CN107252454B - 一种含有黑茶提取物的药品组合物在治疗脓毒症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黑茶提取物在治疗脓毒症中的应用，所述黑茶提取物为黑茶水提物或黑茶多糖提取物；其中，所述黑茶多糖提取物的制备方法为将黑茶粉碎过筛后，加蒸馏水浸提，过滤后取滤液减压蒸馏浓缩，精滤后使用有机溶剂萃取滤液，取水相减压蒸馏浓缩，冷冻干燥后即得黑茶多糖提取物。本发明发现黑茶提取物可以用于脓毒症治疗，可大大改善多种因素诱导的脓毒症小鼠存活率，而且本发明还发现黑茶多糖在细胞水平上对诱导性巨噬细胞程序性坏死有较好的抑制作用。因此，本发明提供了将黑茶提取物应用于脓毒症治疗领域的可靠技术方案，并给出将其作为药物开发推向医药市场的现实可能性。

Description

一种含有黑茶提取物的药品组合物在治疗脓毒症中的应用

技术领域

本发明属于现代中医药领域，具体涉及一种含有黑茶提取物的药品组合物在治疗脓毒症中的应用。

背景技术

脓毒症是目前临床上所面临的棘手难题之一，由其诱发的脓毒性休克和多器官衰竭综合征一直是外科重症监护(intensive care units，ICU)病人死亡的主要原因。目前临床上仍有30％-45％的脓毒症患者因不能及时控制病情而死亡，且脓毒症的发病率有继续增长的趋势。虽然因抗生素的不断发展更新，危重病人的治疗取得了不错的进展，但脓毒症仍是临床上久攻不克的难题之一。脓毒症是由感染或高度可疑感染灶引起的全身性炎症反应综合征，是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症。研究显示，脓毒症的发病机制极其复杂，涉及到全身炎性网络效应、免疫抑制反应、凝血功能障碍、基因多态性等等多个方面，同时还与多个器官和多个系统的病理生理改变密切相关。有文献报道，细菌内毒素可诱发脓毒症，机体单核巨噬细胞及其他炎性细胞因感染而被激活，诱导细胞产生并释放大量的炎性介质，它们相互作用形成网络炎性效应，进而引起全身各器官和系统产生损伤。目前对脓毒症的病理生理机制还不完全清楚，至今还没有药物能有效治疗脓毒症。因此，开发一种用于脓毒症治疗的药物迫在眉睫。

黑茶是中国特有的一大茶类，属于后发酵茶。目前在保健品和医药领域已有应用，具有非常好的保健品和医药开发前景。黑茶，六大茶类之一，属全发酵茶，经杀青、揉捻、渥堆、松柴明火干燥等四大工艺加工而成的，由于其特殊的加工过程，尤其是微生物的参与时期具有特殊的中医药理活性。近几年对黑茶的研究不断增多，主要集中在其降血脂、抗氧化、降血糖、杀菌、抗辐射等方面的研究，而没有意识到其脓毒症治疗方面的用途。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明人发现黑茶提取物可以用于脓毒症治疗，特别是本发明的实验结果发现，通过腹腔注射40mg/kg脂多糖(LPS)和盲肠结扎穿孔术建立小鼠脓毒症模型，黑茶提取物可提高脓毒症小鼠7天的存活率，并利用细胞实验对其作用机制做了初步探讨，发现黑茶多糖对10μg/ml脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞程序性坏死有较好的抑制作用。目前现有技术中尚没有把黑茶应用于脓毒症治疗领域，因此，无法认识到并将其作为药物来研究开发推向医药市场。

即本发明的目的在于提供一种黑茶提取物在治疗脓毒症中的应用，所述黑茶提取物为黑茶水提物或黑茶多糖提取物。

优选地，本发明所述黑茶提取物在治疗脓毒症中的应用中，所述黑茶水提物的制备方法为将黑茶粉碎过筛后，加蒸馏水浸提，过滤后取滤液减压蒸馏浓缩1～2次，冷冻干燥即得黑茶水提物；更优选地，所述黑茶与蒸馏水的重量比为1:5-1:20，所述黑茶水提物减压蒸馏浓缩至原体积的1/3-1/10。

