CN104800240B - 一种纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米硒‑梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其以梭柄松苞菇多糖作为分散剂，利用梭柄松苞菇多糖提取过程中的废弃物(乙醇洗涤液)作为反应的还原剂，不但实现了废弃物的再次利用，而且该新型还原剂相对于维生素C等传统还原剂，具有更出色还原性能(纳米硒的粒径减小了23.8％)；(2)整个制备过程的反应条件温和，成本低廉，并且操作简单易于工业推广，所得纳米硒‑梭柄松苞菇多糖复合体的粒径仅为32.7nm，并且在存放60天后依然可以保持在62.7nm，具有非常好的生物可利用性及稳定性；(3)纳米硒‑梭柄松苞菇多糖复合体中的梭柄松苞菇多糖和纳米硒能够协同促进该复合体的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种对糖尿病治疗起作用的多糖复合体的制备方法，具体为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为临床特征的综合性代谢紊乱疾病。根据世界卫生组织在2014年公布的数据，全球糖尿病患者人数已经达到3.47亿。
由于糖尿病患者体内的氧化应激水平显著高于正常人，因此患者的肾脏、眼睛、心脏、血管和神经等组织极易受到氧化损伤，而诱发各种糖尿病并发症。糖尿病并发症也被认为是糖尿病对机体的主要危害。近期研究发现，摄入抗氧化剂能够显著缓解和修复糖尿患者机体内的氧化损伤病变，从而实现对糖尿病及其并发症的治疗。因此如何更有针对性地选择安全、高效和廉价的抗氧化剂来实现对糖尿病及其并发症的有效干预，成为现今科学研究的热点。
梭柄松苞菇是我国传统的名贵中药材，在《本草纲目》和《滇南本草》便对其有相关记载。它具有高蛋白、低脂肪和低能量的特性，因此是糖尿病患者非常理想的日常营养膳食补充。随着现代生物技术的深入研究，梭柄松苞菇的药用价值及其活性成分不断被发掘，其中梭柄松苞菇多糖被证明具有极强的抗糖尿病活性，能有效的降低糖尿病小鼠的血糖、血脂和机体氧化应激水平。
纳米硒是一种红色胶体状态单质硒，一般是利用还原剂还原亚硒酸钠而获得。它几乎没有毒性，同时比无机硒和有机硒更易吸收，并且表现出更高的抗氧化活性。已经被广泛的应用于糖尿病、心血管疾病和肿瘤的研究和治疗。而纳米硒的粒径、稳定性和生物活性往往受到还原剂性能的影响。现阶段，纳米硒制备过程中常采用的还原剂包括：维生素C、二丁基羟基甲苯和谷胱甘肽等。梭柄松苞菇醇提物是梭柄松苞菇多糖提取过程中，去除醇溶性物质的废弃物，然而研究发现梭柄松苞菇醇提物中富含黄酮和多酚等还原剂，其还原性能显著高于维生素 C和二丁基羟基甲苯，因此梭柄松苞菇醇提物具备成为新型还原剂的潜质。
研究发现，在液相中如果没有分散剂或稳定剂的存在下红色的纳米硒是十分不稳定的，并且极易聚集形成大颗粒(一般认为纳米硒的粒径与活性成负相关)，而失去生物活性和可利用性。而多糖具有复杂分支结构及活泼的羟基基团，可以将纳米硒吸附和包裹，使纳米硒更稳定地存在于液相体系中，并且由于多糖自身的生物活性，从而赋予了纳米硒-多糖复合体更丰富的生物特性。因此，如果能将具有强抗氧化活性的梭柄松苞菇多糖作为纳米硒的分散剂，它们所形成的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的抗氧化活性很可能会显著高于梭柄松苞菇多糖和纳米硒独表现出的抗氧化活性，这将对糖尿病的治疗产生更为积极效果。
值得注意的是多糖的分子量很可能对纳米硒-多糖复合体的理化性质有重要影响。前期研究发现梭柄松苞菇多糖中含有多个分子量组分，如果能以梭柄松苞菇多糖的不同分子量组分作为模版，阐明多糖的分子量与纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径之间的相关性，必将为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体以及其他纳米硒-多糖复合体的制备方法提供新的思路和参考。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种以梭柄松苞菇多糖作为分散剂，梭柄松苞菇醇提物作为还原剂的新型纳米硒-多糖制备方法，同时也为糖尿病的治疗提供新的干预手段。
本发明提供的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)样品预处理：依次进行清洁、切块和冷冻干燥，获得含水量低于5％的新鲜梭柄松苞菇样品；
(2)提取梭柄松苞菇多糖：依次将新鲜梭柄松苞菇样品进行粉碎、乙醇洗涤、水提取、乙醇沉淀、去除蛋白质和去除小分子物质的处理，从而获得梭柄松苞菇多糖；
(3)制备还原剂：将梭柄松苞菇多糖提取过程中的乙醇洗涤液冷冻干燥，获得固体粉末即为还原剂；
(4)制备纳米硒：利用制备好的还原剂，将亚硒酸钠还原成单质硒；
(5)制备纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体：利用多糖游离的羟基，对纳米硒表面进行修饰和包裹，形成稳定的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
进一步，作为优选，本发明还包括测定纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的抗糖尿病氧化应激活性，其利用STZ诱导的糖尿病小鼠作为动物实验模型，评价糖尿病小鼠在服用纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体后，对机体内的各生理指标的改善。
