CN101057864A - 抗流感病毒转移因子的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗流感病毒转移因子的制备工艺。该制备工艺包括以下步骤：原材料的制备、预处理、破碎、冻融、提取、超滤、除菌、分装等。本工艺采用先免疫后提取的方法，得到特异性抗流感病毒转移因子。本工艺采用了低温冻融处理、中空纤维管超过滤法，从而缩短了制备时间，保证物质分离过程中活性不被破坏，可做成口服液等剂型，便于应用。

Description

抗流感病毒转移因子的制备工艺

技术领域

本发明属于药物及其制剂领域，涉及一种人参多糖的新剂型以及相关制备工艺。

背景技术

流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流行性感冒与一般病毒性感冒，是不同病原引起的两种疾病。一般的致病病毒入侵呼吸道粘膜后，抗病毒抗体会对其进行中和，可在一定程度上起到避免感染的作用。而引起流行性感冒的病原是流感病毒。流感病毒的最大特点就是容易发生变异，导致人体内已经出现的抗流感病毒特异性抗体失去中和病毒的作用，因而使人容易感染，甚至造成大规模流行。病人受流感感染后有的会并发原有的严重疾病，如肺心病、呼吸衰竭、心血管疾病等，重者可导致死亡。进入20世纪80年代以后，流感疫情以散发与小暴发为主，没有明显的流行发生。但近年来，高致病性禽流感发生人禽间传染的变异，正在危及人类健康，而且有蔓延和扩大的趋势，引起世界卫生组织和各国政府的高度重视。

尽管目前已经有一些抗流感病毒的药品或制剂，但是由于现有药品制剂的针对性不强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是在发病后才应用的，不能起预防作用。对于流感的易感人群，每年在流感流行季节来临前接种流感疫苗是预防流感的有效方法。其次应增强体质，提高自身免疫力。通过药物提高机体抵抗力或调节免疫力也是一种预防感冒的有效方法，转移因子可起到此作用。

转移因子(TF，Transfer Factor)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，它能将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体机体的细胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非细菌性感染；同时促进B淋巴细胞的抗体分泌作用，能够诱导细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的免疫功能。

目前已报道的转移因子的提取方法都是关于非特异性转移因子的制备方法。例如，中国发明专利“从猪脾中提取转移因子的方法”(专利号：ZL92113517.3号，申请日为1992年12月3日，授权公告日为1996年5月1日)披露的是利用透析法提取猪脾中的非特异性转移因子的方法。这种方法的制备时间较长，细胞破碎不完全，得率较低，生产成本较高，而且产物的活性容易降低。中国发明专利申请“制备转移因子的工艺方法——全滤法”(专利申请号：200310118439.6，申请日为2003年12月16日，公开日为2004年11月7日)则公开了采用压滤、超滤、纳滤几种方法连续过滤的制备工艺。另一份中国发明专利申请“制备转移因子的工艺方法——加热法”(专利申请号：200410039444.2，申请日为2004年2月13日，公开日为2005年8月17日)是由同一申请人在前一份申请的基础上加上加热处理的步骤，仍然是连续采用多种过滤法的制备工艺。上述专利申请的内容是对破碎后的组织经冷冻离心后直接进行过滤提取，同样存在细胞破碎不完全的缺陷，而且其工艺烦琐，时间较长，对产物的活性损失也较大，因此得率很难提高(上述专利申请也并未对实际提取产物提供数据分析)。

猪脾脏和胸腺是免疫活性细胞聚集的场所，而且材料来源非常广泛，因此，从这类细胞中提取特异性转移因子，有重要的理论意义和现实意义，但目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从动物脏器中制备抗流感病毒转移因子的工艺方法，所生产的是一类新型的转移因子制剂，是采用现代高科技生物分离技术精制而成的天然高效纯生物活性物质。

本发明所述的一种抗流感病毒转移因子的制备工艺，包括以下步骤：

(1)原材料的制备：选健康无病史的6月龄猪，用流感病毒疫苗皮下注射免疫，计量为1单位/100kg，15天后，再以同样方法及剂量免疫一次；二次免疫后15-20天宰杀，取脾脏和胸腺于冰上，转移置-20℃保存，备用；

(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪组织，再用冷三蒸水洗涤干净；

(3)破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次，每次3min，制得匀浆液；

(4)冻融：将匀浆液置于-80℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融10次或以上；

(5)提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5℃以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；

(6)超滤：将上述滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维管加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；

