CN111514174A

CN111514174A - 一种沙棘果结合态多酚的提取方法及其应用

Info

Publication number: CN111514174A
Application number: CN202010348459.6A
Authority: CN
Inventors: 武海丽; 李卓玉; 张颖; 崔米米; 李汉卿; 单树花; 史江颖
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: CN111514174B

Abstract

本发明提供了一种沙棘果结合态多酚的提取方法，包括以下步骤；S1、取新鲜的沙棘果适量榨汁备用；S2、配制乙醇溶液，搅拌均匀后离心，弃上清液，收集残渣，重复进行1～2次；S3、将S2中收集的残渣中加入NaOH碱水解液，并调节溶液的pH至中性；S4、将S3中制备的溶液离心萃取，即得到结合态多酚提取液；S5、将S4中得到的提取液旋转蒸发，得到结合态多酚样品，本发明从沙棘果中的提取结合态多酚，并对结合态多酚在增强免疫力方向和抗肿瘤活性方向进行了实验比较，发现沙棘果结合态多酚的增加免疫力功效和抗肿瘤活性显著，使得本发明中提取的结合态多酚在新型特殊医药食品及保健食品的应用方向上具有使用前景，便于沙棘果和结合态多酚的开发利用。

Description

一种沙棘果结合态多酚的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于结合态多酚的提取方法技术领域，具体涉及一种沙棘果结合态多酚的提取方法及其应用。

背景技术

沙棘，又称醋柳，为胡颓子科沙棘属多年生落叶灌木或小乔木。中国作为沙棘的原产地，世界上90％以上的沙棘资源分布在中国，在中国的野生沙棘资源的70％以上则分布在山西。我国在很早之前就已经开始研究和使用沙棘，古典藏药著作《四部医典》也有其在治疗疾病方面的记载。在1977年沙棘被列入了《中华人民共和国药典》。沙棘作为药食同源植物，其营养成分主要有蛋白质，糖类，维生素，黄酮和微量元素等。研究表明，沙棘具有抗氧化，抗炎，抗病毒，抗癌及保护心血管的作用。基于此，沙棘这一资源的深度开发和有效利用具有潜在的经济和社会价值。

沙棘多酚作为其中的生物活性物质之一，在沙棘果、沙棘叶和沙棘籽中均有分布，并且含量高，种类多，包括异鼠李素，槲皮素，山奈酚和黄酮醇等等。与现有的研究进展相比，目前对于沙棘果多酚的研究多集中在有机相方面，而且沙棘果水溶性结合态多酚的提取及增强免疫力方面和抗肿瘤方面的研究还比较少，影响沙棘果价值的全面开发利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种沙棘果结合态多酚的提取方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种沙棘果结合态多酚的提取方法，包括以下步骤；

S1、取新鲜的沙棘果适量，清洗干净后榨汁制成沙棘果汁备用；

S2、按照沙棘果和乙醇的重量体积比为1g：10～15mL的量量取乙醇溶液，乙醇溶液的浓度为80％，-18～-22℃下预冷，然后将乙醇溶液加入S1中制好的沙棘果汁中，搅拌均匀后离心，搅拌离心的时间为10-30min，弃上清液，收集残渣，重复进行1～2次；

S3、将S2中收集的残渣中加入2M的NaOH碱水解液，在室温下充分搅拌至残渣完全消化，残渣消化时间为1.5-2h，然后加入适量的浓盐酸溶液调节溶液的pH至中性；

S4、将S3中制备的溶液离心，离心速度为11000rpm，离心时间为7min，离心后取上清液弃沉淀，然后在上清液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，且重复萃取4-5次后离心取下层水相，即得到结合态多酚提取液；

S5、将S4中得到的结合态多酚提取液在45-50℃下旋转蒸发，除去残留有机溶剂，然后在真空冷冻干燥水溶液至形成粉末，即得到结合态多酚样品。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明从沙棘果中的提取了结合态多酚，并对提取的结合态多酚在提高免疫力方向抗肿瘤活性方向进行了实验比较，发现沙棘果结合态多酚能有效的提高免疫力，同时在抗肿瘤活性方向显著提高，使得本发明中提取的结合态多酚在新型特殊医药食品及保健食品的应用方向上具有广泛的使用前景，便于沙棘果的开发利用，也便于结合态多酚的开发使用。

