CN105131145B - 一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，步骤为：将梭柄松苞菇冷冻干燥，研磨成粉末，再用乙醇水提醇沉、除蛋白、除小分子杂质等过程的处理，得到梭柄松苞菇多糖；制备硫酸酯化梭柄松苞菇多糖方法为：量取70ml二甲基亚砜于干燥附有冷凝装置的三颈烧瓶中，边磁力搅拌边缓慢加入梭柄松苞菇多糖样品，防止样品凝结成块，搅拌过程持续1h，加完后盖上瓶塞；再将三氧化硫‑吡啶粉末加入，水浴加热至85℃，冷凝管回流，反应3h；反应结束后，将烧瓶放入冷水浴中冷却至室温，之后反应液用NaOH中和，加入无水乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀物，将沉淀溶于水中透析，透析液冷冻干燥即得到硫酸酯化梭柄松苞菇多糖。
Description
技术领域
本发明涉及多糖的制备技术领域，具体为一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖(sCVPs)的制备方法。
背景技术
随着仔猪个体的增长，以及母体自身的消耗，使得在哺乳的中后期中仔猪从母乳所获得的营养物质不能完全满足其生长发育的需求，导致仔猪生长缓慢，同时也不利于母猪身体机能的恢复。因此在现代的养猪业中，随着养殖规模的不断扩大，人们普遍意识到仔猪的适时断奶成为养猪生产中的一个重要环节。而且仔猪的肠道发育不够健全，早期断奶极易导致肠道氧化应激损伤继而引发消化功能紊乱及腹泻，从而严重威胁到仔猪的健康及生命安全。我国每年因仔猪肠道健康问题造成的经济损失达300亿元，断奶应激一直是困扰养猪业的一个“瓶颈”，也是动物生理营养学界亟待解决的关键命题之一。
在生产实践中，人们常常在断奶仔猪日粮中添加抗生素来预防仔猪疾病和促进其健康生长，但是在抗生素的使用过程中出现的负面效应对畜产品的安全生产产生了严重的威胁。因此找寻到安全高效的抗氧化剂，并有针对性地对断奶仔猪肠道氧化损伤进行干预，是现阶段养猪业突破“瓶颈”的解决方案。
梭柄松苞菇(Catathelasma ventricosum)是我国传统的名贵中药材，《本草纲目》和《滇南本草》都对其有相关记载，并被收录于《中华人民共和国药典》。近期有研究报道显示，梭柄松苞菇的水提物和醇提物在体外实验中，均表现出显著的抗氧化和降血糖活性，其中水提物的活性表现的最为突出，并验证了多糖是水提物中主要的活性物质。同时有研究证明，STZ-诱导的糖尿病小鼠在服用了梭柄松苞菇多糖后，抗氧化酶、血糖、血脂、胰岛素等生理指标均得到了明显改善，并认为糖尿病小鼠症状的改善，主要是由于梭柄松苞菇多糖的强抗氧化活性对小鼠的组织和器官的保护，而免受氧化损伤，最终使得这些组织和器官保持其生理功能。
尽管梭柄松苞菇多糖具有非常突出的抗氧化等生物活性，具有进一步开发应用的潜质，但要实现其作为产品进入市场尚有距离。利用理化方法，对多糖进行基团修饰，是提升多糖生物活性的有效方式之一。近年来在许多研究中，硫酸酯化多糖展现出抗氧化、抗病毒、抗凝血、抗肿瘤以及增加机体免疫等独特的生物活性，因此，硫酸酯化被越来越广泛地用于多糖分子结构的修饰。经过许多科研人员长期探索与改良，多糖硫酸酯化的方法有氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法、浓硫酸法、Nagasawa法、氨基磺酸法等，其中氯磺酸-吡啶法因其操作简单，产率较高，而被广泛采用。但现阶段多糖硫酸酯化的方法普遍存在：硫酸酯化多糖活性较低，硫酸酯化多糖取代度较低，并且在增加试剂浓度和反应时间时，又会严重影响硫酸酯化多糖的得率。目前并没有利用梭柄松苞菇多糖进行硫酸酯化的研究，值得注意的是梭柄松苞菇多糖的分子量较其他菌类多糖而言较小，而分子量的大小往往与取代度和生物活性成反比，因此用硫酸酯化的梭柄松苞菇多糖应用于抗糖尿病的研究必将会为多糖的化学修饰和多糖的生物活性提供新思路和参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以梭柄松苞菇为代表的高效的食用菌多糖硫酸酯化的方法，，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，其特征在于：(1)取新鲜梭柄松苞菇进行预处理；(2)梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：水提取：先用乙醇进行洗涤，然后离心处理，将离心管的沉淀样品干燥，并按料液比1∶20与蒸馏水混合，然后进行超声波处理，超声波作用功率为150W，每工作15min，暂停5min，提取温度80℃，提取时间2.5h，上述水提取步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液；乙醇沉淀：将梭柄松苞菇多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻干待用；去除蛋白质：按固液比1∶10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心处理，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该去除蛋白质步骤5次；去除小分子物质：将去除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜，透析袋的截留分子量为3000，以去除小分子杂质；再用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，与4倍体积的95％乙醇溶液混合，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心处理，离心机转速5000rpm，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冷冻干燥备用；(3)硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：量取70ml二甲基亚砜于干燥附有冷凝装置的250ml三颈烧瓶中，边磁力搅拌边缓慢加入分子量范围为1.0×104-3.0×104Da的1g梭柄松苞菇多糖样品，防止样品凝结成块，搅拌过程持续1h，加完后盖上瓶塞；再将2.5g三氧化硫-吡啶粉末加入，水浴加热至85℃，冷凝管回流，反应3h；反应结束后，将烧瓶放入冷水浴中冷却至室温，之后反应液用10％NaOH中和，加入4倍体积无水乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀物，将沉淀溶于水中透析，透析液冷冻干燥即得到硫酸酯化梭柄松苞菇多糖。
进一步的，新鲜梭柄松苞菇的预处理步骤具体为，
清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，不可用水清洗，不然表面的多糖会损失；
切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个切块大小适中且均匀；
冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5％的样品。
进一步的，乙醇沉淀步骤和去除蛋白质步骤中的离心处理的离心机转速5000rpm，时间5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本专利选用的原料(梭柄松苞菇)在四川、云南和贵州等地广泛种植，采集方便，价格低廉，并且CVPs已经被证明具有较为突出的抗糖尿病活性，因此具备进一步被开发利用的潜质；(2)本专利建立了一种高效的sCVPs的制备方法，其中首次评价了多糖分子量范围对多糖硫酸酯化的影响，最终所得sCVPs的得率和取代度分别达到了68.75％和1.49，并且整个制备过程的反应条件温和，成本低廉，操作简单易于工业推广；(3)动物实验证明，对CVPs进行硫酸酯化修饰后，sCVPs的生物活性得到显著提高，每天仅需摄入基础日粮0.01‰质量的sCVPs，即能显著提高其对断奶仔猪肠道氧化应激的缓解作用。
附图说明
图1为本发明中硫酸酯化梭柄松苞菇多糖红外光谱图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图1，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，其特征在于：(1)取新鲜梭柄松苞菇进行预处理；清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，不可用水清洗，不然表面的多糖会损失；切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个切块大小适中且均匀；冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5％的样品。(2)梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：水提取：先用乙醇进行洗涤，然后离心处理，将离心管的沉淀样品干燥，并按料液比1∶20与蒸馏水混合，然后进行超声波处理，超声波作用功率为150W，每工作15min，暂停5min，提取温度80℃，提取时间2.5h，上述水提取步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液；乙醇沉淀：将梭柄松苞菇多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻干待用；去除蛋白质：按固液比1∶10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心处理，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