CN102697811A - 一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，将小鹅瘟病毒接种于鹅胚的尿囊腔中进行增殖，提取病毒制备抗原；然后将提取的病毒抗原免疫健康猪，再从被免疫猪中免疫器官中提取抗小鹅瘟病毒转移因子。本发明所制备的转移因子能够有效抑制小鹅瘟病毒和保护正常机体细胞免受小鹅瘟病毒的感染，预防小鹅瘟疾病的发生。此外，本发明的制备方法在生产上设备简单、生产时间短，易于操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，属于免疫学领域。
背景技术
小鹅瘟是由小鹅瘟病毒（GPV）引起的雏鹅和雏番鸭一种急性或亚急性的败血症，小肠发生急性卡他性或纤维素坏死性炎症，主要侵害4-20日龄雏鹅，传染快、发病率与死亡率都高，给养殖业带来重大损失。本病是1956年由我国方定一在扬州发现，1965年来，欧洲很多国家报道有本病的存在。
转移因子（TF，Transfer Factor）又称传输因子，可以作为细胞免疫促进剂，是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，这种物质将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体的细胞免疫功能；同时促进B淋巴细胞分泌作用，能够诱导免疫细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的抵抗力，这种转移因子是一种小分子生物活性物质，不含蛋白质、可溶性好，具有纯度高，免疫活性强，作用时间长，疗效良好，安全无毒副作用等优点。
发明内容
本发明提供了一种抗小鹅瘟转移因子的制备方法，以制备天然纯生物活性物质转移因子抑制小鹅瘟病毒，保护正常机体细胞免受小鹅瘟病毒的感染，达到根本的预防目的。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗小鹅瘟转移因子的制备方法，将小鹅瘟病毒接种于鹅胚的尿囊腔中进行增殖，提取病毒制备抗原；然后将提取的病毒抗原免疫健康猪，再从被免疫猪的免疫器官中提取抗小鹅瘟病毒转移因子，具体制备步骤如下：
1）小鹅瘟病毒抗原的制备：将小鹅瘟病毒接种于12-14日龄鹅胚的尿囊腔中进行增殖，35℃，培养3-5天，提取尿腔液和绒尿膜，研磨超声波处理后，经6000-8000r/min离心，弃沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2）纯化抗原：将病毒粗抗原液加入到不连续梯度密度为20-60%的蔗糖离心管上，经过超速心处理，根据小鹅瘟病毒粒子的大小确定病毒带所在离心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到纯病毒抗原备用；
3）病毒抗原免疫猪：随机选取健康的猪，按病毒抗原病毒滴度制定接种剂量，采用皮下多点注射接种方式，免疫3次，每次间隔一周，然后从宰杀猪中无菌取其脾脏、胸腺、淋巴组织，放置-20℃保存；
4）从被免疫猪中提取抗小鹅瘟病毒转移因子：
①将所取的脾脏、胸腺、淋巴组织经过无菌去离子水清洗干净，然后剔净脏器表面的筋膜及脂肪组织，再用PH为6.8-7.2的PBS缓冲液清洗干净；
②将洗干净的组织剪成小块之后放入到组织匀浆机中，再加入2-3倍预冷的0.85%生理盐水，1500-2000r/min转速，每次2 min，制得匀浆液；
③匀浆液经过-60- -80℃快速冷冻,再快速解冻，经过4-5次的冻融，然后将冻融后的溶液放到低温超声波细胞破碎仪中破碎3s停3s，经过20min破碎，得到精细的匀浆液，再加3倍的冷生理盐水，混匀，经过低温7000-8000r/min离心10min，取上清液，经过滤处理，留滤液备用；
④用稀盐酸将滤液酸度值调PH至5.4-5.6，净化滤液，将净化后的滤液用0.22um滤膜过滤后收集，再将上述的滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，收集滤液再次用滤膜进行无菌过滤，即为抗小鹅瘟病毒转移因子。