附图说明

图1是本发明实施例中的测定光密度值的标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，本发明提供一种技术方案：一种沙棘果结合态多酚的提取方法，包括以下步骤；

S1、取新鲜的沙棘果50g，清洗干净后榨汁制成沙棘果汁备用；

S2、量取500mL，浓度为80％的乙醇溶液，-20℃下预冷，然后将乙醇溶液加入S1中制好的沙棘果汁中，于室温中搅拌25min，然后在离心速度为5000rpm的离心机上离心10min，然后弃上清液，收集残渣，将收集到的残渣再次进行同样的乙醇溶液同样的搅拌离心条件下再处理一次，得到残渣后收集；

S3、将S2中收集的残渣中加入50mL的2M的NaOH碱水解液，在室温下充分搅拌至残渣完全消化，具体为利用磁力搅拌器搅拌1.5h至残渣完全消化，然后加入适量的浓盐酸溶液调节溶液的pH，调至容易pH至中性；

S4、将S3中制备的溶液再次离心，离心机的离心速度为11000rpm，离心7min，离心后取上清液弃沉淀，然后在上清液中加入与上清液体积相等的乙酸乙酯萃取，且重复萃取4次，然后收取下层水相，即得到结合态多酚提取液；

S5、将S4中得到的结合态多酚提取液在50℃下旋转蒸发，除去残留有机溶剂，然后在真空冷冻干燥水溶液至形成粉末，即得到结合态多酚样品，并将样品在4℃环境下保存。

水相结合多酚的含量是乙酸乙酯相的4倍左右，且其抗肿瘤活性相比有机相中的更为显著，水相中结合多酚对HeLa、HepG2、MCF-7细胞的半抑制浓度IC50值均约为70.00±2.46μg/mL，对HCT116细胞的半抑制浓度IC50值为18.50±1.28μg/mL。而乙酸乙酯相中结合多酚对HepG2、MCF-7、结肠癌细胞Caco-2的半抑制浓度分别为0.85±0.07～3.31±0.22mg/mL、0.58±0.03～2.05±0.16mg/mL、10.57±0.55～14.97±0.59mg/mL，即可得到乙酸乙酯相中结合多酚的HC₅₀值远远高于水相结合多酚的。进而可知水相中含有更多的生物活性成分，且作用效果更好。

实施例2，本发明提供一种技术方案：一种沙棘果结合态多酚的提取方法，包括以下步骤；

S2、量取750mL乙醇溶液，乙醇溶液的浓度为80％，-18℃下预冷，然后将乙醇溶液加入S1中制好的沙棘果汁中，搅拌均匀后离心，搅拌离心的时间为20min，弃上清液，收集残渣；

S3、将S2中收集的残渣中加入2M的NaOH碱水解液，在室温下充分搅拌至残渣完全消化，残渣消化时间为2h，然后加入适量的浓盐酸溶液调节溶液的pH至中性；

S4、将S3中制备的溶液离心，离心速度为11000rpm，离心时间为7min，离心后取上清液弃沉淀，然后在上清液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，且重复萃取5次后离心取下层水相，即得到结合态多酚提取液；

S5、将S4中得到的结合态多酚提取液在45℃下旋转蒸发，除去残留有机溶剂，然后在真空冷冻干燥水溶液至形成粉末，即得到结合态多酚样品。

实施例3，本发明提供一种技术方案：一种沙棘果结合态多酚的提取方法，包括以下步骤；

S2、量取600mL浓度为80％的乙醇溶液，-22℃下预冷，然后将乙醇溶液加入S1中制好的沙棘果汁中，搅拌均匀后离心，搅拌离心的时间为30min，弃上清液，收集残渣，重复进行2次；