进一步，作为优选，所述步骤(1)样品预处理的具体操作为：
(a)清洁：用特制塑料刮片将适量新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，且不可用水清洗；
(b)切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个梭柄松苞菇均分为四块；
(c)冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5％的样品。
进一步，作为优选，所述步骤(2)样品预处理的具体操作为：
(a)、粉碎：将经预处理的梭柄松苞菇粉碎，过40目筛，即获得梭柄松苞菇粉末；
(b)、乙醇洗涤：将适量梭柄松苞菇粉末加入索氏提取装置，并按料液比 1∶10，加入95％的乙醇，80℃水浴回流抽提2h后，将混合液加入离心管离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，将上清液干燥，所得粉末即为该反应的还原剂；
(c)水提取：将经乙醇洗涤后，离心管中的沉淀样品干燥，并按料液比1∶20 与蒸馏水混合，超声波作用功率为150W，且使其每工作15min，暂停5min，提取温度80℃，提取时间2.5h，以上步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液；
(d)乙醇沉淀：将多糖提取液利用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，弃上清液，收集沉淀，冻干待用；
(e)去除蛋白质：按固液比1∶10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇粗多糖，随后加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心，且离心转速为 5000rpm，离心时间为5min，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该步骤 5次；
(f)去除小分子物质：将去除蛋白质的粗多糖提物，加入截留分子量为5000 的透析袋中，流水过夜，以去除小分子物质，再利用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，并加入4倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冻干保藏于-80℃冰箱待用。
进一步，作为优选，所述步骤(4)中制备纳米硒的具体操作为：
将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入5mL超纯水，再分别缓慢滴加入5mL不同浓度的梭柄松苞菇醇提物溶液及100mM的维生素C，常温反应24h后，将反应液置于透析袋中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒，其中，检测透析袋外有无亚硒酸钠的方法是，取少量透析袋外液体，滴加维生素C后液体不变红，则证明没有亚硒酸钠存在。
进一步，作为优选，所述步骤(5)制备纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的具体操作为：
将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入梭柄松苞菇多糖溶液，充分混匀后，缓慢滴加入5mL的梭柄松苞菇醇提物，常温反应24h后，将反应液置于相应规格的透析袋中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠和梭柄松苞菇多糖被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
此外，本发明还提供了一种对糖尿病氧化应激具有调节作用的多糖复合体，其特征在于，该多糖复合体是采用上述方法制备的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
本发明的有益效果：
(1)利用梭柄松苞菇多糖提取过程中的废弃物(乙醇洗涤液)作为反应的还原剂，不但实现了废弃物的再次利用，而且该新型还原剂相对于维生素C 等传统还原剂，具有更出色还原性能(纳米硒的粒径减小了23.8％)；
(2)整个制备过程的反应条件温和，成本低廉，并且操作简单易于工业推广，所得纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径仅为32.7nm，并且在存放60 天后依然可以保持在62.7nm，具有非常好的生物可利用性及稳定性；
(3)纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体中的梭柄松苞菇多糖和纳米硒能够协同促进该复合体的抗氧化活性。
具体实施方式
下面结合实验对本发明做进一步说明。
1.实验方案及结果
1.1样品
当地市场购买的新鲜梭柄松苞菇
1.2样品预处理
1.2.1清洁：用特制塑料刮片将适量新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除(如果用水清洗，会造成表面多糖的损失)。