该去除蛋白质步骤5次；去除小分子物质：将去除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜，透析袋的截留分子量为3000，以去除小分子杂质；再用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，与4倍体积的95％乙醇溶液混合，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心处理，离心机转速5000rpm，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冷冻干燥备用；(3)硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：量取70ml二甲基亚砜于干燥附有冷凝装置的250ml三颈烧瓶中，边磁力搅拌边缓慢加入分子量范围为1.0×104-3.0×104Da的1g梭柄松苞菇多糖样品，防止样品凝结成块，搅拌过程持续1h，加完后盖上瓶塞；再将2.5g三氧化硫-吡啶粉末加入，水浴加热至85℃，冷凝管回流，反应3h；反应结束后，将烧瓶放入冷水浴中冷却至室温，之后反应液用10％NaOH中和，加入4倍体积无水乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀物，将沉淀溶于水中透析，透析液冷冻干燥即得到硫酸酯化梭柄松苞菇多糖。乙醇沉淀步骤和去除蛋白质步骤中的离心处理的离心机转速5000rpm，时间5min。
对上述最优梭柄松苞菇多糖分子量范围1.0×104-3.0×104Da确定的方法如下：
(1)多糖酸水解：①取适量梭柄松苞菇多糖样品于具塞试管中，用0.1mol/L三氟乙酸(TFA)溶解，然后在110℃条件下水解1h，再用分子截留规格为5.0×102的透析袋对该反应液进行透析，以去除三氟乙酸和其他杂质，并收集透析袋内液体，即为多糖水解液；②除分子截留规格为1.0×106的透析袋直接对多糖水解进行透析外，其余规格的透析袋均对上一次透析袋外的多糖水解液进行透析(透析袋规格：1.0×106、5.0×105、3.0×105、1.0×105、5.0×104、3.0×104、1.0×104、5.0×103、3.0×103、1.0×103)，收集透析袋内的液体，冻干后即获得多糖分子量分别为：＞1.0×106、5.0×105-1.0×106、3.0×105-5.0×105、1.0×105-3.0×105、5.0×104-1.0×105、3.0×104-5.0×104、1.0×104-3.0×104、5.0×103-1.0×104、3.0×103-5.0×103、1.0×103-3.0×103，10组不同分子量范围的组分。
(2)每个组分进行硫酸酯化比较它们的取代度和得率。
表1：分子量对多糖的硫酸酯化取代度和得率的影响
每个数值均表示为三次测试的平均值±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P＜0.05)
由表1可得，多糖的分子量为1.0×104-3.0×104、5.0×103-1.0×104、3.0×103-5.0×103、1.0×103-3.0×103的三组取代度显著高于其余组分(p＜0.05)。而分子量为5.0×103-1.0×104、3.0×103-5.0×103、1.0×103-3.0×103的得率显著低于其余组分(p＜0.05)，因此最优分子量组分为1.0×104-3.0×104分子量的多糖，利用此组分进行下面的红外光谱分析和动物实验。
对最优组分进行红外光谱分析和生物活性的测定。
由图1可以看出在1254.96cm-1处出现了S＝O不对称振动的特征吸收峰，在817.17cm-1处出现了C-O-S的拉伸振动，在1038.57cm-1处出现了C-O-H中C-O伸缩振动，基于红外光谱的结果，证明了CVPs确实已被硫酸酯化，即为sCVPs。
硫酸酯化多糖对断奶仔猪肠道应激的调节作用
实验动物
选购胎次相近的21日龄健康仔猪60头，公、母各半，适应性饲养一周(25℃恒温空调房，12h光照12h黑暗，有充足的饮水和基础饲料)。
糖尿病动物模型建立
随机选取40只仔猪，腹腔注射8mg/kg体重的Diquat诱导肠道氧化应激模型，剩下的20只仔猪腹腔注射等体积的蒸馏水。
动物实验分组
待实验仔猪被随机的分配到如下实验组里(每组10只仔猪，实验周期30天)：
①组I：饲喂基础日粮，不做其他任何处理作为对照；
②组II：饲喂基础日粮+0.01‰sCVPs；
③组III：基础日粮+Diquat+0.01‰sCVPs；
④组IV：基础日粮+Diquat+0.1‰sCVPs；
⑤组V：基础日粮+Diquat+0.1‰CVPs；
⑥组VI：基础日粮+Diquat。
样品采集以及生理指标的测定
