CN104277134B - 一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖‑锌螯合物的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）竹荪多糖的提取；（2）竹荪多糖的分离；（3）竹荪多糖的纯化；（4）在竹荪多糖溶液中加入无机锌源进行螯合反应；（5）醇沉（6）冷冻干燥，得竹荪多糖‑锌螯合物。本发明所研制的竹荪多糖‑锌螯合物，有效应用于补锌保健品及药品的制备，且通过MTT法、流式细胞术、Hoechst 33258染色法、DNA Ladder及JC‑1染色法实验证明该螯合物具有明显的抗肿瘤生理活性，有望成为治疗癌症尤其是肝癌的高效低毒药剂。

Description

一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物的制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤物质的制备方法及其应用，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物的制备方法及其应用。
背景技术
锌是人体必须的微量元素，是人体200种金属酶的组成成分或辅酶，对全身代谢都有广泛作用，如参与能量代谢、核酸和蛋白质的合成、细胞与体液免疫过程等。机体缺锌会导致基础代谢下降、蛋白质利用率降低、食欲与消化功能低下、影响生长发育等。而以往和现在临床上补锌多用硫酸锌和单纯葡萄糖酸锌等制剂，它们绝大部分在体内以离子形式吸收。锌离子一方面容易与膳食中的植酸、草酸、脂肪酸等物质结合，容易生成不溶物而导致大量流失；另一方面受结合蛋白不足等因素影响，吸收率低。
糖类是自然界中分布最为广泛的生物分子之一，是组成有机体结构的主要成分，也是细胞能量的最主要来源。糖类尤其是多糖，具有大量的活性基团、多样化的分子量和多变的化学组成，具有其他材料无可比拟的优势：生物相容性、生物可降解性、无细胞毒性等等。此外，多糖还可以通过与其他生物分子如蛋白质、核酸等分子相互作用传递识别过程，部分多糖分子还具有调节免疫力、抗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡等生物活性。多糖配合物作为补锌剂不仅具有合适的配合稳定性，对胃肠道无或甚少刺激作用，而且当其释放锌后，配体多糖就可以发挥其多方面的生理活性。
竹荪也叫竹参、竹鸡蛋或面纱菌，也被称为“真菌之花”、“山珍之王”，是世界上名贵的大型食用菌之一。竹荪多糖广泛存在于子实体的细胞壁中，是具有高活性的大分子物质，在抗肿瘤、抗凝血、抗炎症、刺激免疫以及降血糖方面都有一定的保健作用，对病毒感染性疾病也有一定的抑制作用。竹荪多糖主要的生理功能有：(1)调节免疫功能；(2)抑制肿瘤和癌细胞作用；(3)延缓衰老的作用；(4)抑菌作用；(5)降血糖、降血脂的作用；(6)对肝脏的保护作用；(7)抗诱变作用。
为了大力开发利用竹荪资源及提供一种高效的补锌剂，我们提取竹荪多糖并分离纯化后和锌离子螯合。竹荪多糖-锌螯合物不仅是一种高效的补锌剂，其还具有很高的抗肿瘤活性，在用于补锌剂保健品及药品制备的同时，还有望成为治疗癌症的高效低毒药剂。
有关多糖-锌螯合物的研究目前甚少。目前公开的中国专利中与多糖-锌螯合物相关的专利只有一个：中国专利申请公布号CN 102351959A中公开了“首乌藤多糖螯合锌的制备方法及应用”，该专利中涉及的是首乌藤多糖-锌螯合物增强机体免疫力的作用。
综上所述，有关多糖-锌螯合物抗肿瘤活性的报道目前尚无。本发明人以竹荪为原料，提取竹荪多糖并分离纯化后与无机锌源进行螯合，经醇沉，洗涤，制备具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物。本发明原料丰富，方法简单，制得的产品安全性高，可大量生产，在作为补锌剂的同时还具有极高的抗肿瘤活性，可发展成为治疗癌症尤其是肝癌的高效低毒药剂。
发明内容
本发明的目的在于通过竹荪多糖与无机锌盐的螯合制备出具有抗肿瘤活性的补锌剂，为相关抗癌药物的开发提供一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物的制备方法。
一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)竹荪多糖的提取：将干燥的竹荪子实体粉碎后，沸水浴提取多糖，浓缩，真空冷冻干燥；
(2)竹荪多糖的分离：用Sevage法对竹荪多糖除蛋白后，加入乙醇，3000～6000r/min离心10～20min，弃去上清液，将沉淀溶解于蒸馏水，重复3～5次，将得到的溶液冷冻干燥，得到竹荪多糖；
(3)竹荪多糖的纯化：把步骤(2)得到的竹荪多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，以0.05～2mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.05～2mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到螯合用的竹荪多糖；