S3、将S2中收集的残渣中加入2M的NaOH碱水解液，在室温下充分搅拌至残渣完全消化，残渣消化时间为1.8h，然后加入适量的浓盐酸溶液调节溶液的pH至中性；

S5、将S4中得到的结合态多酚提取液在50℃下旋转蒸发，除去残留有机溶剂，然后在真空冷冻干燥水溶液至形成粉末，即得到结合态多酚样品。

然后对实施例1-3中得到的样品中的水溶性结合态多酚含量进行测定，测定方法如下：

具体为先用超纯水溶解冻干的结合态多酚粉末，再用福林酚比色法，以没食子酸为标准品测定酸枣仁水溶性多酚含量，其中标准液的浓度梯度分别为：0，4，12，20，30，40，60，80，100，120μg/mL；

加入100μL标准液或多酚样品，400μL去离子水到试管中，再加入100μL福林酚试剂混匀静置，反应6min，随后各个试管中加入800μL的超纯水和1mL的7％的Na2CO3溶液混匀静置60min，于760nm波长处测定光密度值(OD)，以吸光值为横坐标，没食子酸量(μg)为纵坐标做标准曲线，如图1所示，通过标准曲线计算样品中多酚的含量。

测定结果表明：实施例1中的提取方法在50g新鲜沙棘果中提取到的水溶性结合态多酚的质量约为77.47±1.21mg；实施例2中的提取方法在50g新鲜沙棘果中提取到的水溶性结合态多酚的质量约为62.34±2.45mg；实施例3中的提取方法在50g新鲜沙棘果中提取到的水溶性结合态多酚的质量约为71.35±0.82mg。

对比发现实施例1的方法在新鲜沙棘果中提取到的水溶性结合态多酚数量最多，为最优实施例。

实施例4，对沙棘果中得到的水溶性结合态多酚进行实验测试：

1、动物免疫力增强实验测试，具体过程如下：

实验动物：清洁级ICR小鼠，体重18.0-22.0克，单一性别，每个剂量10只，由山西医科大学实验动物中心提供(动物生产许可证号：SCXK(晋)2015-0001号)。

饲养环境：室温：20-22℃，相对湿度：48-58％(小鼠在山西省疾病预防控制中心毒理科清洁级动物房饲养，动物实验室许可证号：SYXK(晋)2015-0002)。

实验方法：按卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)第二部分“功能学检验方法”增强免疫力功能检验方法操作。

实验设剂量为0、146、438、876mg/kg(涵盖了人体推荐量的10倍)，经口一次灌胃，灌胃体积为10mL/kg.bw，连续30天，必要时可延长至45天。小鼠自由饮食，染毒后观察动物的一般状况，中毒症状和死亡情况，记录中毒症状出现、消失、死亡的时间和每周的体重。

结果判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨嗜细胞功能、NK活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。其中细胞免疫功能项目(迟发型变态反应实验和小鼠脾淋巴细胞转化实验)中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能项目(抗体生成细胞实验和半数溶血值实验)中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨嗜细胞功能测定项目(小鼠碳廓清实验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验)中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨嗜细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。

2、迟发型变态反应实验、半数溶血值(HC₅₀)、脏器/体重比值及抗体生成细胞的测定；

采用雄性小鼠，实验剂量如实施例2中所示有4组，每组10只小鼠，给予受试物沙棘果水溶性结合态多酚第35天后，每只小鼠腹腔注射0.2mL的2％的SRBC。

1)、迟发型变态反应实验：

上述小鼠继续给予沙棘果水溶性结合态多酚至39天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL，注射后于24h后测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值。若受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项试验结果阳性。

攻击前后足趾厚度差值(mm)＝攻击后足趾厚度-攻击前足趾厚度。

沙棘果结合态多酚中、高剂量组诱导的小鼠足跖厚度差值与对照组相比，差异有统计学意义(p<0.05)，表明沙棘果结合态多酚对迟发型变态反应能力具明显促进能力，结果见下表。