1.2.2切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个梭柄松苞菇均分为四块。
1.2.3冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5％的样品。
1.3梭柄松苞菇醇提物的制备
1.3.1粉碎：将经预处理的梭柄松苞菇粉碎，过40目筛，即获得梭柄松苞菇粉末。
1.3.2乙醇洗涤：将适量梭柄松苞菇粉末加入索氏提取装置，并按料液比1∶10，加入95％的乙醇，80℃水浴回流抽提2h后，将混合液加入离心管离心(5000rpm， 5min)，将上清液干燥，所得粉末即为该反应的还原剂。
1.4梭柄松苞菇多糖的制备
1.4.1水提取：将经乙醇洗涤后，离心管中的沉淀样品干燥，并按料液比1∶20 (w∶v)与蒸馏水混合，超声波作用功率为150W(每工作15min，暂停5min)，提取温度80℃，提取时间2.5h，以上步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液。
1.4.2乙醇沉淀：将多糖提取液利用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心(5000rpm，5min)，弃上清液，收集沉淀，冻干待用。
1.4.3去除蛋白质：按固液比1∶10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇粗多糖，随后加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇(3∶1)，充分振荡30min后，离心(5000rpm， 5min)，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该步骤5次。
1.4.4去除小分子物质：将去除蛋白质的粗多糖提物，加入透析袋中(截留分子量为5000)，流水过夜，以去除小分子物质。再利用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，并加入4倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心(5000rpm，5min)，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冻干保藏于-80℃冰箱待用。
1.5纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的制备
1.5.1还原剂浓度的优化
①将5mL亚硒酸钠溶液(2mM)置于磁力搅拌器上，加入5mL超纯水，再分别缓慢滴加入5mL不同浓度的梭柄松苞菇醇提物溶液(0～9mg/mL)及 100mM的维生素C(对照)，常温反应24h后，将反应液置于透析袋(8kD)中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠被检测到(取少量透析袋外液体，滴加维生素 C后液体不变红，则证明没有亚硒酸钠存在)，所得透析袋内样品即为纳米硒。
②利用纳米粒度仪测定纳米硒的粒径，其中参数设置为：入射光为氦氖激光，波长λ为633nm，入射角为90°，测量温度为25℃。
结果：由表1可以看出，还原剂的浓度显著的影响着纳米硒的粒径(p＜0.05)，其中没有添加还原剂的阴性对照组，没有纳米硒粒子被检测到，由此可见还原剂对于纳米硒的制备是必不可少的。当添加了还原剂后，所有浓度的梭柄松苞菇醇提物均可将亚硒酸钠还原成纳米硒，其中梭柄松苞菇醇提物的浓度为7mg/mL 时，可以获得最小粒径的纳米硒(72.7nm)，这个数据显著优于阳性对照的89.5 nm(p＜0.05)。因此该氧化还原反应的最适梭柄松苞菇醇提物的浓度为7mg/mL。
表1梭柄松苞菇醇提物的浓度对纳米硒粒径的影响d
d平均值±标准差(n＝3)；同一行内不同字母表示具有显著性差异(p＜0.05，Tukey′s test)；VC：维生素C；ND：无法测定。
1.5.2梭柄松苞菇多糖分子量的优化
①分子筛柱分离：将梭柄松苞菇多糖样品配制成50mg/mL的多糖溶液，取 1mL该多糖溶液，加入Sephadex G-200层析柱(2.6×80cm)，用超纯水洗脱，洗脱速度为0.3mL/min，收集洗脱液，每管收集10mL，并采用苯酚硫酸法隔管检测各收集液的糖含量，根据不同的峰值，确定各分离组分。
②多糖分子量的测定：采用高效液相凝胶渗透色谱法对步骤①中分离得到的各组分多糖的分子量进行测定。
③将5mL亚硒酸钠溶液(2mM)置于磁力搅拌器上，分别加入5mL不同分子量的梭柄松苞菇多糖溶液(5mg/mL)，充分混匀后，缓慢滴加入5mL的梭柄松苞菇醇提物(7mg/mL)，常温反应24h后，将反应液置于相应规格的透析袋中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠和梭柄松苞菇多糖被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
④利用纳米粒度仪测定纳米硒的粒径，其中参数设置为：入射光为氦氖激光，波长λ为633nm，入射角为90°，测量温度为25℃。
