CN109776693A - 桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其包括以下步骤：1)挑选、粉碎机将桦褐孔菌；2)称取多糖，水浴提取；3)冷却，离心处理；4)取上清液，浓缩，进行脱脂；5)除蛋白，去除有机溶剂，加入无水乙醇；6)醇沉、离心，冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖；7)称取桦褐孔菌多糖、七水硫酸锌于容器中，桦褐孔菌多糖与锌离子质量比为4～6:1，使锌离子的初始浓度为4～6g/L，在室温条件下磁力搅拌6～10h，搅拌速度为120～180r/min；8)加入无水乙醇，醇沉、离心处理，取沉淀，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖螯合锌；本发明方法螯合率高，获得的Zn‑IOP螯合物的抗氧化能力得到显著增加。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备方法，具体是桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，属于螯合技术领域。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是一种珍贵的药用型真菌，它的子实体主要呈瘤状，广泛的寄生于白桦树、银桦、赤杨、榆树等的树干或树皮下，菌丝体有较强的耐寒性。北美的北部、芬兰、波兰、俄罗斯的西伯利亚、远东部分地区以及勘察加半岛、中国的黑龙江和吉林省长白山地区、还有日本北海道附近都是桦褐孔菌的主要生产地。16—17世纪以来，在俄罗斯、波兰、日本等地的民间，桦褐孔菌作为珍贵的药用菌被广泛的运用在多种疑难杂症的预防方面，如各种肝癌、胃癌、肠癌、糖尿病、心脏病等，作用独特且无任何副作用，一位日本的研究者层高度评价其为“万能药”。此外，桦褐孔菌还具有抗衰老和抑制HIV—1病毒的作用，这些诸多的功效引起了包括中国在内的多个国家研究者们的广泛重视。然而，在我国，桦褐孔菌活性成分方面的研究未成体系、不够深入，并没有有效地在中药传统理论的基础上加以现代科学技术，从而实现计量化，并通过科学研究，找出药理作用的有效部位及有效成分，应用于医学研究，发挥更广泛、更有效的作用。
《桦褐孔菌多糖纯化、结构及其抗肿瘤机制研究》一文对多糖组分进行分离，从而发现了桦褐孔菌多糖(Inonotus Obliquus polysaccharide,IOP)主要成分为由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和木糖，各自分的摩尔比为10.25：9.38：1：12.45：9.9：11.55。IOP作为一种重要多糖，没有毒副作用，和其他多糖类似，可以用来预防和治疗多种疾病，IOP具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗氧化、免疫调节功效。因其诸多功效，使得国内外广大药物研究开发者对多糖的研究越发的重视。
桦褐孔菌多糖(IOP)的药理作用包括：抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗弓形虫。
锌元素是人体内是一种微量元素，它的含量仅次于铁，是第二大微量元素。锌元素能提高人体免疫力、提高动物生产性能、促进动物机体生长、促进骨骼生长、促进食欲、参与遗传、维持皮肤和黏膜的正常结构和功能，因此锌元素被称为“生命之花”。人们通常的补锌都是摄入无机锌，但在机体内部主要是由是有机锌或锌的螯合物发生作用，而并不是游离的无机锌离子。正是因为有机锌在消化道中状态十分稳定，不会形成复合物阻碍其他物质的吸收，转化成带有生化功能的物质，有机锌的生物学效价才会显著的高于无机锌。近些年以来，Zn2+与D－氨基葡萄、金针菇多糖、壳聚糖以及黑木耳多糖的螯合工艺已经有过严谨的科学研究和报道，但是Zn2+与IOP螯合研究还未曾报道。
目前，国内外对于IOP的修饰研究主要集中在桦褐孔菌粗多糖的硫酸化修饰、酸、碱水解、热及超声处理改性修饰。对多糖进行锌(Ⅱ)螯合有利于提高多糖的生物活性、抗氧化能力、酶活性以及提高锌的生物效价等。但是目前，多糖锌(Ⅱ)螯合的报道还未形成系统，其中对于IOP与金属螯合的研究未曾见到报道。
