CN106188259A - 一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法 - Google Patents

一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，包括大豆凝集素水提液制备、反胶束溶液配制、前萃取过程和反萃取过程步骤。本发明所提供的大豆凝集素分离纯化方法所需时间短，对设备要求低，实施成本小、操作快速简便，易于连续化生产和工业化放大，分离纯化和浓缩可同时完成，大豆凝集素纯度达到85%以上，收率达到85%以上，提取过程中采用结构修饰过的松树皮提取物作表面活性剂，能有效保护大豆凝集素，使其不易失活，且纯度高，后续仅需一步简单的离子交换色谱法或层析法即可获得高纯品。

Description

一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法
技术领域
本发明属于化工分离技术领域，具体涉及一种大豆凝集素的分离纯化方法，尤其涉及一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法。
背景技术
凝集素(lectin或agglutinin)是一类具有糖专一性，可与细胞表面特殊糖蛋白、糖脂的寡糖结构结合，促使细胞凝集或糖复合物沉淀的，非免疫来源的糖蛋白或糖结合蛋白。凝集素用途广泛，在生物化学研究中可用于含糖高分子的分离纯化和糖链结构的鉴定；在生物学研究中可专一识别细胞表面信号分子，用于选择突变细胞株、研究细胞机制和细胞表面特征及鉴定微生物；在免疫学研究中可促细胞有丝分裂，抑制肿瘤等恶性细胞的生长；在医学上可鉴定血型，诊断病变和作为载体分子使药物专一地靶向不同的细胞和组织。因此，凝集素在现代科研领域是一种重要的研究工具，凝集素的分离纯化具有极为诱人的科研价值和市场前景。
凝集素的研究始于1888年Herman Stillmark偶然发现蓖麻毒素(Ricicn)。至今已发现的凝集素以植物凝集素类为主，近1000种，广泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾木科、百合科和石蒜科等众多的植物类群中，其中以豆科植物中的凝集素种类最为丰富，目前已有600余种。大豆是我国主要的油料作物之一，在世界农业生产和贸易中占有重要地位。对于食用豆类中含量较少的一些抗营养因子，如凝集素、胰蛋白酶抑制剂等的研究报道较少。鉴于凝集素具有很好的发展前景，因此，大豆凝集素的分离和纯化研究有着重要的现实意义。
目前，凝集素的分离纯化方法基本按照蛋白质的传统分离方法进行，一般先将提取物经酸沉或盐析，然后经阴离子和阳离子交换多次层析。在凝集素糖结合专一性已知的情况下，可利用亲和层析法进行分离纯化。程悦生等(1997)利用凝集素特殊的疏水结合位点，采用疏水相互作用色谱法分离得到大豆凝集素；200510011480.2通过不同饱和度的硫酸铵分级沉淀及多步的离子交换柱层析，得到一种黄芪凝集素蛋白；200610097429.2通过超声强化酸提、盐析、热处理、超滤、亲和层析等技术手段获得麦胚凝集素；201110114904.3公开了一种纯化大豆凝集素的亲和层析填料D-GalN-FF-sepharose4B；201110025266.8用硫酸铵分级沉淀、超滤除盐和浓缩、离子交换层析等方法纯化得到一种蒜头果仁凝集素。但是，以上方法还尚未摆脱凝集素分离纯化过程中存在的操作繁琐、处理量低、损耗大和耗时长(一般为1～3天)的不足之处。因此，建立快速、高效的凝集素分离纯化技术势在必行。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，解决大豆凝集素分离纯度低、成本高、工艺多、时间长的问题，提供一种高效率、易于操作、成本低且安全环保的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，具体包括以下步骤：
(1)大豆凝集素水提液制备：将豆类磨成粉，过40～100目筛，溶于蒸馏水中，10～60℃下超声辅助浸提5～60min，浸提后经8000～15000rpm、4℃离心10～20min，取上清液即为大豆凝集素水提液，所述蒸馏水与大豆粉的体积比为5～50：1；
(2)反胶束溶液配制：将表面活性剂和助溶剂甘油加入到有机溶剂中，搅拌至表面活性剂完全溶解，再加入水，使体系Wo值＝15～35，表面活性剂浓度为200～300mM，静置所得透明溶液即为反胶束溶液，所述助溶剂的添加量为反胶束溶液总量的0～10％，所述Wo表示反胶束溶液中水与表面活性剂的摩尔浓度比值，Wo≈[H2O]/[表面活性剂]；
(3)前萃取过程：调节步骤(1)所得大豆凝集素水提液pH值为4.0～6.0，离子强度为20～200mM，盐离子类型优选NaCl，将其与反胶束溶液按照体积比为1:1～50的比例摇床震荡混合5～40min后，1500～5000rpm离心分层，取上层有机相；
(4)反萃取过程：将步骤(3)所得上层有机相与丙酮、蒸馏水混合5～40min后，1500～5000rpm离心分层，取下层水相，经冷冻干燥，得到分离纯化后的大豆凝集素，所述步骤(3)所得上层有机相与丙酮、蒸馏水的体积比为1：1～5：1～5。