结果：梭柄松苞菇多糖中共有6个组分被Sephadex G-200层析柱分离出来，它们分别对应的分子量为1.7×107、1.0×106、7.2×105、1.4×104、5.4×103和3.7×103 Da。由表2可以看出，在多糖分子量为1.7×107～1.4×104Da的范围内，纳米硒- 梭柄松苞菇多糖复合体的粒径与多糖分子量成负相关，而在多糖分子量为 1.4×104～3.7×103Da的范围内，纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径与多糖分子量成正相关。其中多糖分子量为1.4×104Da时，所得纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径最为理想31.8nm(p＜0.05)，并且1.4×104Da似乎是个阈值，多糖分子量高于或者低于此值均无法获得最优反应产物。因此该氧化还原反应的最适梭柄松苞菇多糖分子量为1.4×104Da。
表2梭柄松苞菇多糖的分子量对纳米硒-多糖复合体粒径的影响e
d平均值±标准差(n=3)；同一行内不同字母表示具有显著性差异(p＜0.05，Tukey′s test)。
1.5.3梭柄松苞菇多糖浓度的优化
①将5mL亚硒酸钠溶液(2mM)置于磁力搅拌器上，分别加入5mL不同浓度的梭柄松苞菇多糖溶液(0～5mg/mL，WM：1.4×104Da)，充分混匀后，缓慢滴加入5mL的梭柄松苞菇醇提物(7mg/mL)，常温反应24h后，将反应液置于透析袋(30kD)中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠和梭柄松苞菇多糖被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
②利用纳米粒度仪测定纳米硒的粒径，其中参数设置为：入射光为氦氖激光，波长λ为633nm，入射角为90°，测量温度为25℃。
结果：由表3可以看出，梭柄松苞菇多糖的浓度显著的影响着纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径(p＜0.05)，所有添加了梭柄松苞菇多糖的试验组，所得纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径均小于阴性对照组(没有添加梭柄松苞菇多糖)，这说明梭柄松苞菇多糖是纳米硒非常理想的分散剂和稳定剂，它能够有效的减少纳米硒的聚集。其中梭柄松苞菇多糖浓度为4和5mg/ml时，所得纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径显著小于其他试验组(p＜0.05)，而它们之间并没有显著性差异(p＞0.05)。因此该氧化还原反应的最适梭柄松苞菇多糖的浓度为4mg/mL。
表3梭柄松苞菇多糖的浓度对纳米硒-多糖复合体粒径的影响f
f平均值±标准差(n=3)；同一行内不同字母表示具有显著性差异(p＜0.05，Tukey′s test)。
1.5.4纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的表征和稳定性
①将5mL亚硒酸钠溶液(2mM)置于磁力搅拌器上，加入5mL梭柄松苞菇多糖溶液(4mg/mL)，充分混匀后，缓慢滴加入5mL的梭柄松苞菇醇提物(7 mg/mL)，常温反应24h后，将反应液置于透析袋(30kD)中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠和梭柄松苞菇多糖被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
②利用纳米粒度仪测定纳米硒的粒径，其中参数设置为：入射光为氦氖激光，波长λ为633nm，入射角为90°，测量温度为25℃。
③分别对存放周期为0～60天的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径进行测试，以研究纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的稳定性。
结果：纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体为红色的胶体，这与其他已经报道的纳米硒-多糖复合体非常类似。
由表4可以看出，纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体表现出非常出色的稳定性，在存放0-20天内，该复合体的粒径没有发生显著性的变化(p＞0.05)，而在存放 60天后，其粒径依然只有62.7nm(一般认为纳米硒粒径小于100nm就具有生物活性)。
表4纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的稳定性d
d平均值±标准差(n=3)；同一行内不同字母表示具有显著性差异(p＜0.05，Tukey′s test)。
1.6纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体对糖尿病氧化应激的调节作用
1.6.1实验动物
雄性ICR小鼠(18±2g)，饲养于恒温(25℃)的空调房间(12h照明，12h 黑暗)。所有小鼠均提供基础饲料和充足的饮用水。为了让小鼠完全适应环境和饮食，实验于1个礼拜之后开始。
1.6.2建立糖尿病模型
随机选取40只小鼠，并将它们禁食12h后称重。将STZ溶于缓冲液(0.1mol/L 柠檬酸钠和0.1mol/L柠檬酸，pH 4.2-4.5)，并迅速对小鼠进行腹腔注射 (150mg/kg)。72小时候后，从中选择24只血糖水平大于16.8mmol/L的小鼠作为糖尿病模型，用于下一阶段的实验。
1.6.3动物实验分组
待实验小鼠被随机的分配到如下实验组里(每组6只小鼠，实验周期30天)：
①组I：正常小鼠作为对照；
