值一般为2～3，饮食后胃液被稀释，PH值为3～4左右，因此本实验测定 PH范围为1～4条件下，分别经过1小时、2小时、4小时和8小时后，采用紫 外分光光度法，测量260nm和280nm样品吸光度的比值，从而判定样品的有效 成分，结果如表2和表3所示：
表2PH为1和2条件下样品吸光度比值测量结果
表3PH为3和4条件下样品吸光度比值测量结果
由表3和表4的测量结果可知：PH范围为1～4条件下，样品的有效成分均 有所下降，实施例一和实施例二相对于对照组有效成分的变化量较小，为了更 好的对结果进行分析，将表3和表4样品经过8小时，有效成分的降低率进行 统计，统计结果如表4所示，
表4PH1～4条件下样品8h后有效成分降低率测量结果
由表4的结果可知，在酸性条件下，实施例一和实施例二有效成分的降低 率远远小于对照组，说明经包合后的转移因子口服时不易被胃酸破坏，稳定性 更高。
综上所述：实施例一、实施例二有效成分以及稳定性均优于对照组，相比 较而言，实施例二综合性能最优。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)原材料的制备：选健康无病史且予以免疫增强处理的猪宰杀，取脾脏于冰上，冷冻保存；
(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，剪去其筋膜及脂肪组织，再用冷三蒸水洗涤干净；
(3)破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入冷的生理盐水，用高速组织捣碎机破碎，制得匀浆液；
(4)冻融：将匀浆液置于冷冻后再融化，进行若干次交替冻融；
(5)提取：加入冷生理盐水，置于冰冻离心机中进行离心分离，取上层血红色液体，再用漏斗过滤，取滤液；
(6)超滤：将步骤(5)中的滤液用中空纤维管加压超滤，得到滤液；
(7)除菌：将步骤(6)中超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，得到猪转移因子；
(8)包合：将羟丙基-β-环糊精和猪转移因子按5:1的比例恒温30℃条件下搅拌2小时进行包合；
(9)分装，冻干，即得包合动物用转移因子粉剂。
2.根据权利要求1所述的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对供脾猪在取脾前予以特异的免疫增强处理，给仔猪免疫一组包含若干类畜禽病原微生物抗原表位的多肽类组合抗原，使制备的转移因子既具有增强非特异性免疫的功能也具有提高特异性抗病原微生物的功能。
3.根据权利要求1所述的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所宰杀猪具体为6月龄猪，冷冻温度为－20℃。
4.根据权利要求1所述的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，冷的生理盐水的加入体积为猪脾脏体积的2倍份，高速组织捣碎机破碎工艺具体为采用在冰冻的条件下以1000rpm捣碎3次，每次3min。
5.根据权利要求1所述的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，冷冻温度具体为－80℃，融化方式和温度具体为水浴30℃，交替冻融次数具体为10次。
6.根据权利要求1所述的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，加入冷生理盐水的体积具体为物料体积的3倍，冰冻离心机的离心工艺具体为在5℃以4000rpm离心30分钟，过滤漏斗具体为G2砂心漏斗。
7.根据权利要求1所述的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，中空纤维管具体为截流值为6000道尔顿的中空纤维管，得到的滤液具体为分子量小于6000道尔顿的转移因子。
8.根据权利要求1所述的一种环糊精包合多价特异性猪转移因子制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，滤膜的孔径具体为0.22μm。
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