作为优选，步骤(1)中所述豆类种类为选自黄豆、青豆和黑豆中的至少一种。
作为优选，步骤(2)中所述有机溶剂选自戊烷、环己烷、正己烷、辛烷、异辛烷、己醇和丁醇中的至少一种。
更优选，步骤(2)中所述有机溶剂为异辛烷。
作为优选，步骤(2)中所述表面活性剂为结构修饰过的松树皮提取物，具体制备方法如下：
将松树皮提取物溶于丙酮中，于-10℃下加入吡啶，再缓慢滴加脂肪酰氯，反应1～8h后加水稀释反应液，分出有机相，剩余水相用乙酸乙酯萃取后，合并所得有机相，得到酯化接枝松树皮提取物溶液；依次用1mol/L HCl、饱和Na2CO3溶液、饱和NaCl溶液洗涤，真空干燥得到表面活性剂，所述HCl、饱和Na2CO3溶液和饱和NaCl溶液的体积用量均为酯化接枝松树皮提取物溶液体积的1～4倍。
更优选，所述松树皮提取物含有95％的原花青素低聚物，分子量范围为578～1762。
更优选，所述脂肪酰氯选自己酰氯、辛酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、油酸酰氯和硬脂酸酰氯中的至少一种。
更优选，所述松树皮提取物、丙酮、脂肪酰氯和乙酸乙酯的质量之比为1:1～4：0.8～2.6：1～4，松树皮提取物的质量与吡啶的质量之比为1:0.5～1.6。
本发明中凝集素含量采用血凝法测定，大豆凝集素的评价标准为：
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所提供的大豆凝集素分离纯化方法所需时间短，对设备要求低，实施成本小、操作快速简便，易于连续化生产和工业化放大，分离纯化和浓缩可同时完成，大豆凝集素纯度达到85％以上，收率达到85％以上。
(2)本发明大豆凝集素被表面活性剂和水分子所保护，不易失活，且纯度高，后续仅需一步简单的离子交换色谱法或层析法即可获得高纯品。
(3)本发明所制备的表面活性剂，反胶束萃取凝集素时，可对凝集素进行选择性的可逆结合。
(4)本发明所用萃取溶剂均可重复利用，节约成本，降低环境污染，为一种绿色、环保的生物活性物质提取方法。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
(1)表面活性剂制备过程：
取松树皮提取物50g，溶于50g的丙酮，于‐10℃下加入35g吡啶作为敷酸剂，再缓慢滴加50g己酰氯，反应1h后加水稀释反应液。分出有机相，水相用50g乙酸乙酯萃取，合并有机相，得到酯化接枝松树皮提取物溶液；依次用1倍体积的1mol/L HCl、饱和Na2CO3溶液、饱和NaCl溶液洗涤，真空干燥得到表面活性剂。
(2)大豆凝集素水提液制备：取50g优质黄豆磨粉，过40目筛，溶于250mL蒸馏水中，10℃下超声辅助浸提60min(120W)，浸提后经12000rpm、4℃离心15min，取上清液；
(3)反胶束溶液配制：将45g表面活性剂和2g助溶剂甘油完全溶于65g异辛烷中，加入14g水使反胶束溶液浓度约为200mM，体系Wo值为35，本实施例中加入助溶剂甘油，约占总量的1.6％；
(4)前萃取过程：调节大豆凝集素水提液pH值为4.0，以NaCl调节水提液的离子强度为20mM，将大豆凝集素水提液与反胶束溶液按照体积比为1:1的比例混合，摇床震荡混合10min后，1500rpm离心分层10分钟，取上层有机相；
(5)反萃取过程：将上述上层有机相与1倍体积的丙酮和2倍体积的蒸馏水混合，摇床震荡混合10min后，1500rpm离心分层10分钟，取下层水相，经冷冻干燥得到分离纯化后的黄豆凝集素。
本实验用血凝法来测定凝集素含量，大豆凝集素的纯度达到89％，收率为88％。
实施例2：
(1)表面活性剂制备过程：
取松树皮提取物50g，溶于200g的丙酮，于‐10℃下加入50g吡啶作为敷酸剂，再缓慢滴加60g辛酰氯，反应2h后加水稀释反应液。分出有机相，水相用50g乙酸乙酯萃取，合并有机相，得到酯化接枝松树皮提取物溶液；依次用1.5倍体积的1mol/L HCl、饱和Na2CO3溶液、饱和NaCl溶液洗涤，真空干燥得到表面活性剂。
(2)大豆凝集素水提液制备：取50g优质青豆磨粉，过70目筛，溶于500mL蒸馏水中，25℃下超声辅助浸提30min(120W)，浸提后经12000rpm、4℃离心15min，取上清液；
(3)反胶束溶液配制：将70g表面活性剂和5g助溶剂甘油完全溶于65g戊烷中，加入11g水，使反胶束溶液浓度约为250mM，体系Wo值约为20；
(4)前萃取过程：调节大豆凝集素水提液pH值为5.0，以NaCl调节水提液的离子强度为100mM，将大豆凝集素水提液与反胶束溶液按照体积比为1:20的比例混合，摇床震荡混合20min后，3000rpm离心分层10分钟，取上层有机相；
(5)反萃取过程：将上述上层有机相与2倍体积的丙酮和1倍体积的蒸馏水混合，摇床震荡混合20min后，3000rpm离心分层10分钟，取下层水相，经冷冻干燥得到分离纯化后的青豆凝集素。
用血凝法来测定凝集素含量，大豆凝集素的纯度达到88％，收率为86％。
实施例3：
(1)表面活性剂制备过程：