①sCVPs对断奶仔猪小肠形态的影响：试验第30d，屠宰仔猪后剖开腹腔，将小肠从其肠系膜处取下并立即放入冰块中，分别于空肠和回肠各段中部取5cm左右的肠段。将该肠段置于冰面用剪刀沿系膜纵向剖开，并用4℃生理盐水冲洗肠内容物，将水分用滤纸吸干，再用载玻片刮取肠黏膜，分装到5mL冻存管中，立即放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存待测。
用冰冻生理盐水冲洗5cm的肠段后用滤纸吸干水分，然后将其浸入10％的中性福尔马林溶液进行固定，经脱水、浸蜡、包埋、切片等处理后，再经苏木精-伊红染色，在光学显微镜下进行观察，测其绒毛高度和隐窝深度，取其平均数作为测定数据。绒毛高度测定标准为：从以肠腺开口至绒毛顶端的垂直距离；隐窝深度测定标准为：从隐窝开口至隐窝基部的垂直距离。
②sCVPs对断奶仔猪肠道屏障功能的影响：将小肠黏膜从液氮中取出，称取500mg置于匀浆器中。加入7倍体积磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.2)，冰浴匀浆后离心(10000g/30min/4℃)，取匀浆上清液测定二胺氧化酶(DAO)活性，测定方法参照相关试剂盒的方法操作。
③sCVPs对断奶仔猪肠道抗氧化能力的影响：點膜样品前处理：从一80℃超低温冰箱中取出保存的肠粘膜，分别按1∶10和1∶100加冰生理盐水，匀浆，4000r/min离心15min，取上清液。丙二醛(MDA)采用10％黏膜组织匀浆液测定；过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)采用1％黏膜组织匀浆液测定。
结果：绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度是反映小肠粘膜结构完整性的重要指标。小肠黏膜的形态、结构和功能在断奶应激中会发生很大变化。断奶后，消化道的蠕动迟缓和肠壁退化会导致肠道绒毛高度降低，隐窝深度增加。由表2以看出组II的回肠和空肠的绒毛高度和黏膜绒毛高度/隐窝深度的比值均显著高于组I(P＜0.05)，这说明sCVPs能够显著修复断奶仔猪肠道氧化应激所带来的损伤。肠道氧化损伤的仔猪未摄入sCVPs和CVPs的组VI相对与其他组别，回肠黏膜的隐窝深度显著上升(P＜0.05)，回肠黏膜和空肠黏膜绒毛高度/隐窝深度的比值显著较低(P＜0.05)，空肠和回肠黏膜的绒毛高度显著下降(P＜0.05)。而肠道氧化损伤的仔猪摄入sCVPs或CVPs的组III、IV、V相对于组VI，能显著提升绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度的比值，并且这些指标与组I相比没有显著差异(P＞0.05)，但显著优于组V(P＜0.05)，这说明sCVPs能够有效缓解Diquat刺激导致的小肠黏膜结构的损伤，从而保护小肠粘膜结构完整性，并且该生物功能强于未硫酸酯化的CVPs。同时sCVPs并没有表现出剂量相关性，III和IV组的所有指标并没有显著性差异(P＞0.05)。因此低剂量的sCVPs，即可满足治疗的需要。
表2：sCVPs对断奶仔猪小肠形态的影响
注：每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一行中不同的字母表示具有显著差异(P＜0.05)
完整的肠道屏障在阻止肠腔细菌和日粮过敏原进入肠黏膜的过程中起着关键作用。一般黏膜中的DAO活性可被认为是肠粘膜成熟、完整和屏障功能以及黏膜损伤和修复的指标。由表3以看出组II的回肠和空肠的DAO活性显著高于组I(P＜0.05)，这说明sCVPs能够显著缓解断奶仔猪肠道氧化应激所导致的肠道屏障功能的损伤。肠道氧化损伤的仔猪未摄入sCVPs和CVPs的组VI相对与其他组别，回肠和空肠黏膜的DAO活性显著降低(P＜0.05)，这说明仔猪注射Diquat后，进一步加重了肠道屏障功能的损伤。而肠道氧化损伤的仔猪摄入sCVPs或CVPs的组III、IV、V相对于组VI，能显著提升回肠和空肠黏膜的DAO活性，甚至组III和IV空肠的DAO的活性显著高于组I(P＜0.05)。sCVPs并没有表现出剂量相关性，III和IV组的所有指标并没有显著性差异(P＞0.05)。因此低剂量的sCVPs，即可满足治疗的需要。
表3：sCVPs对断奶仔猪肠道屏障功能的影响：
注：每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一行中不同的字母表示具有显著差异(P＜0.05)，DAO的单位为U/mg protein
由表4以看出组II的小肠黏膜的SOD、CAT、MDA活性显著高于组I(P＜0.05)，这说明sCVPs能够显著提升断奶仔猪小肠黏膜抗氧化剂的水平。肠道氧化损伤的仔猪未摄入sCVPs的组VI相对与其他组别，小肠黏膜的SOD、CAT、MDA活性显著降低(P＜0.05)，这说明仔猪注射Diquat后，进一步加重了仔猪肠道氧化应激水平。而肠道氧化损伤的仔猪摄入sCVPs或CVPs的组III、IV、V相对于组VI，能显著提升小肠黏膜的SOD、CAT、MDA活性，甚至组III和组IV的CAT活性显著高于组I(P＜0.05)，这说明sCVPs具有极强的抗氧化活性，能够显著降低断奶仔猪肠道氧化应激水平。sCVPs并没有表现出剂量相关性，III和IV组的所有指标并没有显著性差异(P＞0.05)。因此低剂量的sCVPs，即可满足治疗的需要。
