CN102351959B

CN102351959B - 首乌藤多糖螯合锌的制备方法及应用

Info

Publication number: CN102351959B
Application number: CN 201110250620
Authority: CN
Inventors: 刘富岗; 杨云; 卫冰
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2011-08-29
Filing date: 2011-08-29
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-08-29
Also published as: CN102351959A

Abstract

本发明涉及首乌藤多糖螯合锌的制备方法及应用，可有效解决首乌藤多糖螯合锌的制备，并应用于保健品和药物的制备中的问题，方法是，将首乌藤药粉用水按重量比1:8-10，于80-100℃提取2-4次，每次1.5-3小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1-1.3，得首乌藤多糖浓缩液；将首乌藤多糖浓缩液与硫酸锌溶液等体积混合并搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0-8.5，70-90℃反应2-3小时，得到首乌藤多糖螯合锌溶液；对首乌藤多糖螯合锌溶液进行透析，透析液中加入95%乙醇至乙醇含量达到80-90%，静置醇沉10-24h，过滤，得沉淀物，干燥粉碎，即得，本发明方法简单，原料丰富，产品应用面广，不但解决了以往补锌产品吸收率低的问题，而且具有提高机体免疫的作用，是中药上的创新。

Description

首乌藤多糖螯合锌的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种首乌藤多糖螯合锌的制备方法及应用。

背景技术

锌是人体六大酶类、200种金属酶的组成成分或辅酶，对全身代谢起广泛作用，如参与核酸和蛋白质的合成、细胞与体液免疫过程、能量代谢等。是人体必须的微量元素。而以往和现在临床上补锌多用硫酸锌和单纯葡萄糖酸锌等制剂，它们绝大部分在体内以离子形式吸收，锌离子一方面容易与膳食中的植酸、草酸、脂肪酸等物质结合，容易生成不溶物而导致大量流失；一方面受结合蛋白不足等因素影响，吸收率低。

多糖是一类分子量大、结构复杂的糖类物质，已有研究表明多糖具有免疫调节作用，抗病毒及抗癌作用，由于多糖含量较高，制备工艺相对简单，且容易被机体吸收，因此其在医药卫生及食品等行业极具应用价值，目前并无有关首乌藤多糖螯合锌的制备及应用的报道。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种首乌藤多糖螯合锌的制备方法及应用，可有效解决首乌藤多糖螯合锌的制备，并应用于保健品和药物的制备中的问题。

本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：

1、将干燥的首乌藤粉碎成药粉，药粉用水按重量比1:8-10，于80-100℃提取2-4次，每次1.5-3小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1-1.3，得首乌藤多糖浓缩液；

2、用硫酸锌和水配制成0.5mol/L浓度的硫酸锌溶液，用氢氧化钠和水配制成2mol/L浓度的氢氧化钠溶液；

3、将首乌藤多糖浓缩液与硫酸锌溶液等体积混合并搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0-8.5，70-90℃反应2-3小时，得到首乌藤多糖螯合锌溶液；

4、对首乌藤多糖螯合锌溶液进行透析，透析截留分子量为8000-14000，得透析液，透析液中加入质量浓度为95%的乙醇至乙醇含量达到80-90%，静置醇沉10-24h，再过滤或离心分离，得沉淀物，沉淀物经干燥粉碎，即为首乌藤多糖螯合锌粉末，该首乌藤多糖螯合锌粉末有效用于保健品和药物的制备，特别是用于制备预防和改善因缺锌而导致的食欲不振、生长迟缓等相关症状，并可增强机体免疫能力的保健品和药物。

本发明方法简单，原料丰富，产品应用面广，以首乌藤为原料制备首乌藤多糖螯合锌，不但解决了以往补锌产品吸收率低的问题，而且具有提高机体免疫的作用，是中药上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

称取干燥的首乌藤药粉400g，加水于90℃提取3次，每次3小时，第一次加药粉重量10倍的水4000g（或4000ml）、第二次、第三次均加药粉重量8倍的水3200g（或3200ml），过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1的溶液，得到首乌藤多糖提取液，再加入等量的0.5mol/L的硫酸锌溶液，搅拌均匀，用2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至6.0，80℃反应2.5小时，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，透析液浓缩至比重1.3的溶液，加95%乙醇调节至含醇量至80%，静置过夜，离心，将沉淀干燥，粉碎即得首乌藤多糖螯合锌。