优选地，本发明所述黑茶提取物在治疗脓毒症中的应用中，所述黑茶多糖提取物的制备方法为将黑茶粉碎过筛后，加蒸馏水浸提，过滤后取滤液减压蒸馏浓缩，精滤后使用有机溶剂萃取滤液，取水相减压蒸馏浓缩，冷冻干燥后即得黑茶多糖提取物；更优选地，所述有机溶剂萃取为按体积比1:1进行2次二氯甲烷萃取，按体积比1:1进行3次乙酸乙酯萃取，按体积比1:1进行3次异丙醇萃取；更优选地，所述黑茶与蒸馏水的重量比为1:5-1:20，所述黑茶多糖提取物减压蒸馏浓缩至原体积的1/3-1/10。

优选地，本发明所述黑茶提取物在治疗脓毒症中的应用中，所述黑茶水提物或黑茶多糖提取物的给药剂量为200-1000mg/kg。

优选地，本发明所述黑茶提取物在治疗脓毒症中的应用中，所述黑茶水提物或黑茶多糖提取物的给药对象为哺乳动物；更优选地，黑茶水提物或黑茶多糖提取物的给药对象为小鼠；最优选地，黑茶水提物或黑茶多糖提取物的给药对象为人。

本发明的另一方面是提供一种包含黑茶提取物的药物组合物在治疗脓毒症中的应用，其中所述药物组合物包括如上所述的黑茶提取物、虎杖苷以及辅料，其中所述黑茶提取物与虎杖苷的重量比为3:1～6:1。

优选地，本发明的包含黑茶提取物的药物组合物为胶囊剂、片剂或口服液。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

脓毒症是目前临床上所面临的棘手难题之一，脓毒症的发病机制极其复杂，至今还没有药物能有效治疗脓毒症。而本发明发现黑茶提取物可以用于脓毒症治疗，如本发明的后续实施例中所示，黑茶提取物可大大改善多种因素诱导的脓毒症小鼠存活率，而且本发明还发现黑茶多糖在细胞水平上对诱导性巨噬细胞程序性坏死有较好的抑制作用。因此，本发明提供了将黑茶提取物应用于脓毒症治疗领域的可靠技术方案，并给出将其作为药物开发推向医药市场的现实可能性。

附图说明

图1为本发明实施例3中的黑茶水提物对LPS致脓毒症小鼠7天存活率的影响示意图；

图2为本发明实施例3中的黑茶多糖提取物对LPS致脓毒症小鼠7天存活率的影响示意图；

图3为本发明实施例3中的黑茶水提物对盲肠结扎穿孔致脓毒症小鼠7天的影响示意图；

图4为本发明实施例3中的黑茶多糖提取物对LPS诱导巨噬细胞程序性坏死的影响示意图；

图5为本发明实施例3中的黑茶多糖提取物对LPS诱导巨噬细胞程序性坏死的影响示意图；

图6为本发明实施例3中的黑茶多糖提取物对LPS诱导巨噬细胞程序性坏死的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 黑茶水提物的制备

取安化茯砖茶(购自湖南梅山崖安化黑茶研发中心，产地是湖南安化)100g去尘净化，粉碎过60目筛，黑茶：水＝1:10(重量比)，加蒸馏水80℃水浴中浸提30min，形成黑茶提取物浸提液；

(2)、过滤：

将黑茶提取物浸提液，先用纱布进行粗滤，得粗滤液，重复提取过滤3次，合并粗滤液；

(3)、静置：

将粗滤液经旋转蒸发仪60℃减压蒸馏浓缩，浓缩至原体积的1/3，然后置于4℃冰箱静置12小时；

(4)、精滤：

取上清液，经离心机离心分离，以除去沉淀及悬浮物，得黑茶水提取物精滤液；

(5)、浓缩：

精滤液再进行减压浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至原体积的1/2；

(6)、干燥：

浓缩液经冻干机干燥，得黑茶水提取物18.75g。

经检测分析，本发明的黑茶水提取物中包含茶多糖、茶多酚、茶黑素等多种成分。

实施例2 黑茶多糖提取物的制备

(1)、提取

取安化茯砖茶(购自湖南梅山崖安化黑茶研发中心，产地是湖南安化)100g去尘净化，粉碎过60目筛，黑茶：水＝1:10(重量比)，加蒸馏水80℃水浴中浸提30min，形成黑茶提取物浸提液；