表4：sCVPs对断奶仔猪肠道抗氧化能力的影响
注：每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一行中不同的字母表示具有显著差异(P＜0.05)，黏膜MDA含量单位为nmol/mg protein，SOD活性单位为U/mg protein，CAT活性单位为U/g protein
综上可以得出，硫酸酯化可以显著提高梭柄松苞菇多糖的抗氧化活性。并且硫酸酯化后的梭柄松苞菇多糖所表现出来的对断奶仔猪肠道结构以及肠道屏障功能的保护作用，可能是由于它的强抗氧化活性，降低了机体氧化应激水平，从而减轻或者避免各器官组织遭受氧化应激损伤，维持了各器官的正常功能而实现的。
Claims (3)
1.一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，其特征在于：
(1)取新鲜梭柄松苞菇进行预处理；
(2)梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：
水提取：先用乙醇进行洗涤，然后离心处理，将离心管的沉淀样品干燥，并按料液比1∶20与蒸馏水混合，然后进行超声波处理，超声波作用功率为150W，每工作15min，暂停5min，提取温度80℃，提取时间2.5h，上述水提取步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液；
乙醇沉淀：将梭柄松苞菇多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95％乙醇溶液，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻干待用；
去除蛋白质：按固液比1∶10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心处理，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该去除蛋白质步骤5次；
去除小分子物质：将去除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜，透析袋的截留分子量为3000，以去除小分子杂质；再用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，与4倍体积的95％乙醇溶液混合，搅拌0.5h后，置于4℃冰箱12h，再离心处理，离心机转速5000rpm，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冷冻干燥备用；
(3)硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：
量取70ml二甲基亚砜于干燥附有冷凝装置的250ml三颈烧瓶中，边磁力搅拌边缓慢加入分子量范围为1.0×104-3.0×104Da的1g梭柄松苞菇多糖样品，防止样品凝结成块，搅拌过程持续1h，加完后盖上瓶塞；再将2.5g三氧化硫-吡啶粉末加入，水浴加热至85℃，冷凝管回流，反应3h；反应结束后，将烧瓶放入冷水浴中冷却至室温，之后反应液用10％NaOH中和，加入4倍体积无水乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀物，将沉淀溶于水中透析，透析液冷冻干燥即得到硫酸酯化梭柄松苞菇多糖。
2.根据权利要求1所述的一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，其特征在于：新鲜梭柄松苞菇的预处理步骤具体为，
清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，不可用水清洗，不然表面的多糖会损失；
切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个切块大小适中且均匀；
冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5％的样品。
3.根据权利要求1所述的一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，其特征在于：乙醇沉淀步骤和去除蛋白质步骤中的离心处理的离心机转速5000rpm，时间5min。
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