桦褐孔菌作为一种药用真菌，在俄罗斯、波兰、日本等国民间，桦褐孔菌被广泛的运用在多种疑难杂症的预防方面，如各种癌症、心脏病、糖尿病等，作用独特且无任何副作用。研究证实桦褐孔菌具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗弓形虫等多种疗效，将其作为保健品加以开发利用，将会有很大的市场空间。
发明内容
本发明的目的是提供螯合效率高，抗氧化能力强的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法。
为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：
桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其包括以下步骤：
1、挑选桦褐孔菌，用粉碎机将桦褐孔菌粉碎。所述桦褐孔菌粉碎后过200目筛，得到颗粒大小较为均匀的粉末,增大多糖与溶液的接触面积，有利于反应充分，干燥备用。
2、称取多糖，按液料比为30～35：1，优选比为33.3∶1，在温度为83℃的条件下水浴提取(热水浸提法)2～5h，优选2.2h。
3、提取完成后进行冷却，经过离心机高速离心18～25min，离心速度为3500～4000r/min，优选离心20min，离心速度为4000r/min。
4、取上清液，将上清液真空浓缩至原体积的1/3体积，向浓缩液中加入1/4体积的石油醚脱脂进行脱脂。
5、除蛋白(采用Sevage法除蛋白)，继续旋蒸浓缩去除有机溶剂，向得到浓缩液中加入4倍体积无水乙醇。
6、在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心15～20min取沉淀，离心速度为3500～4500r/min，优选离心20min，离心速度为4000r/min，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖。
7、称取桦褐孔菌多糖、七水硫酸锌于容器中，桦褐孔菌多糖与锌离子质量比为4～6:1，加蒸馏水混匀，使锌离子的初始浓度为4～6g/L，在室温条件下磁力搅拌6～10h，搅拌速度为120～180r/min。
8、向步骤7溶液中加入4倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心20～25min，离心速度为3800～4500r/min(优选离心20min，离心速度为4000r/min)，取沉淀，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖螯合锌。
时间、锌(Ⅱ)初始浓度、桦褐孔菌多糖与锌(Ⅱ)质量比例对桦褐孔菌多糖锌(Ⅱ)螯合反应(螯合率)的影响较大。
随着时间的延长，多糖与锌(Ⅱ)充分的螯合，当反应时间达到一定值(6小时)时，螯合率达到最大，当螯合时间超过一定值(6小时)时，由于部分螯合物逐渐开始解离，使锌多糖中锌含量减少，进而导致螯合率有一定程度的下降。
时间对桦褐孔菌多糖锌(Ⅱ)螯合反应影响的验证：
称取0.8g桦褐孔菌多糖，0.88g七水硫酸锌于100mL的烧杯中，加50mL蒸馏水混匀，自然pH，室温条件下磁力搅拌(150r/min)。设置时间为2h、4h、6h、8h和10h，考察不同时间对桦褐孔菌多糖锌(Ⅱ)螯合反应的影响，并分别测定反应后样品的螯合率，从而确定反应的最佳时间。
时间对桦褐孔菌多糖多糖锌(Ⅱ)螯合修饰的影响见如图1。由图1可知：时间对多糖锌(Ⅱ)的螯合具有较为显著的影响，在较短的2-4小时内，最时间的增加螯合率对应的显著上升，4-6小时内，螯合率上升趋势有所减缓，时间为6小时时，多糖锌(Ⅱ)螯合率最高，但随后6-10小时内螯合率变化不大，故验证了最佳螯合时间为6小时。
为了多糖与锌(Ⅱ)充分螯合的同时，避免螯合物解离，使锌多糖中锌含量减少，导致螯合率下降，反应时间选择6～10h。
随着锌(Ⅱ)初始浓度的增加，锌(Ⅱ)充分与多糖的结合位点结合，螯合率逐步增加，当锌(Ⅱ)初始浓度达到一定值(4g/L)时，螯合率达到最高，当锌(Ⅱ)初始浓度高于一定值(4g/L)时，锌(Ⅱ)与多糖分子间的相互作用力的增加使得体系黏度增加，阻碍了结合位点的暴露，进而导致鳌合率增加并不显著。
锌(Ⅱ)初始浓度对桦褐孔菌多糖锌(Ⅱ)螯合反应影响的验证：