(2)、过滤：

将黑茶提取物浸提液，先用纱布进行粗滤，得粗滤液，重复提取过滤3次，合并粗滤液；

(3)、静置：

将粗滤液经旋转蒸发仪60℃减压蒸馏浓缩，浓缩至原体积的1/3，然后置于4℃冰箱静置12小时；

(4)、精滤：

取上清液，经离心机离心分离，以除去沉淀及悬浮物，得黑茶水提取物精滤液；

(5)、萃取：

按体积比1:1进行2次二氯甲烷萃取，按体积比1:1进行3次乙酸乙酯萃取，按体积比1:1进行3次异丙醇萃取；

(6)、浓缩：

将萃取后的水层用旋转蒸发仪60℃进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/2，除去有机溶剂。

(7)、干燥：

浓缩液经冻干机干燥，得黑茶多糖提取物11.07g。

经检测分析，以葡萄糖标准品为对照测得多糖提取物中多糖含量为32.88％.

实施例3 动物实验

一、黑茶提取物对LPS诱导的小鼠脓毒症治疗作用实验

(1)、药物黑茶提取物(分别由实施例1、实施例2制备获得)给药剂量(以黑茶提取物计算)是：黑茶水提取物500mg/kg、黑茶多糖提取物500mg/kg。

(2)、动物SPF级屏障系统饲养的ICR雄性小鼠，6-7周龄，体重20±2g。置于干燥清洁的的塑料笼具内，标准实验动物饲料饲养，自由进水进食。

(3)、实验方法动物按体重随机分组，每组10只。实验设空白对照组、LPS对照组、黑茶水提物给药组和黑茶多糖给药组。

腹腔注射40mg/kgLPS前3天，黑茶水提物给药组和黑茶多糖给药组连续灌胃给药500mg/kg3天，腹腔注射LPS后继续给药500mg/kg3天。空白对照组和LPS对照组按0.2ml/20g同时给予蒸馏水。

(4)、观察指标每8小时观察记录一次小鼠的状态和存活情况，并计算小鼠7天的存活率。

(5)、结果

表1 黑茶各提取物对LPS诱导的脓毒症7d存活率的影响(

n＝10)

与单纯照射组相比，*为P＜0.05，**为P＜0.01

结果表明，LPS腹腔注射8h后，发现小鼠活动和进食均逐渐减少、四肢无力、蜷缩发抖、反应迟钝、竖毛、双眼发炎且分泌物增多及粘液便等症状。如图1,2所示，小鼠的死亡时间主要集中在腹腔注射LPS后24h-48h，LPS对照组小鼠在此区间死亡达8只，96h后LPS对照组小鼠全部死亡，而黑茶水提取组和黑茶多糖组小鼠7d后分别有4、和3只存活。而且与LPS对照组相比，两组给药组小鼠的平均存活时间明显延长。由上表可见，黑茶水提物和黑茶多糖对LPS诱导的脓毒症小鼠均有一定的治疗作用。

二、黑茶提取物对盲肠结扎穿孔致小鼠脓毒症治疗作用实验

(1)、药物 黑茶提取物给药剂量(以黑茶提取物计算)是：黑茶水提取物(实施例1制备)500mg/kg。

(2)、动物 SPF级屏障系统饲养的ICR雄性小鼠，6-7周龄，体重20±2g。置于干燥清洁的的塑料笼具内，标准实验动物饲料饲养，自由进水进食。

(3)、实验方法 动物按体重随机分组，每组12只。实验设假手术对照组、手术对照组和黑茶水提物给药组。手术前3天，黑茶水提物给药组连续灌胃给药3天，手术后继续给药3天。假手术对照组和手术对照组按0.2ml/20g同时给予蒸馏水。

(4)、观察指标 每8小时观察记录一次小鼠的状态和存活情况，并计算小鼠7天的存活率。

(5)、实验结果

表2 黑茶提取物对CLP致脓毒症小鼠7d的存活率的影响(

n＝12)

与单纯照射组相比，*为P＜0.05，**为P＜0.01

如图3所示，小鼠盲肠结扎2h后逐渐苏醒，随后发现小鼠活动和进食均减少、四肢无力、反应迟钝、竖毛、粘液便等症状。小鼠的死亡时间主要集中在手术后24h-48h，手术对照组小鼠在此区间死亡达7只，黑茶水提物给药组小鼠仅有4只死亡，而假手术对照组小鼠7d均未死亡。与手术对照组相比，黑茶水提物给药组小鼠的平均存活时间明显延长且存活率提高达25％。由表2可见，黑茶水提物对CLP致脓毒症有一定的治疗作用。