步骤2）所述的蔗糖溶液分为4个递增的蔗糖浓度梯度，分别为20-25%、30-35%、40-45%、55-60%。
步骤3）所述取免疫猪的脾脏、胸腺、淋巴等组织之前，根据免疫学的方法检测抗原在体内产生的特异性抗体效价后，再取猪的免疫组织。
本发明制备的抗小鹅瘟转移因子是天然纯生物活性物质，能够有效的抑制小鹅瘟病毒，对雏鹅和雏番鸭由小鹅瘟病毒引起的小鹅瘟起到治疗和预防作用，从根本上保护正常机能细胞免受小鹅瘟病毒感染和侵害。脾脏、胸腺、淋巴组织等都是免疫器官，是产生免疫反应的场所，从这些组织中提取的多肽核酸复合物具有较好的特异性。
本发明提供的小鹅瘟转移因子的制备方法简单、操作行强、生产原料充足，可以在短时间内生产完成，主要技术包括病毒的增殖、健康猪的免疫和特异性抗体效价的检测、转移因子的提取、转移因子的除菌处理和保存等，这种方法生产成本低，主要具有良好的应用前景。
具体实施方式
结合具体实施例对本发明的内容作进一步的说明。
实施例1
一种抗小鹅瘟转移因子的制备方法，具体制备步骤如下：
1）小鹅瘟病毒抗原的制备：将小鹅瘟病毒接种于12日龄鹅胚的尿囊腔中进行增殖，35℃，培养3天，提取尿腔液和绒尿膜，研磨超声波处理后，经6000r/min离心，弃沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2）纯化抗原：将0.5ml病毒粗抗原液加入到不连续梯度密度为20%、30%、40%、55%的蔗糖离心管上，每个梯度1.1ml蔗糖溶液，经过超速心处理，根据小鹅瘟病毒粒子的大小确定病毒带所在离心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到纯病毒抗原备用；
3）病毒抗原免疫猪：随机选取健康的猪，按病毒抗原病毒滴度制定接种剂量，采用皮下多点注射接种方式，免疫3次，每次间隔一周，根据免疫学的方法检测抗原在体内产生的特异性抗体效价后，然后从宰杀猪中无菌取其脾脏、胸腺、淋巴组织，放置-20℃保存；
4）从被免疫猪中提取抗小鹅瘟病毒转移因子：
①将所取的脾脏、胸腺、淋巴组织经过无菌去离子水清洗干净，然后剔净脏器表面的筋膜及脂肪组织，再用PH为6.8的PBS缓冲液清洗干净；
②将洗干净的组织剪成小块之后放入到组织匀浆机中，再加入2倍预冷的0.85%生理盐水，1500r/min转速，每次2 min，制得匀浆液；
③匀浆液经过-60℃快速冷冻,再快速解冻，经过4次的冻融，然后将冻融后的溶液放到低温超声波细胞破碎仪中破碎3s停3s，经过20min破碎，得到精细的匀浆液，再加3倍的冷生理盐水，混匀，经过低温7000r/min离心10min，取上清液，经过滤处理，留滤液备用；
④用稀盐酸将滤液酸度值调PH至5.4，净化滤液，将净化后的滤液用0.22um滤膜过滤后收集，再将上述的滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，收集滤液再次用滤膜进行无菌过滤，即为抗小鹅瘟病毒转移因子。
实施例2
一种抗小鹅瘟转移因子的制备方法，具体制备步骤如下：
1）小鹅瘟病毒抗原的制备：将小鹅瘟病毒接种于14日龄鹅胚的尿囊腔中进行增殖，35℃，培养5天，提取尿腔液和绒尿膜，研磨超声波处理后，经8000r/min离心，弃沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2）纯化抗原：将0.5ml病毒粗抗原液加入到不连续梯度密度为25%、35%、45%、60%的蔗糖离心管上,每个梯度1.1ml蔗糖溶液，经过超速心处理，根据小鹅瘟病毒粒子的大小确定病毒带所在离心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到纯病毒抗原备用；
3）病毒抗原免疫猪：随机选取健康的猪，按病毒抗原病毒滴度制定接种剂量，采用皮下多点注射接种方式，每次间隔一周，免疫3次，根据免疫学的方法检测抗原在体内产生的特异性抗体效价后，然后从宰杀猪中无菌其取脾脏、胸腺、淋巴组织，放置-20℃保存；