注：*与对照组相比p<0.05。

给予小鼠沙棘果水溶性结合态多酚第40天，同时进行半数溶血值(HC₅₀)、脏器/体重比值及抗体生成细胞的测定。

2)、半数溶血值(HC₅₀)的测定：

摘除眼球后取血于离心管中，2000r/min离心10min收集血清，用SA缓冲液将其稀释250倍。试管内加入1mL稀释的血清，并依次加入10％(v/v)SRBC0.5mL和1mL的补体(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置于37℃恒温水浴锅中保温20min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取1mL上清，加3mL都氏试剂为样品管，同时另取0.25mL10％(v/v)SRBC加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白测定各管光密度值。若受试样品组的HC₅₀显著高于对照组HC₅₀，则该项实验结果阳性。

沙棘果结合态多酚低、中、高剂量组的半数溶血值均高于对照组，且差异有统计学意义(p<0.05)，表明该项实验为阳性，结果见下表。

注：*与对照组相比p<0.05。

3)、脏器指数胸腺指数和脾指数的测定：同时取出取血之后小鼠的脾脏、胸腺，分别称出脾脏、胸腺重量，记录其体重并计算脏器与体重的比值。

沙棘果水溶性结合态多酚各剂量组脾指数、胸腺指数与对照组相比，差异均无统计学意义，结果见下表。

4)、抗体生成细胞的测定：

取出称好后的脾脏，放在盛有200目筛网及Hank’s液的平底皿内，用镊子轻轻磨碎，制成细胞悬液。用Hank’s液洗3次，每次1000r/min离心10min，最后将细胞悬浮于5mLRPMI1640培养液中，并调整细胞浓度为5×10⁶个/mL。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至500mL)加热溶解，45℃水浴保温，与等量pH为7.2的2倍浓度Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，加入50μL10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)，20μL脾细胞悬液(5×10⁶个/mL)，迅速混匀，倒入60mm小皿中，放入二氧化碳培养箱中培养1h，加入用SA缓冲液稀释的补体(1:10)，继续培养1h，计数溶血空斑数。结果用空斑数/10⁶脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，则该项试验结果呈阳性。

沙棘果水溶性结合态多酚各剂量组溶血空斑数(x10³个/全脾)与对照组相比无显著性差异，表明沙棘果结合态多酚对抗体生成细胞没有促进作用，结果见下表。

3、采用半体内法来测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，具体过程如下：

采用雄性小鼠，实验剂量如实施例2中所示，共有4个剂量组，每组10只小鼠，给予受试物沙棘果水溶性结合态多酚31天后，实验前4天，每只鼠腹腔注射2％压积羊血红细胞0.2mL，使得小鼠巨噬细胞激活。用颈椎脱臼处死动物，经腹腔注入2mL生理盐水，手指轻轻按揉腹腔1min，以充分洗出腹腔巨噬细胞，正中剪开腹壁皮肤，吸出1mL腹腔洗液，用1mL加样器吸取腹腔洗液0.5mL，加于盛有0.5mL1％鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器吸取0.5mL混合液加入放入玻片的琼脂圈内，于37℃孵箱温育30min后，立即用生理盐水漂洗未贴壁的细胞，以1：1丙酮甲醇溶液固定1min，4％Giemsa染色10min，用蒸馏水冲洗干净，晾干。用显微镜计数巨噬细胞，每张片计数100个，计算吞噬百分率和吞噬指数。受试样品组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较，差异均有显著性，则可判定该项实验结果呈阳性。

沙棘果水溶性结合态多酚各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬百分率和吞噬指数与对照组相比，均无显著性差异(p>0.05)，结果见下表。

4、实验动物小鼠碳廓清吞噬指数测试，具体过程如下：

采用雄性小鼠，实验剂量如实施例2中所示有4组，每组10只小鼠，给予受试物沙棘果水溶性结合态多酚31天后，尾静脉注射4倍稀释的印度墨汁(0.1mL/10g·BW)，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从眼内眦取血20μL，并立即加入到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中，在600nm处测定各管的光密度值(OD)，以Na₂CO₃溶液作空白对照。将小鼠处死，另取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重，计算吞噬指数。若受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，则判定该项实验结果阳性。