实施例2

称取干燥的首乌藤药粉600g，加水于80℃提取2次，每次3小时，第一次加药粉重量9倍的水5400g（或5400ml）、第二次加药粉重量9倍的水5400g（或5400ml），过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.2的溶液，得到首乌藤多糖提取液，再加入等量的0.5mol/L的硫酸锌溶液，搅拌均匀，用2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至7，90℃反应2小时，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，透析液浓缩至比重1.2的溶液，加95%乙醇调节至含醇量至85%，静置过夜，离心，将沉淀干燥，粉碎即得首乌藤多糖螯合锌。

实施例3

称取干燥的首乌藤药粉1000g，加水于100℃提取4次，每次1.5小时，第一次加药粉重量10倍的水10000g（或10000ml）、第二次、第三次均加药粉重量9倍的水9000g（或9000ml），第四次加药粉重量8倍的水8000g（或8000ml），过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.3的溶液，得到首乌藤多糖提取液，再加入等量的0.5mol/L的硫酸锌溶液，搅拌均匀，用2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至8，70℃反应3小时，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，透析液浓缩至比重1.3的溶液，加95%乙醇调节至含醇量至90%，静置过夜，离心，将沉淀干燥，粉碎即得首乌藤多糖螯合锌。

上述方法所制备的首乌藤多糖螯合锌可有效用于保健品和药物的制备，特别是用于制备预防和改善因缺锌而导致的食欲不振、生长迟缓等相关症状，并可增强机体免疫能力的保健品和药物，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下：

首乌藤多糖螯合锌对正常小鼠腹腔细胞吞噬功能的影响

SPF级小鼠90只，雌雄各半，体重20±2g，随机分成首乌藤多糖螯合锌高、中、低剂量组（200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg）、硫酸锌组（95mg/kg）、葡萄糖酸锌组（95mg/kg）及空白组，空白组灌服生理盐水。连续灌胃给药7天，于末次给药1小时后，各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml每只，于3小时后每只腹腔注射汉氏液2.5ml，脱颈椎处死，吸取20μL腹腔液于载玻片上，均匀铺展，37 ℃培养箱孵育30 min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞士染液染色，自来水冲洗，晾干，镜检得小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，计算吞噬百分率和吞噬指数，结果见表1：

表1 首乌藤多糖螯合锌对正常小鼠腹腔细胞吞噬功能的影响

组别	剂量（mg/kg）	吞噬百分率（%）	吞噬指数
				空白组	-—	46.8±5.1	0.62±0.07
首乌藤多糖螯合锌高剂量组	200	51.4±3.8*	0.71±0.07*
				首乌藤多糖螯合锌中剂量组	100	58.7±6.2**	0.87±0.06**
首乌藤多糖螯合锌低剂量组	50	54.2±5.1**	0.82±0.08**
				硫酸锌组	95	48.5±4.3	0.66±0.07
葡萄糖酸锌组	95	48.8±5.2	0.67±0.06

**表示与空白组比P<0.01，*表示与空白组比P<0.05

以上药理结果表明，与空白组相比，首乌藤多糖螯合锌中剂量及低剂量组均可显著提高正常小鼠腹腔细胞的吞噬功能，说明本发明所制得的首乌藤多糖螯合锌具有显著的提高免疫活性。首乌藤多糖螯合锌与硫酸锌组及葡萄糖酸锌组比较亦可显著提高正常小鼠腹腔细胞的吞噬功能，硫酸锌组和葡萄糖酸锌组与空白组比较，吞噬率及吞噬指数均较高，但无显著统计学意义。上述可知，首乌藤多糖螯合锌能显著提高正常小鼠的机体免疫，与离子锌源硫酸锌及小分子有机螯合锌葡萄糖酸锌相比较为优越。

首乌藤多糖螯合锌对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

（1）首乌藤多糖螯合锌对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

SPF级小鼠105只，雌雄各半，体重20±2g，随机分成6组，每组10只，首乌藤多糖螯合锌设高、中、低三个剂量组（200、100、50mg/kg）；硫酸锌组（95mg/kg）；葡萄糖酸锌组（95mg/kg）；免疫低下模型组及空白对照组分别灌服生理盐水（20ml/kg）。上述各组均灌胃给药，每天给药1次，连续给药15天，于给药第11天，除空白对照组外，其它各组腹腔注射环磷酰胺40mg/（kg·d），连续注射5天。第15天早上各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，于第15天灌胃给药后2 h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠，腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀，吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。