4）从被免疫猪中提取抗小鹅瘟病毒转移因子：
①将所取的脾脏、胸腺、淋巴组织经过无菌去离子水清洗干净，然后剔净脏器表面的筋膜及脂肪组织，再用PH为7.0的PBS缓冲液清洗干净；
②将洗干净的组织剪成小块之后放入到组织匀浆机中，再加入3倍预冷的0.85%生理盐水，2000r/min转速，每次2 min，制得匀浆液；
③匀浆液经过-80℃快速冷冻,再快速解冻，经过4次的冻融，然后将冻融后的溶液放到低温超声波细胞破碎仪中破碎3s停3s，经过20min破碎，得到精细的匀浆液，再加3倍的冷生理盐水，混匀，经过低温8000r/min离心10min，取上清液，经过滤处理，留滤液备用；
④用稀盐酸将滤液酸度值调PH至5.5，净化滤液，将净化后的滤液用0.22um滤膜过滤后收集，再将上述的滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，收集滤液再次用滤膜进行无菌过滤，即为抗小鹅瘟病毒转移因子。
实施例3
一种抗小鹅瘟转移因子的制备方法，具体制备步骤如下：
1）小鹅瘟病毒抗原的制备：将小鹅瘟病毒接种于13日龄鹅胚的尿囊腔中进行增殖，35℃，培养5天，提取尿腔液和绒尿膜，研磨超声波处理后，经7000r/min离心，弃沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2）纯化抗原：将0.5ml病毒粗抗原液加入到不连续梯度密度为20%、35%、40%、60%的蔗糖离心管上，每个梯度1.1ml蔗糖溶液，经过超速心处理，根据小鹅瘟病毒粒子的大小确定病毒带所在离心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到纯病毒抗原备用；
3）病毒抗原免疫猪：随机选取健康的猪，按病毒抗原病毒滴度制定接种剂量，采用皮下多点注射接种方式，免疫3次，每次间隔一周，根据免疫学的方法检测抗原在体内产生的特异性抗体效价后，然后从宰杀猪中无菌取其脾脏、胸腺、淋巴组织，放置-20℃保存；
4）从被免疫猪中提取抗小鹅瘟病毒转移因子：
①将所取的脾脏、胸腺、淋巴组织经过无菌去离子水清洗干净，然后剔净脏器表面的筋膜及脂肪组织，再用pH为7.2的PBS缓冲液清洗干净；
②将洗干净的组织剪成小块之后放入到组织匀浆机中，再加入3倍预冷的0.85%生理盐水，1800r/min转速，每次2 min，制得匀浆液；
③匀浆液经过-70℃快速冷冻,再快速解冻，经过4次的冻融，然后将冻融后的溶液放到低温超声波细胞破碎仪中破碎3s停3s，经过20min破碎，得到精细的匀浆液，再加3倍的冷生理盐水，混匀，经过低温8000r/min离心10min，取上清液，经过滤处理，留滤液备用；
④用稀盐酸将滤液酸度值调PH至5.6，净化滤液，将净化后的滤液用0.22um滤膜过滤后收集，再将上述的滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，收集滤液再次用滤膜进行无菌过滤，即为抗小鹅瘟病毒转移因子。
试验例1：动物保护试验
取300只12日龄健康雏鹅，随机分成对照、试验、空白三组，每组100只，在新环境中适应三天，自由采食，攻毒剂量为1.0??108CFU/只，攻毒后第三天试验组开始接种抗小鹅瘟转移因子，每只肌注0.2ml/只，每天一次，对照组注射生理盐，空白全程生理盐水，观察临床症状和死亡率作为指标反应本品的临床应用效果。结果显示：对照组发病率100%和死亡率100%，空白组没有变化，试验组发病率30%，而死亡率2%。
试验例2：动物安全试验
取健康小白鼠150只，随机分成空白、注射组、口服三组，每组50只，空白口服和注射蒸馏水2 ml/只，注射组注射本品5 ml/只，口服组灌服本品5 ml/只，观察小白鼠的变化。结果显示三组都无异常变化。说明本品安全，无不良反应。
试验例3：对本发明所述制备工艺提取抗小鹅瘟转移因子的指标检测：
1）蛋白质含量测定：采用20%磺基水杨酸方法，提取液没有发生浑浊和沉淀现象，呈阴性，不含蛋白质。