称取0.8g桦褐孔菌多糖，分别加入0.44g、0.66g、0.88g、1.1g、1.32g七水硫酸锌，制备成锌(Ⅱ)初始浓度为2、3、4、5、6g/L的溶液，自然pH，室温条件下磁力搅拌(150r/min)反应4h。考察不同锌(Ⅱ)初始浓度对桦褐孔菌多糖锌(Ⅱ)螯合反应的影响，并分别测定反应后样品的螯合率，从而确定反应的最佳锌(Ⅱ)初始浓度。
锌(Ⅱ)初始浓度对桦褐孔菌多糖多糖锌(Ⅱ)螯合修饰的影响见如下图2。由图2可知，锌(Ⅱ)初始浓度对螯合率的影响十分显著。当锌离子浓度为2-4g/L时，螯合率随锌离子浓度增加而显著增加，在4g/L时，锌(Ⅱ)与桦褐孔菌多糖的螯合率达到最大值，随之，继续增加锌离子的浓度，螯合率增加并不显著。从最佳工艺的角度而言设置验证了最佳锌(Ⅱ)初始浓度为4g/L。
为了减少锌(Ⅱ)与多糖分子间的相互作用力的增加使得体系黏度增加，阻碍结合位点的暴露，锌离子的初始浓度选择为4～6g/L。
当IOP:Zn的比例低于一定值(4:1)时，随着比例的增加，IOP多糖中的活性基团(－OH)与锌(Ⅱ)之间的接触机会增加，锌(Ⅱ)充分与活性多糖的结合位点活性基团(－OH)结合，因此螯合率逐步增加，IOP:Zn的比例达到一定值(4:1)时，螯合率达到最高；当IOP:Zn的比例大于一定值(4:1)时，继续增加IOP的量，导致整个反应体系黏度增加，锌(Ⅱ)与IOP相互之间的静电作用力增加，分散的螯合物不易自发的聚合，发生部分的降解，因此导致螯合率有所下降。
桦褐孔菌多糖与锌(Ⅱ)质量比例对桦褐孔菌多糖锌(Ⅱ)螯合反应影响的验证：
称取0.88g七水硫酸锌，分别加入2:1、3:1、4:1、5:1和6:1不同质量比的桦褐孔菌多糖，自然pH，室温条件下磁力搅拌(150r/min)反应4h。考察不同质量比对桦褐孔菌多糖锌(Ⅱ)螯合反应的影响，并分别测定反应后样品的螯合率，从而确定反应的最佳质量比。
桦褐孔菌多糖与锌(Ⅱ)质量比对桦褐孔菌多糖多糖锌(Ⅱ)螯合修饰的影响如图3。由图3可知：IOP:Zn的比例对螯合率有较为显著的影响，2:1时，多糖锌的螯合率较低，随着IOP量的成倍增加，螯合率也显著增加，当IOP:Zn的比例为4:1时，多糖锌螯合率达到最大。再继续成倍的增加IOP的量，多糖锌的螯合率并没有增加，而是有所下降，验证了最佳螯合的比例设置为4:1。
为了确保螯合率，避免整个反应体系黏度增加，减少锌(Ⅱ)与IOP相互之间的静电作用力，避免分散的螯合物不易自发聚合，发生部分的降解，桦褐孔菌多糖与锌离子质量比选择为4～6:1。
优选的时间、锌(Ⅱ)(即锌离子)初始浓度、桦褐孔菌多糖与锌(Ⅱ)质量比例：桦褐孔菌多糖与锌离子的质量比为5:1，锌离子的初始浓度为4.5g/L，在室温条件下磁力搅拌6.3h(最佳螯合时间)，在此条件下，螯合率达到最高(89.7％)。可见，上述的工艺条件并非上述各个因素的最佳参数。这是因为：影响螯合率的因素螯合时间、锌(Ⅱ)初始浓度、桦褐孔菌多糖与锌(Ⅱ)质量比之间存在交互作用，螯合时间和锌(Ⅱ)初始浓度、螯合时间和桦褐孔菌多糖与锌(Ⅱ)质量比之间的交互作用对螯合率的影响较为显著，而锌(Ⅱ)初始浓度和桦褐孔菌多糖与锌(Ⅱ)质量比交互影响并不明显。正是基于影响螯合率的因素之间的交互作用，确定了最佳螯合工艺参数。
本发明方法螯合率高(达到89.7％)；在0-1mg/mL质量浓度范围内，与未螯合的IOP相比，Zn-IOP对·OH、DPPH自由基和O2 -·均有更好的清除能力，且清除效果随其质量浓度的增加而显著增强，表明对IOP进行锌螯合后，Zn-IOP螯合物的抗氧化能力得到显著增加。
附图说明
图1为时间对螯合率的影响图。
图2为锌(Ⅱ)初始浓度对螯合率的影响图。
图3为不同质量比(IOP:Zn)对螯合率的影响图。
图4为IOP和Zn-IOP对·OH的清除作用对比图。
图5为IOP和Zn-IOP对DPPH自由基的清除作用对比图。
图6为IOP和Zn-IOP对O2 -·的清除作用对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
(1)挑选桦褐孔菌，用粉碎机将桦褐孔菌粉碎，过200目筛，得到颗粒大小较为均匀的粉末,干燥备用。
(2)称取100g多糖，按液料比为33.3：1，在温度为83℃的条件下水浴提取2.2h。
(3)提取完成后进行冷却，经过离心机高速离心20min，离心速度为4000r/min。
(4)取上清液，将上清液真空浓缩至原体积的1/3体积，向浓缩液中加入1/4体积的石油醚脱脂进行脱脂。