②组II：经STZ诱导的糖尿病小鼠作为阴性对照(灌胃蒸馏水)；
③组III：正常小鼠口服高剂量的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体(灌胃量为： 2g/kg/d)；
④组IV：经STZ诱导的糖尿病小鼠口服纳米硒作为阳性对照(灌胃量为： 0.2mg/kg/d)；
⑤组V：经STZ诱导的糖尿病小鼠口服梭柄松苞菇粗多糖作为阳性对照(灌胃量为：0.2g/kg/d)；
⑥组VI：经STZ诱导的糖尿病小鼠口服低剂量的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体(灌胃量为：0.2g/kg/d)。
1.6.4生理指标的测定
①经过30天的饲养，所有供试的小鼠禁食12小时。首先对小鼠的体重和血糖进行测定，然后对小鼠眼球取血，并将收集的血液迅速离心(5000rpm，5min， 4℃)以获得血清，保藏于-80℃冰箱；所有的小鼠利用颈椎脱位法处死，并切取小鼠的肝脏和肾脏被迅速保藏于-80℃冰箱，待测试。
②测定血清中葡萄糖的含量。
③将所得的小鼠肝、肾组织置于匀浆器中匀浆(置于冰上)，获得均质后离心(3000rpm，10min，4℃)，上层液体被用于测定过氧化氢酶(CAT)、丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、维生素C 和维生素E的水平。
结果：由表5可以看出，在实验前期所有糖尿病小鼠(组II、IV、V和VI) 的体重均低于正常小鼠(组I和III)，而空腹血糖水平却表现出于体重截然相反的情况(p＜0.05)。当连续服用了药物30天后，组IV、V和VI的糖尿病小鼠的血糖水平显著低于没有服用任何药物的阴性对照组(p＜0.05)；组IV和VI的糖尿病小鼠的体重显著高于没有服用任何药物的阴性对照组(p＜0.05)。这说明纳米硒、梭柄松苞菇多糖和纳米硒-梭柄松苞菇复合体均具有一定抗糖尿病活性。特别是服用了纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的小鼠(组VI)，它们的体重和血糖指标均显著优于服用了纳米硒或梭柄松苞菇多糖的小鼠(组IV和组V)，这说明纳米硒和梭柄松苞菇多糖对抗糖尿病活性具有协同促进作用。值得注意的是当正常小鼠服用剂量高达2g/kg/d的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体30天后，体重和血糖指标没有发生任何异常。
由表6可以看出，所有糖尿病小鼠(组II、IV、V和VI)肝脏内的抗氧剂水平均低于正常小鼠(组I和III)，而丙二醛的含量(反应机体氧化应的指标) 表现成截然相反的情况(p＜0.05)。当连续服用了药物30天后，组IV、V和VI 的糖尿病小鼠肝脏内抗氧剂水平显著高于没有服用任何药物的阴性对照组，并且丙二醛的含量显著低于阴性对照(p＜0.05)，这说明，纳米硒、梭柄松苞菇多糖和纳米硒-梭柄松苞菇复合体均具有一定抗氧化活性。值得注意的是服用了纳米硒-梭柄松苞菇多糖的小鼠(组VI)，它们肝脏内的所有抗氧化酶的水平均显著高于服用了纳米硒或梭柄松苞菇多糖的小鼠(组IV和组V)，而它们肝脏内丙二醛的含量却显著低于组IV和V(p＜0.05)，其中组VI中糖尿病小鼠肝脏的谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的水平已经达到正常水平，这说明纳米硒和梭柄松苞菇多糖对降低糖尿病小鼠体内氧化应激水平具有协同促进作用。值得注意的是当正常小鼠服用剂量高达2g/kg/d的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体30天后，体内所有抗氧化指标均维持在正常水平，并且抗氧化酶的水平显著高于正常组，这说明纳米硒-梭柄松苞菇多糖具有极强的抗氧化活性，并且是相对安全的。
综上可以得出，纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体具有极强的抗氧化活性，其活性显著高于纳米硒和梭柄松苞菇多糖本身。并且纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体所表现出来的抗糖尿病特性，可能是由于它的强抗氧化活性，降低了机体氧化应激水平，从而减轻或者避免各器官组织遭受氧化应激损伤，维持了各器官的正常功能而实现的。
表5纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体对糖尿病小鼠的体重、血糖的影响
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(p＜0.05)；SeNs：纳米硒；CVPs：梭柄松苞菇多糖；SeNCs：纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体；H：高剂量。
表6纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体对糖尿病小鼠肝脏内氧化应激的影响
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一行中不同的字母表示具有显著差异(P＜0.05)；SeNs：纳米硒；CVPs：梭柄松苞菇多糖；SeNCs：纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体；H：高剂量；GSH-Px谷胱甘肽过氧化物酶(U/mg protein)；SOD超氧化物歧化酶(U/mg protein)；CAT过氧化氢酶(U/mg protein)；MDA丙二醛(nmol/mg protein)；Vc维生素C(μg/mg protein)；VE维生素E(μg/g tissue)。
