CN101638444A - 海滨锦葵多糖制备工艺及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化分离技术领域，具体涉及海滨锦葵多糖的制备工艺及用途，本发明从海滨锦葵中分离、纯化锦葵多糖工艺，从新鲜海滨锦葵根、得干粉，超声，乙醇沉淀，三氯乙酸去蛋白，DEAE－柱层析，sephacryl－200再层析。共得到四个组分JKDT－2B、JKDT－3A、JKDT－3B、JKDT－3C。该产品可制成片剂、口服液、胶囊作为保健品给免疫低下者使用。还可进一步制成治疗肿瘤的药品。
Description
一.技术领域
本发明属于生化分离技术领域，具体涉及从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺及用途。
二.背景技术
海滨锦葵(kostelezkya virginica)是锦葵科锦葵属多年生宿根盐生植物，天然分布于美国东部沿海盐沼海岸带。1992年由南京大学引种至中国。有文献报道，海滨锦葵的花、叶、根部可食用。尤其是根部可生食、可烹炸、可作茶饮，焙干碾碎可用作糖果和口香糖原料，以增加胶粘度。根部浸出液可浓缩至蛋清状替代蛋清使用。多糖在生物界分布很广，从其他动植物中分离制备多糖的研究方法有不少论文和专利。但从海滨锦葵中提取锦葵多糖以及对锦葵多糖的研究论文很少见到，专利至今未有。
根据我们的研究我们认为锦葵多糖是一种杂多糖，属多糖类。在锦葵根部含量丰富。从生物学实验证明，锦葵多糖具有增强免疫力的生物学功能。可作为人体非特异性免疫增强剂，促进体液免疫及细胞免疫，加强抗体或补体生成。该多糖可制成片剂、口服液、胶囊等作为保健食品给免疫低下者使用，促进他们的健康。也可进一步制成药品，供免疫低下或肿瘤病人辅助治疗使用。
三.发明内容
本发明需要解决的问题是从海滨锦葵的根中提取出锦葵多糖，并利用锦葵多糖的生物学功能将其制成片剂、胶囊、口服液等保健食品，供免疫力低下者使用。还可制成药品供病患者使用。
本发明技术方案
1.海滨锦葵多糖提取工艺：採集海滨锦葵新鲜根，洗净、晒干或烘干，粉碎。取干粉，按比例1∶15加入蒸馏水，用超声仪加温超声提取。超声条件：功率200瓦，温度60℃，时间1小时。超声后用纱布过滤。同样条件再重复一次；两次滤液合并。将滤液蒸发部分后，用乙醇沉淀，将沉淀干燥得粗多糖。将锦葵粗多糖加入适量水溶解后，加入等体积20％三氯乙酸，沉淀去除蛋白，离心得上清液，减压蒸馏后的浓缩液对水透析，透析后的溶液加乙醇沉淀，干燥，得去蛋白锦葵多糖(锦葵多糖：简称JKDT，以下同)溶液，简称为：JKDT-1。
从上步骤得到的JKDT-1用DEAE-纤维素柱层析，梯度洗脱，分别检测，得到洗脱液，合并有效组分，浓缩，乙醇沉淀，干燥，得组分JKDT-2A、JKDT-2B。得到的JKDT-2A组分再用sephcryl-200柱层析，纯化分离，得到三个组分，分别是JKDT-3A、JKDT-3B、JKDT-3C。根据实验结果，JKDT-2B用sephacryl-200层析后仍为一个峰，不需要再层析。因此锦葵多糖最后组分为四个，分别是：JKDT-2B、JKDT-3A、JKDT-3B、JKDT-3C。
2.锦葵多糖的生物学功能实验
锦葵多糖免疫活性试验
表1多糖对T细胞增殖的影响(培养24h)
P*＜0.05
表2多糖对B细胞增殖的影响(培养24h)
P*＜0.05
3.锦葵多糖的测定-酚-硫酸法。
本方法是用苯酚-硫酸试剂与锦葵多糖的己糖醛酸起反应，在490nm处产生特征性光吸收，以光吸收值大小参比标准曲线来确定锦葵多糖的含量。苯酚试剂：取苯酚200克，加铝片0.2克和NaHCO3 0.1克，蒸馏，收集180-182℃馏分称取15克，加蒸馏水溶解，定容于250ml容量瓶。取干燥的葡萄糖标准品，准确配制浓度为250μg/ml。分别取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8ml，放入试管，再分别补加蒸馏水至1.0ml，加入苯酚试剂1.0ml，再加入浓硫酸5.0ml，冷却后于490nm处测定光吸收值，以浓度对光吸收值作标准曲线。锦葵多糖同法配制25-200μg/ml范围内浓度，取1.0ml后再加入1.0ml苯酚试剂，5.0ml浓硫酸，冷却后测490nm处光吸收值，对照标准曲线计算锦葵多糖的含量。
本发明有益效果是使用了超声方法，并且采用中温度技术(60℃)，从海滨锦葵中第一次提取了锦葵多糖，并利用现有技术进行了纯化。从我们对模型动物的实验发现，锦葵多糖具有增强实验动物免疫力的功能。可制备成提高免疫功能的保健食品。通过进一步的实验和研究，锦葵多糖也可制备成治疗肿瘤的药物。
四.具体实施方式