(4)在竹荪多糖溶液中加入无机锌源进行螯合反应：将无机锌盐溶于蒸馏水配成1～3mg/mL的溶液，用0.5～2mol/L的盐酸溶液调节pH 2.0～3.0，使无机锌盐充分溶解，再按多糖与无机锌盐质量比为1：1～1：3加入3～5mg/mL的竹荪多糖溶液，漩涡混匀，用5％～10％的氨水溶液调节pH 8.0～10.0,温度保持在45～65℃下震荡反应36～50h；
(5)将反应液浓缩后加入3～5倍体积的无水乙醇将产物沉淀出来，抽滤，用60％～80％的乙醇洗涤，沉淀，最后用无水乙醇洗涤，沉淀。
(6)冷冻干燥，得竹荪多糖-锌螯合物。
上述方法中，步骤(2)所述Sevage试剂的配制方法为氯仿、正丁醇按体积比3：1～5：1混合，Sevage法脱蛋白的方法为多糖与Sevage试剂按体积比1：1～1：3混合，振摇10～30min，2000～4000r/min离心10～20min，取出上层多糖溶液，再按上述步骤重复3～5次。
上述方法中，步骤(5)所述醇沉，洗涤次数为3～5次。
上述方法中，所述无机锌盐包括ZnCl2或ZnSO4中的一种以上。
所述竹荪多糖-锌螯合物应用于肝癌药物的制备。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明公布的具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物经过醇沉，洗涤后已经除去了没有螯合上的锌离子，且通过MTT法和配体竹荪多糖对肿瘤细胞增殖的抑制能力进行了对比，结果表明，竹荪多糖-锌螯合物的抗肿瘤活性并不是来自多糖，相反多糖还能促进部分肿瘤细胞的增殖，只有当竹荪多糖和锌离子形成螯合物后才具有抗肿瘤活性。
2、本发明公布的抗肿瘤活性竹荪多糖-锌螯合物能明显抑制肝癌细胞HepG2、乳腺癌肿瘤细胞MCF-7、胃癌细胞SCG-7901、肺癌细胞A549、子宫颈癌细胞Hela以及前列腺癌细胞PC3的增殖，其中对HepG2细胞的抑制作用最为明显。
3、本发明公布的抗肿瘤活性竹荪多糖-锌螯合物制备工艺简单，产品安全，可规模化生产。
附图说明
图1a和图1b为竹荪多糖和竹荪多糖-锌螯合物分别对正常细胞和不同肿瘤细胞增殖的抑制作用图，其中图1a为竹荪多糖对各组细胞的影响图，其中图1b为竹荪多糖-锌螯合物对各组细胞的影响图；
图2a-图2d为Hoechst 33258染色法观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞DNA的损伤情况图；其中图2a为空白浓度，图2b的浓度为250μg/mL，图2c的浓度为500μg/mL，图2d的浓度为1000μg/mL；
图3为DNA Ladder检测不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞DNA的损伤情况图；
图4a-图4d为JC-1染色法观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞线粒体膜电位的影响图，其中图4a为空白浓度，图4b的浓度为250μg/mL，图4c的浓度为500μg/mL，图4d的浓度为1000μg/mL。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施不限于此。
实施例1和实施例2中所述Sevage试剂的配制方法为氯仿、正丁醇按体积比4：1混合，Sevage法脱蛋白的方法为多糖与Sevage试剂按体积比1：1混合，振摇20min，3000r/min离心10min，取出上层多糖溶液，再按上述步骤重复5次。
实施例1：
(1)竹荪多糖的提取：将100g干燥的竹荪子实体粉碎后，于沸水浴中振荡2h提取多糖，过滤，浓缩，真空冷冻干燥；
(2)竹荪多糖的分离：用Sevage法对竹荪多糖除蛋白后，加入乙醇，3000r/min离心20min，弃去上清液，将沉淀溶解于蒸馏水，重复5次，将得到的溶液冷冻干燥；
(3)竹荪多糖的纯化：把步骤(2)得到的竹荪多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，以0.05mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.05mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到竹荪多糖；
(4)竹荪多糖抗肿瘤功效：通过其对肿瘤细胞存活率及肿瘤细胞形态等指标评价其抗肿瘤功效。
实施例2：
(1)竹荪多糖的提取：将100g干燥的竹荪子实体粉碎后，于沸水浴中振荡2h提取多糖，过滤，浓缩，真空冷冻干燥；
(2)竹荪多糖的分离：用Sevage法对竹荪多糖除蛋白后，加入乙醇，3000r/min离心20min，弃去上清液，将沉淀溶解于蒸馏水，重复5次，将得到的溶液冷冻干燥；
(3)竹荪多糖的纯化：把步骤(2)得到的竹荪多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，以0.05mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.05mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到竹荪多糖；