(7)除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22μm的滤膜加压过滤除菌；

(8)分装，4℃密封保存，即得所述的抗流感病毒转移因子提取液。

本发明所述的抗流感病毒转移因子的制备工艺，具有以下优点：

(1)原材料来源容易，无污染，价廉。猪脾脏和胸腺属于屠宰后猪的下脚料，以前多是丢弃的废物。

(2)本工艺采用先免疫后提取的方法，免疫家猪后在免疫高峰期宰杀，取脾脏、胸腺等，最终得到特异性抗流感病毒转移因子。

(3)在破碎组织后，加入低温冻融处理的步骤，特别是在30℃下溶解，不使小分子物质活性丧失，并能够使抗流感病毒转移因子得以充分地提取。

(4)本工艺采用了比较先进的中空纤维管超过滤法，从而缩短了制备时间，保证物质分离过程中活性不被破坏。

(5)本提取工艺的每个步骤，从选种、免疫到每步处理，均经过大量实验总结而得，是优选的实施方案，提取步骤尽可能简便易行，并确保提取物不容易失活。

(6)提取物经生化测定和若干成分分析，是一种低分子量多肽-核苷酸复合物，是一种不含蛋白质、可溶的小分子物质，分子量在6000道尔顿以下。经体内外生物活性试验以及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性强、起效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可增强抗病能力。该提取物可做成口服液等剂型，便于应用。

具体实施方式

实施例一：抗流感病毒转移因子的制备

本发明所述的一种抗流感病毒转移因子的制备工艺，包括以下步骤：

(1)原材料的制备：选健康无病史的6月龄猪10头，用流感病毒疫苗皮下注射免疫，计量为1单位/100kg，15天后，再免疫一次，方法剂量同上。二次免疫后15-20天宰杀，取脾脏和胸腺于冰上，转移置-20℃保存，备用。

(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪组织，再用冷三蒸水洗涤干净。

(3)破碎：将以上洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机(1000r/min)捣碎3次，每次3min，制得匀浆液。

(4)冻融：将匀浆液(用器皿装)至于超低温冰箱(-80℃)里快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融10次。

(5)提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机离心30min(4000r/min，5℃)，取上层液体(血红色)，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液。

(6)超滤：将上述滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维管加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子。

(7)除菌：分别用无菌滤器(滤膜孔径为0.22μm)加压过滤。

(8)包装：按口服液的要求，加15％的糖浆，加标准防腐剂(苯甲酸钠0.25％)后分装，10ml/瓶。

(9)保存：4℃密封贮存。

实施例二：对本发明所述工艺制备的抗流感病毒转移因子的检测

对实施例一所述工艺制备的抗流感病毒转移因子(下称“本品”)进行以下检测：

1)紫外线分光光度测定：本品在250.0～252.0nm处有一高吸收峰，且ABS260/ABS280＞2.0。

2)标准液为淡黄色，pH值在6.0～6.5之间。

3)20％磺基水杨酸检测：本品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均为阴性，其不含大分子蛋白质。

4)多肽含量测定：本品经双缩脲法测定多肽含量为1.130mg/ml。

5)核酸含量测定：本品经地衣酚法测定核酸含量为532.899μg/ml。

6)细菌学检测：本品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。

7)E-玫瑰花结形成率比较：人外周血淋巴细胞表面有鼠红细胞受体，并能与之结合形成E-玫瑰花结。而转移因子对淋巴细胞和大鼠红细胞的结合有一定的促进作用。本品的E-玫瑰花结形成率平均为37.4％，比对照组的增加16.7％(F2，6＝36.96，P＜0.01)。

8)取健康小白鼠5只，口服本品浓缩液，相当于正常口服液剂量的40倍，观察小白鼠的生存能力变化，结果：无任何毒性反应，也无死亡现象出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。

9)用PPD做家兔皮试实验，发现本品具有转移免疫活性的功能。

10)用流感病毒抗原做皮试检测，有微弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。

实施例三：利用本发明所述工艺制备的抗流感病毒转移因子的应用

将实施例一制备得到的抗流感病毒转移因子溶液，按口服液的要求，加15％的糖浆，加标准防腐剂，如苯甲酸钠0.25％，然后分装，10ml/瓶。

除上述糖浆剂型外，本发明所述的抗流感病毒转移因子还可制成其他口服液。

此外，通过常规冻干工艺进一步可得到抗流感病毒转移因子的粉末，结合常规辅料，可制成胶囊、片剂等剂型。

Claims (1)

1、一种抗流感病毒转移因子的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原材料的制备：选健康无病史的6月龄猪，用流感病毒疫苗皮下注射免疫，计量为1单位/100kg，15天后，再以同样方法及剂量免疫一次；二次免疫后15-20天宰杀，取脾脏和胸腺于冰上，转移置-20℃保存，备用；

(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪组织，再用冷三蒸水洗涤干净；

(3)破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次，每次3min，制得匀浆液；

(4)冻融：将匀浆液置于-80℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融10次；

(5)提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5℃以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；

(6)超滤：将上述滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维管加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子。

(7)除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22μm的滤膜加压过滤除菌；

(8)分装，4℃密封保存，即得所述的抗流感病毒转移因子提取液。