2）细菌检测：通过固体、液体培养基进行培养，观察无浑浊现象。
3）支原体检测：根据《2011版中华人民共和国兽药典》操作，检测无支原体。 4）多肽含量检测：经过双缩脲法测定含量为1.752mg/ml。
5）E-玫瑰花结形成率比较：鹅外周血淋巴细胞表面有鼠红细胞受体，并能与之结合形成E-玫瑰花结。而转移因子对淋巴细胞和大鼠红细胞的结合有一定的促进作用。本品的花结形成率平均为35.5.2%。
6）皮肤刺激性试验
取30只小白兔，分成对照、皮下注射、皮内注射2组，采用脱毛剂对家兔脊柱两侧被毛脱去，保证皮肤的完整性，然后注射本品0.5 ml/只，对照组注射生理盐水，分成单次给药、多次给药观察皮肤的变化。结果显示，注射生理盐水的10只中，有5只发生红肿，一天消肿，试验组中各有3只发生，12小时内全部消肿。
通过以上实验例，我们可以总结本发明所制备的抗小鹅瘟转移因子安全有效的抑制小鹅瘟病毒，保护正常的机体细胞免受小鹅病毒的感染，能够起到很好的预防作用，本发明的制备方法是可行的，应在临床上广泛推广。
Claims (3)
1.一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，其特征在于：将小鹅瘟病毒接种于鹅胚的尿囊腔中进行增殖，提取病毒制备抗原；然后将提取的病毒抗原免疫健康猪，再从被免疫猪的免疫器官中提取抗小鹅瘟病毒转移因子，具体制备步骤如下：
1）小鹅瘟病毒抗原的制备：将小鹅瘟病毒接种于12-14日龄鹅胚的尿囊腔中进行增殖，35℃，培养3-5天，提取尿腔液和绒尿膜，研磨超声波处理后，经6000-8000r/min离心，弃沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2）纯化抗原：将病毒粗抗原液加入到不连续梯度密度为20-60%的蔗糖离心管上，经过超速心处理，根据小鹅瘟病毒粒子的大小确定病毒带所在离心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到纯病毒抗原备用；
3）病毒抗原免疫猪：随机选取健康的猪，随机选取，按病毒抗原病毒滴度制定接种剂量，采用皮下多点注射接种方式，免疫3次，每次间隔一周，然后从宰杀猪中无菌取其脾脏、胸腺、淋巴组织，放置-20℃保存；
4）从被免疫猪中提取抗小鹅瘟病毒转移因子：
①将所取的脾脏、胸腺、淋巴组织经过无菌去离子水清洗干净，然后剔净脏器表面的筋膜及脂肪组织，再用PH为6.8-7.2的PBS缓冲液清洗干净。
②将洗干净的组织剪成小块之后放入到组织匀浆机中，再加入2-3倍预冷的0.85%生理盐水，1500-2000r/min转速，每次2 min，经过不去次匀浆，制得匀浆液；
③匀浆液经过-60- -80℃快速冷冻,再快速解冻，经过4-5次的冻融，然后将冻融后的溶液放到低温超声波细胞破碎仪中破碎3s停3s，经过20min破碎，得到精细的匀浆液，再加3倍的冷生理盐水，混匀，经过低温7000-8000r/min离心10min，取上清液，经过滤处理，留滤液备用；
④用稀盐酸将滤液酸度值调PH为5.4-5.6，净化滤液，将净化后的滤液用0.22um滤膜过滤后收集，再将上述的滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，收集后滤液再次用滤膜进行无菌过滤，即为抗小鹅瘟病毒转移因子。
2.根据权利要求1所述的一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，其特征在于：步骤2）所述的蔗糖溶液分为4个递增的蔗糖浓度梯度，分别为20-25%、30-35%、40-45%、55-60%。
3.根据权利要求1所述的一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，其特征在于：步骤3）所述取免疫猪的脾脏、胸腺、淋巴等组织之前，根据免疫学的方法检测抗原在体内产生的特异性抗体效价后，再取猪的免疫组织。
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