三、细胞实验

(1)、实验动物SPF级屏障系统饲养的ICR雄性小鼠，体重23-24g。置于干燥清洁的的塑料笼具内，标准实验动物饲料饲养，自由进水进食。

(2)骨髓细胞诱导巨噬细胞：

取ICR雄性小鼠20只，质量在23-24g间，颈椎脱臼处死，于75％的酒精溶液中浸泡(5-10min)消毒灭菌，在无菌的条件下取小鼠的所有股骨，踢出全部肌肉组织，剪去股骨头，梅花头一端用2.5ml无菌注射器刺穿，用预冷的含2％胎牛血清的PBS反复冲洗骨髓腔，直至股骨变为白色(至少冲洗5遍)，3-5ml/只，混合所有冲洗液，用无菌200目过滤网布过滤，4℃离心1500r/min5min，用0.075mol/LKCL低渗溶液破除其中的红细胞，用预冷的含2％胎牛血清的PBS冲洗两遍，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调节细胞浓度至2×10⁶/ml。在细胞悬液中加入诱导因子M-CSF，使其浓度为20ng/ml。将细胞悬液转移至培养皿中，置于37℃、5％CO₂饱和湿度细胞培养箱中培养。3天换一次液，继续用含诱导因子的培养液培养。

(3)瑞氏染色检测巨噬细胞的纯度：

细胞培养至第7天，取部分细胞消化、离心和重悬，取细胞悬液1滴加于洁净载玻片上，制备涂片，自然干燥，瑞氏染色后将干燥好的涂片置光学显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片体尾交界处细胞薄厚分布及染色情况，再用油镜计数细胞，计算巨噬细胞的纯度。

(4)LPS诱导巨噬细胞程序性坏死：

①、细胞预处理：

将鉴定过的巨噬细胞消化、离心、重悬和计数，按8×10³/孔接种于96孔板(每孔180μl)和1×10⁶/孔接种于24孔板(每孔500μl)中，于37℃、5％CO₂饱和湿度细胞培养箱培养24h。24h后，细胞给药前30min加10μlLPS(终浓度为10μg/ml)诱导其程序性坏死，然后给予10μl不同浓度的黑茶多糖提取物(实施例2制备)药物，空白给予等体积培养基，使每组终浓度分别1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1mg/ml，每组做5个平行复孔，于37℃、5％CO₂饱和湿度细胞培养箱继续培养24h。

②、MTT检测：

将96孔板中每孔培养液吸走20μl，每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。用移液器将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走；每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值(OD值)，结果如图4所示。

③、凋亡试剂盒检测：

将24孔板中加LPS和黑茶多糖药物培养24小时的巨噬细胞消化置于1.5mlEP管中并离心，并用PBS缓冲液和BandingBuffer稀释液各冲洗一次，然后用BandingBuffer稀释液重悬至细胞浓度为1-5×10⁶个/ml；吸取100μl细胞悬液置于新EP管中，加入5μl荧光标记的Annexin-V至细胞悬液中，室温下孵育10-15min；将细胞进行离心处理，并用BandingBuffer稀释液洗涤一次，离心后用200μl的BandingBuffer稀释液重悬，然后加入5μl的PI染液；20min后，用流式细胞仪检测巨噬细胞的程序性坏死率，结果见图5，注：PI：氧化丙啶核染料能透过死细胞(与AnnexinV匹配使用可将早晚期的细胞和死细胞区分)；AnnexinV：荧光探针标记凋亡细胞；CDT：黑茶多糖的简称。