(5)采用Sevage法除蛋白，继续旋蒸浓缩去除有机溶剂，向得到浓缩液中加入4倍体积无水乙醇。
(6)在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心20min取沉淀，离心速度为4000r/min，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖。
(7)称取桦褐孔菌多糖1.15g、七水硫酸锌0.99g于100mL的烧杯中，加蒸馏水50mL混匀，在室温条件下磁力搅拌6.3h，搅拌速度为150r/min。
(8)向步骤(7)溶液中加入4倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心20min，离心速度为4000r/min，取沉淀，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖螯合锌。
经测定，上述桦褐孔菌多糖螯合锌螯合率为89.7％。
实施例2
(1)挑选桦褐孔菌，用粉碎机将桦褐孔菌粉碎，过200目筛，得到颗粒大小较为均匀的粉末,干燥备用。
(2)称取100g多糖，按液料比为30：1，在温度为83℃的条件下水浴提取2h。
(3)提取完成后进行冷却，经过离心机高速离心18min，离心速度为3500r/min。
(4)取上清液，将上清液真空浓缩至原体积的1/3体积，向浓缩液中加入1/4体积的石油醚脱脂进行脱脂。
(5)采用Sevage法除蛋白，继续旋蒸浓缩去除有机溶剂，向得到浓缩液中加入4倍体积无水乙醇。
(6)在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心25min取沉淀，离心速度为4500r/min，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖。
(7)称取桦褐孔菌多糖0.8g、七水硫酸锌0.88g于100mL的烧杯中，加蒸馏水50mL混匀，在室温条件下磁力搅拌6h，搅拌速度为150r/min。
(8)向步骤(7)溶液中加入4倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心25min，离心速度为4200r/min，取沉淀，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖螯合锌。
经测定，上述桦褐孔菌多糖螯合锌螯合率为87.3％。
实施例3
(1)挑选桦褐孔菌，用粉碎机将桦褐孔菌粉碎，过200目筛，得到颗粒大小较为均匀的粉末,干燥备用。
(2)称取100g多糖，按液料比为35：1，在温度为83℃的条件下水浴提取4h。
(3)提取完成后进行冷却，经过离心机高速离心25min，离心速度为4000r/min。
(4)取上清液，将上清液真空浓缩至原体积的1/3体积，向浓缩液中加入1/4体积的石油醚脱脂进行脱脂。
(5)采用Sevage法除蛋白，继续旋蒸浓缩去除有机溶剂，向得到浓缩液中加入4倍体积无水乙醇。
(6)在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心20min取沉淀，离心速度为3800r/min，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖。
(7)称取桦褐孔菌多糖1.8g、七水硫酸锌1.32g于100mL的烧杯中，加蒸馏水50mL混匀，在室温条件下磁力搅拌8h，搅拌速度为180r/min。
(8)向步骤(7)溶液中加入4倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心20min，离心速度为3800r/min，取沉淀，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖螯合锌。
经测定，上述桦褐孔菌多糖螯合锌螯合率为87.8％。
利用Fenton(水杨酸法)原理体系分别测定IOP与Zn-IOP对·OH的清除作用，Zn-IOP为上述实施例获得。结果如图4所示，对图4进行分析可知：
1.在质量浓度范围内(0-1mg/mL)IOP和Zn-IOP对·OH的清除能力较强；
2.IOP和Zn-IOP对·OH的清除作用随质量浓度升高而显著增强；
