CN105194643A - 一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：步骤1、免疫健康猪；步骤2、原材料预处理；步骤3、组织匀浆的制取；步骤4、反复冻融；步骤5、超滤；步骤6、除菌。本发明采用预处理和超滤等方法对传统的制备工艺进行改良，工艺简单，产品的生物活性好，多肽产量高。结果改良工艺后平均多肽含量为3.27g/L，明显高于传统工艺平均多肽含量1.25g/L，提高近2.6倍，测定其生物活性亦比原工艺制备明显提高。

Description

一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法。

背景技术

我国是世界上禽蛋禽肉生产的大国，位居世界第一、第二，由于目前国内市场的消费日趋满足，能否出口就成为制约我国养禽业发展的重要问题。其中，疫病控制及免疫预防中的药物残留问题是主要根源。在鸡的所有疫病中，传染性疾病可占到60％～70％，仍然是危害养鸡业的最重要的疾病。因此，要想发展养鸡业必须控制鸡病毒性免疫抑制性疾病，我国未来养殖业的发展方向，应该实现由污染的环境、高昂的成本、低劣的产品，向环保、节能和生产大量绿色安全食品的转变。作为绿色环保的生物性免疫增强剂——特异性转移因子，以其无抗原性、无毒副作用等特点，已在畜牧业上得到了广泛的应用，并有取代抗生素和抗体的趋势。特异性转移因子是一种具有较强免疫活性的小分子物质，吸收快，作用迅速，无不良反应和毒副作用。由于其有抗原特异性和多方面的非特异性免疫功能，是一种理想的动物免疫增强制剂。

免疫增强制剂的制备方法主要采用透析-过柱法、超滤-过柱法或单纯透析法，如曾仕廉等报道，将细胞置于-50℃冻结，再置于37℃水浴融化，如此反复冻融6次，4000r/min低温冷冻离心，上清液经中空纤维超滤器超滤，截留相对分子质量5000的超滤液，再采用SephadexG-25柱层析进行洗脱纯化。李富桂等报道，将组织置于组织捣碎机中粉碎匀浆后，用超声波裂解组织细胞，再于4000r/min离心20min。弃去沉淀，将上清液装入透析袋，搅拌透析48h，收集透析外液，蛋白质检测为阴性，再将透析外液用SephadexG-25柱层析进行洗脱纯化。江青艳等、日穆德玛等和马凤龙等报道，用无菌盐水洗净组织，在无菌条件下搅碎、称重，加1.5倍双蒸馏水制成匀浆，冻融9次，3000r/min离心30min，取上清液用透析袋进行透析，温度为4℃，磁力搅拌透析48h。以上介绍的免疫增强制剂的制备方法，工艺繁琐，多肽产量低，不适合大规模批量生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，采用预处理和超滤等方法对传统的制备工艺进行改良，工艺简单，产品的生物活性好，多肽产量高。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、免疫健康猪：取鸡目的疫苗作为抗原，对健康猪进行目的疫苗强化免疫；

步骤2、原材料预处理：采集免疫成功后猪的脾、胸腺及淋巴结，用纯化水洗净猪脾、胸腺及淋巴结，去其表面的筋膜及脂肪等组织，再用灭菌生理盐水反复冲洗；

步骤3、组织匀浆的制取：将步骤2所得洗干净的猪脾脏、胸腺及淋巴结剪碎，加入3倍体积的生理盐水，在4℃的条件下用胶体磨磨细，制得组织匀浆；

步骤4、反复冻融：将步骤3制取的组织匀浆于-70℃快速冷冻，之后再在30℃左右进行水浴融化，按照此冷冻和融化的方式共重复进行五次，然后通过冰冻离心机于4℃以3000-4000r/min离心20-30分钟，取上层红色液体，离心渣再用2倍的生理盐水稀释，再用胶体磨磨细，置于冰冻离心机于4℃以3000-4000r/min离心20-30分钟，取上层红色离心液体，将两次滤液混合在一起；

步骤5、超滤：将步骤4所得混合滤液用截流值为10KD的超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；

步骤6、除菌：将步骤5超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，即得鸡特异性免疫增强剂。

本发明的特点还在于，在步骤1中，所用鸡目的疫苗选自鸡新城疫疫苗、鸡传染性法氏囊炎疫苗。

本发明的特点还在于，在步骤1中，对健康猪进行目的疫苗强化免疫的过程如下：

对选择的健康猪利用目的疫苗进行皮下多点注射进行免疫，免疫共进行4次，每次免疫间隔一周，4次免疫的免疫剂量依次为50羽/头、100羽/头、200羽/头、500羽/头。