(5)、观察指标：

给药24h后，用MTT法测定96孔板中巨噬细胞的存活情况，运用细胞凋亡试剂盒和流式细胞测定仪测定24孔板中巨噬细胞的坏死情况。

(6)、实验结果：

表3 黑茶多糖提取物对LPS诱导的巨噬细胞程序性坏死影响的MTT实验结果

*为P＜0.05，**为P＜0.01

表4 黑茶多糖对LPS诱导的巨噬细胞程序性坏死影响的流式实验结果

*为P＜0.05，**为P＜0.01

经瑞士染液鉴定，M-CSF诱导的骨髓细胞成巨噬细胞，巨噬细胞所占比例达98％以上。由表3,4可见，巨噬细胞给予高浓度的LPS后发生程序性坏死，给予不同浓度的黑茶多糖，观察巨噬细胞的存活情况。如图6所示(注：Nec-1:细胞程序性坏死抑制剂)，MTT实验发现，黑茶多糖提取物可抑制LPS诱导的巨噬细胞的程序性坏死，并呈现浓度依赖性。利用流式实验进一步证明黑茶多糖对LPS诱导的细胞程序性坏死有保护作用。

实施例4 黑茶提取物的制备例

按照实施例1方法，取安化茯砖茶(购自湖南梅山崖安化黑茶研发中心，产地是湖南安化)去尘净化，黑茶：水＝1:10，加蒸馏水沸水浴中浸提60min，形成黑茶提取物浸提液；将黑茶提取物浸提液，先用纱布进行粗滤，得粗滤液，重复提取过滤3次，合并粗滤液；将粗滤液置于4℃冰箱静置24小时；取上清液，经离心机离心分离，以除去沉淀及悬浮物，得黑茶提取物精滤液；精滤液进行减压浓缩，浓缩温度为60－70℃；浓缩液经冻干机干燥，得黑茶水提物。

制备例1(胶囊剂)

称取上述黑茶提取物200g，虎杖苷40g、淀粉50g、混合均匀，制粒，干燥，整粒，装入胶囊制成1000粒，即得。每次2粒，每日3次。

制备例2(片剂)

称取上述黑茶提取物200g，虎杖苷40g、淀粉50g、混合均匀，制粒，干燥，整粒，压片，制成1000粒，即得。每次2粒，每日3次。

制备例3(口服液)

(1)提取：取安化茯砖茶去尘净化，粉碎过60目筛，黑茶：水＝1:10，加蒸馏水沸水浴中浸提30min，形成黑茶提取物浸提液；

(2)、过滤：将黑茶提取物浸提液，先用纱布进行粗滤，得粗滤液，重复提取过滤3次，合并粗滤液；

(3)、静置：将粗滤液置于4℃冰箱静置12小时；

(4)、精滤：取上清液，经离心机离心分离，以除去沉淀及悬浮物，得黑茶提取物精滤液；

(5)、浓缩：精滤液进行减压浓缩，浓缩温度为60－70℃，浓缩到一定的程度加入一定比例的虎杖苷，再加入矫味剂和防腐剂，制备成口服液，使每毫升含有提取前的黑茶0.3g,分装20ml/瓶，每天一瓶。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种黑茶提取物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述黑茶提取物为黑茶水提物或黑茶多糖提取物；

所述黑茶多糖提取物的制备方法为将黑茶粉碎过筛后，加蒸馏水浸提，过滤后取滤液减压蒸馏浓缩，精滤后使用有机溶剂萃取滤液，取水相减压蒸馏浓缩，冷冻干燥后即得黑茶多糖提取物；

所述有机溶剂萃取为按体积比1:1进行2次二氯甲烷萃取，按体积比1:1进行3次乙酸乙酯萃取，按体积比1:1进行3次异丙醇萃取；

所述黑茶水提物或黑茶多糖提取物的给药剂量为200-1000mg/kg。

2.根据权利要求1所述黑茶提取物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述黑茶水提物的制备方法为将黑茶粉碎过筛后，加蒸馏水浸提，过滤后取滤液减压蒸馏浓缩1～2次，冷冻干燥即得黑茶水提物。

3.根据权利要求2所述黑茶提取物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述黑茶与蒸馏水的重量比为1:5-1:20，所述滤液减压蒸馏浓缩至原体积的1/3-1/10。

4.根据权利要求1所述黑茶提取物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述黑茶水提物或黑茶多糖提取物的给药对象为哺乳动物。

5.根据权利要求1所述黑茶提取物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述黑茶水提物或黑茶多糖提取物的给药对象为小鼠或人。

6.一种包含黑茶提取物的药物组合物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物由如权利要求1所述黑茶提取物、虎杖苷以及辅料制成，其中所述黑茶提取物与虎杖苷的重量比为3:1-6:1。

7.根据权利要求6所述的包含黑茶提取物的药物组合物在制备治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物为胶囊剂、片剂或口服液。

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