表2 腹腔巨噬细胞吞噬功能结果（±s）

组别	动物数（只）	剂量（mg/kg）	吞噬百分率（%）	吞噬指数
					空白对照组	15		57.4±5.1**	0.60±0.08**
模型组	15		42.8±5.3	0.38±0.05
					首乌藤多糖螯合锌高剂量组	15	200	71.6±3.4**	0.74±0.08**
首乌藤多糖螯合锌中剂量组	15	100	74.7±4.0**	0.83±0.07**
					首乌藤多糖螯合锌低剂量组	15	50	68.9±4.1**	0.71±0.07**
硫酸锌组	15	95	62.7±3.6*	0.65±0.04*
					葡萄糖酸锌组	15	95	64.8±4.2*	0.66±0.05*

**表示与模型组比P<0.01， *表示与模型组比P<0.05

从表2可以看出，与空白对照组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率均显著降低（P<0.01），说明环磷酰胺能显著降低小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，对非特异性免疫功能有较强的抑制作用，表明免疫抑制模型建立成功。与模型组相比，首乌藤多糖螯合锌组均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率（P<0.01），以中剂量组效果较好；与模型组相比，硫酸锌组与葡萄糖酸锌组均能提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率（P<0.05）；与硫酸锌组和葡萄糖酸锌组相比，首乌藤多糖螯合锌组能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率（P<0.05），对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响有明显的优势。

（2）首乌藤多糖螯合锌对免疫低下小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响

小鼠分组及给药途径同上述免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的实验。于给药第5天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，3500r/min离心10min，分离血清，用生理盐水1:100稀释后，取1.0ml稀释液与5%鸡红细胞混悬液0.5ml、10%补体0.5ml混匀，另设不加补体的空白管作对照，37℃孵育30min，冰水中终止反应，离心，取上清液于UV-2000型紫外分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。

眼眶取血后的小鼠，脱颈椎处死，解剖小鼠，取出脾脏，将两个小鼠脾脏放在一起，用匀浆器匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×10⁶个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml与0.2%鸡红细胞混悬液0.5ml、1:10的豚鼠血清0.5ml混匀，另设不加补体的空白管作对照，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2000型紫外分光光度计413nm处比色，测定各组溶血空斑形成情况。

表3 溶血素、溶血空斑形成结果（

Figure 2011102506207100002DEST_PATH_IMAGE002

±s）

组别	动物数（只）	剂量(g/kg)	溶血素形成（OD）	溶血空斑形成（OD）
					空白对照组	15		0.056±0.029*	0.274±0.023*
模型组	15		0.040±0.015	0.234±0.021
					首乌藤多糖螯合锌高剂量组	15	200	0.104±0.017**	0.360±0.032**
首乌藤多糖螯合锌中剂量组	15	100	0.115±0.029**	0.363±0.019**
					首乌藤多糖螯合锌低剂量组	15	50	0.088±0.029**	0.357±0.022**
硫酸锌组	15	95	0.041±0.026	0.242±0.034
					葡萄糖酸锌组	15	95	0.042±0.013	0.238±0.036

**表示与模型组比P<0.01，*表示与模型组比P<0.05

从表3可以看出，与空白对照组相比，模型组溶血素和溶血空斑OD值均显著降低（P<0.05），说明环磷酰胺能显著降低小鼠的溶血素和溶血空斑水平，对体液免疫功能有较强的抑制作用，表明免疫抑制模型建立成功。与模型组相比，首乌藤多糖螯合锌各组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成（P<0.01），硫酸锌组与葡萄糖酸锌组对小鼠溶血空斑的形成影响不明显。

上述实验结果表明，首乌藤多糖螯合锌具有提高正常小鼠和环磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫活性的功能。

不同补锌制剂对缺锌仔鼠血清锌的影响

将怀孕1天的孕鼠随机分成2组：对照组与缺锌组。对照组自由食用正常饲料（含锌25mg/kg）；缺锌组自由食用缺锌饲料（含锌5mg/kg）。产后缺锌组与正常组均随机选取21天断乳仔鼠，其中缺锌组60只，正常组15只。缺锌组分成四组，每组15只：硫酸锌组、葡萄糖酸锌组与首乌藤多糖螯合锌组，给药量均为95mg/kg，均以溶液形式灌胃给药；对照组缺锌小鼠直接眼眶取血，离心后取血清以原子吸收法测定血清锌浓度；正常组灌服生理盐水（20ml/kg）；各组饲料均不变，每天给药一次，试验期至仔鼠35天龄。实验结束时，各组仔鼠眼眶取血，离心后取血清测定血清锌，以原子吸收法检测血清锌浓度。