取松树皮提取物50g，溶于150g的丙酮，于‐10℃下加入60g吡啶作为敷酸剂，再缓慢滴加95g肉豆蔻酰氯，反应8h后加水稀释反应液。分出有机相，水相用12.5g乙酸乙酯萃取，合并有机相，得到酯化接枝松树皮提取物溶液；依次用4倍体积的1mol/L HCl、饱和Na2CO3溶液、饱和NaCl溶液洗涤，真空干燥得到表面活性剂。
(2)大豆凝集素水提液制备：优质黑豆磨粉，过100目筛，溶于50倍(体积)蒸馏水中，60℃下超声辅助浸提5min(120W)，浸提后经12000rpm、4℃离心15min，取上清液；
(3)反胶束溶液配制：将130g表面活性剂和24g助溶剂甘油完全溶于40g正己烷和40g丁醇中，加入12g水，使反胶束溶液浓度约为300mM，体系Wo值约为15，本实施例中加入助溶剂甘油，占总量的10％；
(4)前萃取过程：调节大豆凝集素水提液pH值为6.0，以NaCl调节水提液的离子强度为150mM，将大豆凝集素水提液与反胶束溶液按照体积比为1:30的比例混合，摇床震荡混合30min后，4000rpm离心分层10分钟，取上层有机相；
(5)反萃取过程：将上述上层有机相与4倍体积的丙酮和1倍体积的蒸馏水混合，摇床震荡混合30min后，4000rpm离心分层10分钟，取下层水相，经冷冻干燥得到分离纯化后的黑豆凝集素。
用血凝法来测定凝集素含量，大豆凝集素的纯度达到88.5％，收率为90％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）大豆凝集素水提液制备：将豆类磨成粉，过40～100目筛，溶于蒸馏水中，10～60℃下超声辅助浸提5～60min，浸提后经8000～15000rpm、4℃离心10～20min，取上清液即为大豆凝集素水提液，所述蒸馏水与大豆粉的体积比为5～50：1；
（2）反胶束溶液配制：将表面活性剂和助溶剂甘油加入到有机溶剂中，搅拌至表面活性剂完全溶解，再加入水，使体系Wo值=15～35，表面活性剂浓度为200～300mM，静置所得透明溶液即为反胶束溶液，所述助溶剂的添加量为反胶束溶液总量的0～10% ，所述Wo表示反胶束溶液中水与表面活性剂的摩尔浓度比值，Wo≈[H2O] / [表面活性剂]；
（3）前萃取过程：调节步骤（1）所得大豆凝集素水提液pH值为4.0～6.0，离子强度为20～200mM，将其与反胶束溶液按照体积比为1:1～50 的比例混合5～40min 后，1500～5000rpm离心分层，取上层有机相；
（4）反萃取过程：将步骤（3）所得上层有机相与丙酮、蒸馏水混合5～40min后，1500～5000rpm离心分层，取下层水相，经冷冻干燥，得到分离纯化后的大豆凝集素，所述步骤（3）所得上层有机相与丙酮、蒸馏水的体积比为1：1～5：1～5。
2.根据权利要求1所述的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，步骤（1）中所述豆类种类为选自黄豆、青豆和黑豆中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，步骤（2）中所述有机溶剂选自戊烷、环己烷、正己烷、辛烷、异辛烷、己醇和丁醇中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，步骤（2）中所述有机溶剂为异辛烷。
5.根据权利要求1所述的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，步骤（2）中所述表面活性剂为结构修饰过的松树皮提取物，具体制备方法如下：
将松树皮提取物溶于丙酮中，于-10℃下加入吡啶，再缓慢滴加脂肪酰氯，反应1～8h后加水稀释反应液，分出有机相，剩余水相用乙酸乙酯萃取后，合并所得有机相，得到酯化接枝松树皮提取物溶液；依次用1mol/L HCl、饱和Na2CO3溶液、饱和NaCl溶液洗涤，真空干燥得到表面活性剂，所述HCl、饱和Na2CO3溶液和饱和NaCl溶液的体积用量均为酯化接枝松树皮提取物溶液体积的1~4倍。
6.根据权利要求5所述的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，所述松树皮提取物含有95%的原花青素低聚物。
7.根据权利要求5所述的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，所述脂肪酰氯选自己酰氯、辛酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、油酸酰氯和硬脂酸酰氯中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的反胶束分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于，所述松树皮提取物、丙酮、脂肪酰氯和乙酸乙酯的质量之比为1:1～4：0.8～2.6：1～4，松树皮提取物的质量与吡啶的质量之比为1:0.5～1.6。
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