取新鲜採集的海滨锦葵根，洗净、干燥、粉碎，取样200克干粉，以1∶15的比例加入蒸馏水，用超声仪超声抽提，抽提条件：温度60℃，超声功率200W，时间1小时，超声后用纱布过滤，滤渣再用上述条件处理一次。合并两次滤液，得4500ml，减压蒸发得860ml，加乙醇至最终浓度为70％，搅拌，得粘性沉淀，去上清，绸布过滤，沉淀50℃烘干，得锦葵多糖粗品10.2克。
取锦葵多糖粗品5.0克，加蒸馏水250ml，溶解后加入20％三氯乙酸250ml，冷藏于8℃冰箱冷藏，次日取上清，沉淀部分离心5000r/分，10分钟，合并得上清490ml，减压浓缩至50ml，装透析袋对水透析。除去三氯乙酸，得无蛋白锦葵多糖溶液194ml。
将按常规方法处理好的DEAE-纤微素，装柱后水洗至中性，取上述无蛋白锦葵多糖溶液94ml，加水一倍，上样；上样结束后，先用水洗涤两个床体积，再用0-1.0M NaCL洗脱锦葵多糖，经检测洗脱峰有两个，I峰收集120ml，II峰收集448ml，再分别浓缩至I峰60ml，II峰162ml；两峰浓缩液分别加入4倍体积95％乙醇沉淀多糖，放置4-6小时后，用砂芯漏斗抽滤，分次用无水乙醇脱水，50℃烘干。I峰得干品JKDT-2A53.6mg，II峰得JKDT-2B 362mg。
将JKDT-2A 53.6mg样品加水10ml溶解，上样于按常规处理并装好的sephacryl-200柱，经洗脱得到三个组分，经检测计算其含量分别是JKDT-3A1.16mg，JKDT-3B 3.95mg.JKDT-3C 8.3mg。
锦葵多糖含量纯度检查：酚-硫酸法。本方法是用苯酚-硫酸试剂与锦葵多糖的己糖醛酸起反应，在490nm处产生特征性光吸收，以光吸收值大小参比标准曲线来确定锦葵多糖的含量。苯酚试剂：取苯酚200克，加铝片0.2克和NaHCO3 0.1克，蒸馏，收集180-182℃馏分。称15克，加蒸馏水溶解，定容于250ml容量瓶。放入棕色瓶，冰箱保存备用。取干燥的葡萄糖标准品，准确配制浓度为250μg/ml。分别取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8ml，放入试管，再分别补加蒸馏水至1.0ml，加入苯酚试剂1.0ml，再加入浓硫酸5.0ml，冷却后于490nm处测定光吸收值，以浓度对光吸收值作标准曲线。锦葵多糖同法配制25-200μg/ml范围内浓度，取1.0ml后再加入1.0ml苯酚试剂，5.0ml浓硫酸，冷却后测490nm处光吸收值，对照标准曲线计算锦葵多糖的含量。
Claims (6)
1.一种从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺，其特征是探集海滨锦葵鲜根，洗净，烘干，粉碎，干粉中加入1∶15的蒸馏水，用超声仪超声提取，超声条件：温度60℃，功率200W，时间1小时，超声结束后，用两层纱布过滤，滤液存放，滤渣再用上述条件重复一次，两次滤液合并，减压蒸发，得浓缩液，加入乙醇使最终浓度为70％，搅拌后低温静置10-12小时，虹吸去上清，将沉淀抽滤，烘干，得锦葵多糖粗品。
2.根据权利1所述从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺，其特征是锦葵粗多糖产品，加适量蒸馏水溶解，加入等体积20％三氯乙酸，静置12小时以上，离心去沉淀，上清液为去蛋白多糖溶液，减压浓缩，再对蒸馏水透析去除三氯乙酸，得除蛋白锦葵多糖溶液。
3.根据权利2所述制备从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺，其特征是用DEAE-纤维素柱层析进行分离，上样液以合适浓度上样，洗脱液为0-1mol/L NaCL梯度，分部收集，用苯酚-硫酸法检测糖浓度，得到糖浓度-洗脱体积曲线，根据洗脱曲线辨别分离峰，分别合并有效洗脱部分，减压浓缩后用95％乙醇调乙醇最终浓度为80％，静置过夜，用砂芯漏斗抽滤多糖，再分别用95％乙醇、无水乙醇脱水，烘干，得锦葵多糖，锦葵多糖简称JKDT，两个组分分别是JKDT-2A、JKDT-2B。
4.根据权利3所述方法得到的JKDT-2A，其特征是进行sephacryl-200柱层析，柱层析后得JKDT-3A、JKDT-3B、JKDT-3C，根据以上方法，从海滨锦葵根中分离得到四个纯组分：分别是JKDT-2B、JKDT-3A、JKDT3B、JKDT-3C。
5.根据权利要求4所述方法制备的海滨锦葵多糖纯品在制备具有调节免疫功能的保健食品中的应用。
6.根据权利要求4所述方法制备的海滨锦葵多糖纯品在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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