表4 不同补锌制剂对缺锌小鼠血清锌含量的影响

组别	例数	血清锌（μg/L）
			正常组	15	1367.04±102.8**
缺锌组	15	581.24±61.8
			硫酸锌组	15	1452.18±134.6**
葡萄糖酸锌组	15	1521.63±171.9**
			首乌藤多糖螯合锌组	15	1886.31±246.7**

**表示与缺锌组比P<0.01

从表4可以看出，正常组与缺锌组相比，缺锌组小鼠血清锌含量显著低于正常小鼠（P<0.01），表明缺锌小鼠模型建立成功。与缺锌组相比，首乌藤多糖螯合锌组及葡萄糖酸锌组、硫酸锌组均能显著提高小鼠血清锌含量（P<0.01），且以首乌藤多糖螯合锌组升高最多，补锌效果最好。

上述各实验结果清楚的表明，本发明首乌藤多糖螯合锌不仅具有良好的补锌效果，而且具有很好的增强机体免疫的作用。

Claims

1.一种首乌藤多糖螯合锌的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、将干燥的首乌藤粉碎成药粉，药粉用水按重量比1:8-10，于80-100℃提取2-4次，每次1.5-3小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1-1.3，得首乌藤多糖浓缩液；

（2）、用硫酸锌和水配制成0.5mol/L浓度的硫酸锌溶液，用氢氧化钠和水配制成2mol/L浓度的氢氧化钠溶液；

（3）、将首乌藤多糖浓缩液与硫酸锌溶液等体积混合并搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0-8.5，70-90℃反应2-3小时，得到首乌藤多糖螯合锌溶液；

（4）、对首乌藤多糖螯合锌溶液进行透析，透析截留分子量为8000-14000，得透析液，透析液中加入质量浓度为95%的乙醇至乙醇含量达到80-90%，静置醇沉10-24h，再过滤或离心分离，得沉淀物，沉淀物经干燥粉碎，即为首乌藤多糖螯合锌粉末。

2.根据权利要求1所述的首乌藤多糖螯合锌的制备方法，其特征在于，称取干燥的首乌藤药粉400g，加水于90℃提取3次，每次3小时，第一次加药粉重量10倍的水4000g、第二次、第三次均加药粉重量8倍的水3200g，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1，得到首乌藤多糖提取液，再加入等量的0.5mol/L的硫酸锌溶液，搅拌均匀，用2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至6.0，80℃反应2.5小时，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，透析液浓缩至比重1.3，加95%乙醇调节至含醇量至80%，静置过夜，离心，将沉淀干燥，粉碎即得首乌藤多糖螯合锌。

3.根据权利要求1所述的首乌藤多糖螯合锌的制备方法，其特征在于，称取干燥的首乌藤药粉600g，加水于80℃提取2次，每次3小时，第一次加药粉重量9倍的水5400g、第二次加药粉重量9倍的水5400g，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.2，得到首乌藤多糖提取液，再加入等量的0.5mol/L的硫酸锌溶液，搅拌均匀，用2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至7，90℃反应2小时，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，透析液浓缩至比重1.2，加95%乙醇调节至含醇量至85%，静置过夜，离心，将沉淀干燥，粉碎即得首乌藤多糖螯合锌。

4.根据权利要求1所述的首乌藤多糖螯合锌的制备方法，其特征在于，称取干燥的首乌藤药粉1000g，加水于100℃提取4次，每次1.5小时，第一次加药粉重量10倍的水10000g、第二次、第三次均加药粉重量9倍的水9000g，第四次加药粉重量8倍的水8000g，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.3，得到首乌藤多糖提取液，再加入等量的0.5mol/L的硫酸锌溶液，搅拌均匀，用2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至8，70℃反应3小时，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，透析液浓缩至比重1.3，加95%乙醇调节至含醇量至90%，静置过夜，离心，将沉淀干燥，粉碎即得首乌藤多糖螯合锌。

5.权利要求1或2或3或4所述的首乌藤多糖螯合锌在制备预防和改善因缺锌而导致的食欲不振、生长迟缓，并可增强机体免疫能力的保健品和药物中的应用。