3.Zn-IOP对·OH的清除能力明显要比未修饰的IOP清除能力强很多。
上三点表明，对IOP进行多糖锌(Ⅱ)螯合后，使得Zn-IOP对·OH自由基的清除能力增加。
分别对IOP与Zn-IOP(上述实施例获得)DPPH自由基清除能力测定，结果如图5所示，对图5进行分析可知：
1.在质量浓度范围内(0-1mg/mL)，IOP和Zn-IOP对DPPH自由基的清除能力较强；
2.IOP和Zn-IOP对DPPH自由基的清除作用都随着浓度升高而显著增强；
3.从图5中可以清楚地看出，Zn-IOP对DPPH自由基的清除能力比未修饰前的IOP清除能力明显增强。
以上三点表明，对IOP进行多糖锌(Ⅱ)螯合后，使得Zn-IOP对DPPH自由基的清除能力增加。
分别对IOP与Zn-IOP(上述实施例获得)超氧阴离子自由基(O2-)清除能力测定，结果如图6所示，对图6进行分析可知：
1.在质量浓度范围内(0-1mg/mL)，IOP和Zn-IOP对O2 -·的清除能力较强；
2.IOP和Zn-IOP对O2 -·的清除作用都随着浓度升高而显著增强；
3.从图6中可以清楚地看出，Zn-IOP对O2 -·的清除能力比未修饰前的IOP清除能力明显增强。
以上表明，对IOP进行多糖锌(Ⅱ)螯合后，使得Zn-IOP对O2 -·的清除能力增加。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)挑选桦褐孔菌，用粉碎机将桦褐孔菌粉碎；
(2)称取多糖，按液料比为30～35：1，在温度为83℃的条件下水浴提取2～5h；
(3)提取完成后进行冷却，经过离心机高速离心18～25min，离心速度为3500～4000r/min；
(4)取上清液，将上清液真空浓缩至原体积的1/3体积，向浓缩液中加入1/4体积的石油醚脱脂进行脱脂；
(5)除蛋白，继续旋蒸浓缩去除有机溶剂，向得到浓缩液中加入4倍体积无水乙醇；
(6)在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心15～20min取沉淀，离心速度为3500～4500r/min，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖；
(7)称取桦褐孔菌多糖、七水硫酸锌于容器中，桦褐孔菌多糖与锌离子质量比为4～6:1，加蒸馏水混匀，使锌离子的初始浓度为4～6g/L，在室温条件下磁力搅拌6～10h，搅拌速度为120～180r/min；
(8)向步骤(7)溶液中加入4倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉24h后，离心机离心20～25min，离心速度为3800～4500r/min，取沉淀，经冷冻干燥后得到桦褐孔菌多糖螯合锌。
2.根据权利要求1所述的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述桦褐孔菌粉碎后过200目筛。
3.根据权利要求1所述的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，液料比为33.3∶1，水浴提取2.2h。
4.根据权利要求1所述的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，离心20min，离心速度为4000r/min。
5.根据权利要求1所述的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于：在所述步骤(5)中，采用Sevage法除蛋白。
6.根据权利要求1所述的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于：在所述步骤(6)中，离心20min，离心速度为4000r/min。
7.根据权利要求1所述的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于：在所述步骤(7)中，所述桦褐孔菌多糖与锌离子的质量比为5:1，锌离子的初始浓度为4.5g/L，在室温条件下磁力搅拌6.3h。
8.根据权利要求1所述的桦褐孔菌多糖螯合锌的制备方法，其特征在于：在所述步骤(8)中，离心20min，离心速度为4000r/min。
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