(4)在竹荪多糖溶液中加入无机锌源进行螯合反应：将ZnSO4溶于蒸馏水配成1mg/mL的溶液，用1mol/L盐酸溶液调节pH 2.0，使ZnSO4充分溶解，再按多糖与ZnSO4质量比为1：1加入5mg/mL的竹荪多糖溶液，漩涡混匀，用5％氨水溶液调节pH 10.0,温度保持在45℃下震荡反应50h；
(5)将反应液浓缩后加入3倍体积的无水乙醇将产物沉淀出来，抽滤，用80％的乙醇洗涤，沉淀，最后用无水乙醇洗涤，沉淀。
(6)冷冻干燥，得竹荪多糖-锌螯合物，通过其对肿瘤细胞存活率及肿瘤细胞形态等指标评价其抗肿瘤功效。
实施例3：
(1)竹荪多糖的提取：将100g干燥的竹荪子实体粉碎后，于沸水浴中振荡6h提取多糖，过滤，浓缩，真空冷冻干燥；
(2)竹荪多糖的分离：用Sevage法对竹荪多糖除蛋白后，加入乙醇，6000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀溶解于蒸馏水，重复3次，将得到的溶液冷冻干燥；
(3)竹荪多糖的纯化：把步骤(2)得到的竹荪多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，以2mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以2mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到螯合用的竹荪多糖；
(4)在竹荪多糖溶液中加入无机锌源进行螯合反应：将ZnCl2溶于蒸馏水配成3mg/mL的溶液，用1mol/L盐酸溶液调节pH 2.0，使ZnCl2充分溶解，再按多糖与ZnCl2质量比为1：3加入3mg/mL的竹荪多糖溶液，漩涡混匀，用5％氨水溶液调节pH 8.0,温度保持在65℃下震荡反应36h；
(5)将反应液浓缩后加入5倍体积的无水乙醇将产物沉淀出来，抽滤，用60％的乙醇洗涤，沉淀，最后用无水乙醇洗涤，沉淀。
(6)冷冻干燥，得竹荪多糖-锌螯合物，通过其对肿瘤细胞存活率及肿瘤细胞形态等指标评价其抗肿瘤功效。
本实施方式通过不同的试验证明竹荪多糖-锌螯合物的抗肿瘤活性：(1)通过MTT法分别检测竹荪多糖和竹荪多糖-锌螯合物对不同细胞增殖的抑制作用；(2)流式细胞术检测不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞周期的影响；(3)Hoechst 33258染色法观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞DNA的损伤情况；(4)DNA Ladder检测不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞DNA的损伤情况；(5)JC-1染色法观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞线粒体膜电位的影响。
(1)通过MTT法分别检测竹荪多糖和竹荪多糖-锌螯合物对不同细胞增殖的抑制作用(图1a和图1b)；
事先培养正常肝细胞LO2、肝癌细胞HepG2、乳腺癌肿瘤细胞MCF-7、胃癌细胞SCG-7901、肺癌细胞A549、子宫颈癌细胞Hela以及前列腺癌细胞PC3，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞3min制成单细胞悬液，以5×103个细胞/孔接种96孔培养板，置于培养箱中(37℃，5％CO2)预培养24h后，加入含有不同浓度的竹荪多糖或竹荪多糖-锌螯合物的培养基100μL/孔，继续培养48h。往培养板加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，37℃孵育4h后弃上清，加入DMSO 100μL/孔，振荡10min，紫色结晶物充分溶解后，测定各孔OD570值。以对照组OD570为100％，计算药物处理后各组细胞存活率。
细胞存活率(％)＝(OD570实验组/OD570对照组)×100％
由图中可观察得到竹荪多糖-锌螯合物的抗肿瘤活性并不是来自单独的多糖，而是通过多糖和锌生成的螯合物才具有的。竹荪多糖-锌螯合物对正常肝细胞LO2、肝癌细胞HepG2、乳腺癌肿瘤细胞MCF-7、胃癌细胞SCG-7901、肺癌细胞A549、子宫颈癌细胞Hela以及前列腺癌细胞PC3增殖都有抑制作用，其中对HepG2细胞的抑制作用最为明显，而对正常肝细胞影响不大。这表明，该螯合物不仅对肝癌细胞和正常细胞间有选择性，而且对不同的肿瘤细胞也有一定的选择性，具有应用于肿瘤治疗的潜力。
(2)流式细胞术检测不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞周期的影响；
用0.25％胰蛋白酶消化贴壁HepG2细胞3min制成单细胞悬液，以5×103个细胞/孔接种6孔培养板，置于培养箱中(37℃，5％CO2)预培养24h后，分别加入250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL竹荪多糖-锌螯合物的培养基100μL/孔，并以空白为对照，继续培养48h。流式细胞法计数细胞周期各期的细胞数目。