沙棘果结合态多酚中、高剂量组的小鼠碳廓清吞噬指数与对照组相比有显著性差异(p<0.05)，在一定范围内，体内碳颗粒被清除速率与血碳浓度呈指函数关系，表明沙棘果结合态多酚对小鼠碳廓清能力具有提高作用，结果见下表。

注：*与对照组相比p<0.05。

5、采用雌性小鼠，实验剂量有4组，每组10只小鼠，给予受试物沙棘果水溶性结合态多酚44天后，进行NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法)和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)。

1)、采用乳酸脱氢酶测定法，进行NK细胞活性测定，具体过程如下：

试验前24h将靶细胞YAC-1细胞进行传代培养，用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。小鼠在超净工作台中无菌取脾，置于盛有200目筛网及适量无菌Hank’s液平底皿内，用镊子轻轻磨碎脾脏，制成单细胞悬液。1000r/min离心10min,1×Hank’s液洗3遍，弃上清，将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20s,裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液,1000r/min离心10min,用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重新悬浮细胞，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚蓝染色计数活细胞数(应在95％)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μL，均设三个平行孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μL置96孔培养板中，同时加入100μLLDH基质液，反应10min，每孔加入30μL1mol/L的盐酸溶液，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)，计算NK细胞活性。若受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组NK细胞活性，则判定该项实验结果阳性。

沙棘果结合态多酚各剂量组均能提高NK细胞活性，且低、中剂量组与对照组相比具有显著性差异(p<0.05)，表明沙棘果结合态多酚对NK细胞活性有促进作用，结果见下表。

注：*与对照组相比p<0.05。

2)、采用MTT法，进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，具体过程如下：

将上述脾脏细胞悬液调整细胞浓度为3×10⁶个/mL并加入24孔培养板，每孔1mL，一孔设为对照，另外3孔，分别加入75μL(75μg/mL)，125μL(125μg/mL)和150μL(150μg/mL)的ConA液，置5％CO2，37℃孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mLDMSO，震荡混匀，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪570nm波长处测定光密度值(OD)，计算光密度差值。若受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，则可判定该项实验结果阳性。

沙棘果结合态多酚中、高剂量组小鼠脾淋巴细胞转化差值明显高于对照组相，且差异有统计学意义(p<0.05)，表明沙棘果结合态多酚能够促进小鼠脾淋巴细胞转化，结果见下表。

注：*与对照组相比p<0.05。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种沙棘果结合态多酚的提取方法，其特征在于：包括以下步骤；

S2、按照沙棘果和乙醇的重量体积比为1g：10～15mL的量量取乙醇溶液，-18～-22℃下预冷，然后将乙醇溶液加入S1中制好的沙棘果汁中，搅拌均匀后离心，弃上清液，收集残渣，重复进行1～2次；

S3、将S2中收集的残渣中加入2M的NaOH碱水解液，在室温下充分搅拌至残渣完全消化，然后加入适量的浓盐酸溶液调节溶液的pH至中性；

S4、将S3中制备的溶液离心，离心后取上清液弃沉淀，然后在上清液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，且重复萃取4-5次后离心取下层水相，即得到结合态多酚提取液；

2.根据权利要求1所述的一种沙棘果结合态多酚的提取方法，其特征在于，在S1中，所述乙醇溶液的浓度为80％，搅拌离心的时间为10-30min。

3.根据权利要求1所述的一种沙棘果结合态多酚的提取方法及，其特征在于，在S3中，所述残渣消化时间为1.5-2h。

4.根据权利要求1所述的一种沙棘果结合态多酚的提取方法，其特征在于，在S4中，所述离心速度为11000rpm，离心时间为7min。

5.根据权利要求1-4所述的任一方法提取的沙棘果结合态多酚的应用，其特征在于，该结合态多酚具有增强免疫力和抗肿瘤的功效，应用在医药食品及保健食品中。