本发明的特点还在于，在步骤1中，所选健康猪无传染病和寄生虫病，所选健康猪的体重约100kg。

本发明的特点还在于，在步骤6中，所用滤膜的孔径为0.22um。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，采用预处理和超滤等方法对传统的制备工艺进行改良，工艺简单，产品的生物活性好，多肽产量高。结果改良工艺后平均多肽含量为3.27g/L，明显高于传统工艺平均多肽含量1.25g/L，提高近2.6倍，测定其生物活性亦比原工艺制备明显提高。利用本发明制备的鸡特异性免疫增强剂具有很好的市场利用前景，生产流程既简便又高效，大规模生产后可更加广泛的在兽医临床上应用，可以有效的预防和控制鸡病毒性疾病的发生与流行，从而减少此类疾病给养禽业带来的巨大的经济损失，以实现更好的企业效益和社会效益。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例子仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明实施例的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1、免疫健康猪：选取无传染病和寄生虫病的健康猪，体重约100kg，取鸡目的疫苗作为抗原，对健康猪进行目的疫苗强化免疫，所用鸡目的疫苗选自鸡新城疫疫苗，对健康猪进行目的疫苗强化免疫的过程如下：

对选择的健康猪利用鸡新城疫疫苗进行皮下多点注射进行免疫，免疫共进行4次，每次免疫间隔一周，4次免疫的免疫剂量依次为50羽/头、100羽/头、200羽/头、500羽/头；

步骤2、原材料预处理：采集免疫成功后猪的脾、胸腺及淋巴结，用纯化水洗净猪脾、胸腺及淋巴结，去其表面的筋膜及脂肪等组织，再用灭菌生理盐水反复冲洗；

步骤3、组织匀浆的制取：将步骤2所得洗干净的猪脾脏、胸腺及淋巴结剪碎，加入3倍体积的生理盐水，在4℃的条件下用胶体磨磨细，制得组织匀浆；

步骤4、反复冻融：将步骤3制取的组织匀浆于-70℃快速冷冻，之后再在30℃左右进行水浴融化，按照此冷冻和融化的方式共重复进行五次，然后通过冰冻离心机于4℃以3000r/min离心30分钟，取上层红色液体，离心渣再用2倍的生理盐水稀释，再用胶体磨磨细，置于冰冻离心机于4℃以3000r/min离心30分钟，取上层红色离心液体，将两次滤液混合在一起；

步骤5、超滤：将步骤4所得混合滤液用截流值为10KD的超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；

步骤6、除菌：将步骤5超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，即得鸡特异性免疫增强剂，所用滤膜的孔径为0.22um。

实施例2

本发明实施例的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1、免疫健康猪：选取无传染病和寄生虫病的健康猪，体重约100kg，取鸡目的疫苗作为抗原，对健康猪进行目的疫苗强化免疫，所用鸡目的疫苗选自鸡传染性法氏囊炎疫苗，对健康猪进行目的疫苗强化免疫的过程如下：

对选择的健康猪利用鸡传染性法氏囊炎疫苗进行皮下多点注射进行免疫，免疫共进行4次，每次免疫间隔一周，4次免疫的免疫剂量依次为50羽/头、100羽/头、200羽/头、500羽/头；

步骤2、原材料预处理：采集免疫成功后猪的脾、胸腺及淋巴结，用纯化水洗净猪脾、胸腺及淋巴结，去其表面的筋膜及脂肪等组织，再用灭菌生理盐水反复冲洗；

步骤3、组织匀浆的制取：将步骤2所得洗干净的猪脾脏、胸腺及淋巴结剪碎，加入3倍体积的生理盐水，在4℃的条件下用胶体磨磨细，制得组织匀浆；

步骤4、反复冻融：将步骤3制取的组织匀浆于-70℃快速冷冻，之后再在30℃左右进行水浴融化，按照此冷冻和融化的方式共重复进行五次，然后通过冰冻离心机于4℃以4000r/min离心20分钟，取上层红色液体，离心渣再用2倍的生理盐水稀释，再用胶体磨磨细，置于冰冻离心机于4℃以4000r/min离心20分钟，取上层红色离心液体，将两次滤液混合在一起；

步骤5、超滤：将步骤4所得混合滤液用截流值为10KD的超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；

步骤6、除菌：将步骤5超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，即得鸡特异性免疫增强剂，所用滤膜的孔径为0.22um。

本发明采用预处理和超滤等方法对传统的制备工艺进行改良，工艺简单，产品的生物活性好，多肽产量高。结果改良工艺后平均多肽含量为3.27g/L，明显高于传统工艺平均多肽含量1.25g/L，提高近2.6倍，测定其生物活性亦比原工艺制备明显提高。利用本发明制备的鸡特异性免疫增强剂具有很好的市场利用前景，生产流程既简便又高效，大规模生产后可更加广泛的在兽医临床上应用，可以有效的预防和控制鸡病毒性疾病的发生与流行，从而减少此类疾病给养禽业带来的巨大的经济损失，以实现更好的企业效益和社会效益。