检测结果，S期细胞明显增多，细胞被阻滞在S期，从而抑制癌细胞DNA合成和细胞增殖。
(3)Hoechst 33258染色法观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞DNA的损伤情况(图2a-图2d)；
按上述方法，用不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物培养HepG2细胞，涂片，Hoechst 33258染色，在荧光显微镜下观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞的影响。
从图中可观察得到，随着浓度的增加，荧光亮度增加，HepG2细胞核固缩，在1000μg/mL浓度下能明显观察到凋亡小体。
(4)通过DNA Ladder检测不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞DNA的损伤情况(图3)；
按上述方法，用不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物培养HepG2细胞，DNA Ladder检测试剂盒提取DNA，琼脂糖凝胶电泳分析DNA条带。A、B、C、D、E条带分别为Marker、对照、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL。
从图中可观察得到，随着浓度的增加，癌细胞出现明显凋亡特征。
(5)JC-1染色法观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞线粒体膜电位的影响(图4a-图4d)；
按上述方法，用不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物培养HepG2细胞，涂片，JC-1染色，在荧光显微镜下观察不同浓度的竹荪多糖-锌螯合物对HepG2细胞的影响。
从图中可观察得到，随着竹荪多糖-锌螯合物浓度的增加，细胞出现绿色荧光的数量增多，说明线粒体膜电位下降，线粒体膜外翻，癌细胞凋亡。

Claims (5)

1.一种具有抗肿瘤活性的竹荪多糖-锌螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）竹荪多糖的提取：将干燥的竹荪子实体粉碎后，沸水浴提取多糖，浓缩，真空冷冻干燥；
（2）竹荪多糖的分离：用Sevage法对竹荪多糖除蛋白后，加入乙醇，3000 ~ 6000 r/min离心10 ~ 20 min，弃去上清液，将沉淀溶解于蒸馏水，重复3 ~ 5次，将得到的溶液冷冻干燥，得到竹荪多糖；
（3）竹荪多糖的纯化：把步骤（2）得到的竹荪多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，以0.05 ~ 2 mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.05 ~ 2 mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到螯合用的竹荪多糖；
（4）在竹荪多糖溶液中加入无机锌源进行螯合反应：将无机锌盐溶于蒸馏水配成1 ~ 3 mg/mL的溶液，用0.5 ~ 2 mol/L的盐酸溶液调节pH 2.0~3.0，使无机锌盐充分溶解，再按多糖与无机锌盐质量比为1 ：1 ~ 1 ：3加入3 ~ 5 mg/mL的竹荪多糖溶液，漩涡混匀，用5% ~ 10%的氨水溶液调节pH 8.0 ~ 10.0,温度保持在45 ~ 65 ℃下震荡反应36 ~ 50 h；
（5）将反应液浓缩后加入3 ~ 5倍体积的无水乙醇将产物沉淀出来，抽滤，用60% ~ 80%的乙醇洗涤，沉淀，最后用无水乙醇洗涤，沉淀;
（6）冷冻干燥，得抗肿瘤活性竹荪多糖-锌螯合物，所得抗肿瘤活性竹荪多糖-锌螯合物能抑制肝癌细胞HepG2、乳腺癌肿瘤细胞MCF-7、胃癌细胞SCG-7901、肺癌细胞A549、子宫颈癌细胞Hela以及前列腺癌细胞PC3的增殖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述Sevage中Sevage试剂的配制方法为氯仿、正丁醇按体积比3 ：1 ~ 5 ：1混合，Sevage法脱蛋白的方法为多糖与Sevage试剂按体积比1 ：1 ~ 1 ：3混合，振摇10 ~ 30 min，2000 ~ 4000 r/min离心10 ~ 20 min，取出上层多糖溶液，再按上述步骤重复3 ~ 5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5）所述用无水乙醇洗涤的洗涤次数为3 ~ 5次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机锌盐包括ZnCl2或ZnSO4中的一种以上。
5.权利要求1所述的方法制备得到的竹荪多糖-锌螯合物应用于肝癌药物的制备。
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