Claims (3)
1.纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)样品预处理：依次进行清洁、切块和冷冻干燥，获得含水量低于5％的新鲜梭柄松苞菇样品；所述步骤(1)样品预处理的具体操作为：
(a)清洁：用特制塑料刮片将适量新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，且不可用水清洗；
(b)切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个梭柄松苞菇均分为四块；
(c)冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5％的样品；
(2)提取梭柄松苞菇多糖：依次将新鲜梭柄松苞菇样品进行粉碎、乙醇洗涤、水提取、乙醇沉淀、去除蛋白质和去除小分子物质的处理，从而获得梭柄松苞菇多糖；所述步骤(2)样品预处理的具体操作为：
(a)、粉碎：将经预处理的梭柄松苞菇粉碎，过40目筛，即获得梭柄松苞菇粉末；
(b)、乙醇洗涤：将适量梭柄松苞菇粉末加入索氏提取装置，并按料液比1∶10，加入95％的乙醇，80℃水浴回流抽提2h后，将混合液加入离心管离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，将上清液干燥，所得粉末即为该反应的还原剂；
(c)水提取：将经乙醇洗涤后，离心管中的沉淀样品干燥，并按料液比1∶20与蒸馏水混合，超声波作用功率为150W，且使其每工作15min，暂停5min，提取温度80℃，提取时间2.5h，以上步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液；
(d)乙醇沉淀：将多糖提取液利用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，弃上清液，收集沉淀，冻干待用；
(e)去除蛋白质：按固液比1∶10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇粗多糖，随后加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心，且离心转速为5000rpm，离心时间为5min，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该步骤5次；
(f)去除小分子物质：将去除蛋白质的粗多糖提物，加入截留分子量为5000的透析袋中，流水过夜，以去除小分子物质，再利用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，并加入4倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冻干保藏于-80℃冰箱待用；
(3)制备还原剂：将梭柄松苞菇多糖提取过程中的乙醇洗涤液冷冻干燥，获得固体粉末即为还原剂；
(4)制备纳米硒：利用制备好的还原剂，将亚硒酸钠还原成单质硒；所述步骤(4)中制备纳米硒的具体操作为：
将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入5mL超纯水，再分别缓慢滴加入5mL不同浓度的梭柄松苞菇醇提物溶液及100mM的维生素C，常温反应24h后，将反应液置于透析袋中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒；
(5)制备纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体：利用多糖游离的羟基，对纳米硒表面进行修饰和包裹，形成稳定的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体；所述步骤(5)制备纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的具体操作为：
将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入梭柄松苞菇多糖溶液，充分混匀后，缓慢滴加入5mL的梭柄松苞菇醇提物，常温反应24h后，将反应液置于相应规格的透析袋中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠和梭柄松苞菇多糖被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
2.根据权利要求1述的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的制备方法，其特征在于，检测透析袋外有无亚硒酸钠的方法是，取少量透析袋外液体，滴加维生素C后液体不变红，则证明没有亚硒酸钠存在。
3.一种对糖尿病氧化应激具有调节作用的多糖复合体，其特征在于，该多糖复合体是采用权利要求1-2任意一项所述的方法制备的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
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