本发明的鸡特异性免疫增强剂使用方法

1、用法用量：

(1)用于免疫机能改善和提升疫苗免疫效果：7日龄以下雏鸡0.1毫升/羽，8～14日龄雏鸡0.2毫升/羽，15～30日龄0.25毫升/羽，31日龄以上，0.3～0.5毫升/羽，滴口或饮水，连用2～3天。

(2)细菌病毒性疾病的辅助治疗：雏鸡0.1～0.3毫升/羽，成鸡0.3～0.5毫升/羽，饮水，连用3天。

2、使用方案

(1)雏鸡2-3日龄，每羽0.1毫升，10-12日龄，每羽0.1毫升，单独或配合药物使用，用于改善免疫机能，提高机体抵抗力。免疫前一天和当天使用，配合饮水，可以显著提高疫苗的免疫效果。

(2)在病毒性传染病流行期、易感日龄及引种后预防使用以及病毒性传染病发病初期使用，配合抗病毒药物，对隐性流感、非典型新城疫、无名产蛋下降、肾传支等病毒病有直接的治疗作用，尤其是对雏鸡新城疫具有其他产品无法比拟的效果。

(3)在28日龄前后，根据养殖场的实际情况连续使用2～3天，可有效避免30日龄后的死亡高峰和呼吸道综合症。

(4)在蛋鸡或种鸡进入产蛋高峰期时使用，可降低高峰时期各种病毒病的发生率，同时减少输卵管炎的发生。

本发明的鸡特异性免疫增强剂主要功效如下：

1、抗免疫抑制、提升白细胞数量：鸡特异性免疫增强剂可以有效改善免疫缺陷或免疫应答低下动物的免疫机能恢复，可以作为免疫激活剂，显著增加血液内白细胞的数量，活化淋巴细胞，促进T细胞生长，从而发挥抗免疫抑制、增强免疫功能的作用。

2、增强细胞免疫活性：鸡特异性免疫增强剂可以有效地增强淋巴细胞的活化作用，对中性粒细胞有很强的趋化活性，对巨噬细胞有弱的趋化活性，可增强单核细胞的功能，使K细胞的活性明显增加，刺激巨噬细胞产生淋巴细胞激活因子，促进胸腺细胞分化，促进核中性粒细胞游走等。

3、增强体液免疫活性：鸡特异性免疫增强剂可以有效激活B淋巴细胞，促进其分化，增加抗体的分泌，显著提高血液抗体水平，增加抗体滴度。

4、诱导干扰素的产生：鸡特异性免疫增强剂可以诱导和启动干扰素的生成，显著提高机体内干扰素的水平。研究显示，鸡特异性免疫增强剂启动诱生的干扰素要比正常机体产生的干扰素高1.7倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、免疫健康猪：取鸡目的疫苗作为抗原，对健康猪进行目的疫苗强化免疫；

步骤2、原材料预处理：采集免疫成功后猪的脾、胸腺及淋巴结，用纯化水洗净猪脾、胸腺及淋巴结，去其表面的筋膜及脂肪等组织，再用灭菌生理盐水反复冲洗；

步骤3、组织匀浆的制取：将步骤2所得洗干净的猪脾脏、胸腺及淋巴结剪碎，加入3倍体积的生理盐水，在4℃的条件下用胶体磨磨细，制得组织匀浆；

步骤4、反复冻融：将步骤3制取的组织匀浆于-70℃快速冷冻，之后再在30℃左右进行水浴融化，按照此冷冻和融化的方式共重复进行五次，然后通过冰冻离心机于4℃以3000-4000r/min离心20-30分钟，取上层红色液体，离心渣再用2倍的生理盐水稀释，再用胶体磨磨细，置于冰冻离心机于4℃以3000-4000r/min离心20-30分钟，取上层红色离心液体，将两次滤液混合在一起；

步骤5、超滤：将步骤4所得混合滤液用截流值为10KD的超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；

步骤6、除菌：将步骤5超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，即得鸡特异性免疫增强剂。

2.根据权利要求1所述的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所用鸡目的疫苗选自鸡新城疫疫苗、鸡传染性法氏囊炎疫苗。

3.根据权利要求1所述的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于，在步骤1中，对健康猪进行目的疫苗强化免疫的过程如下：

对选择的健康猪利用目的疫苗进行皮下多点注射进行免疫，免疫共进行4次，每次免疫间隔一周，4次免疫的免疫剂量依次为50羽/头、100羽/头、200羽/头、500羽/头。

4.根据权利要求1所述的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所选健康猪无传染病和寄生虫病，所选健康猪的体重约100kg。

5.根据权利要求1所述的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于，在步骤6中，所用滤膜的孔径为0.22um。