KR850001938B1 - 항암제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

항암제의 제조방법

제1도는 컬럼세파로우스 6B에 의하여 본 발명에 관한 물질을 전개한 상태를 나타내는 분화전개도.

제2도는 LEM 또는 mDAB 투여에 의한 시험쥐의 체중증가율을 나타내는 그래프.

제3도는 LEM 또는 mDAB투여에 의한 시험쥐의 연명효과를 나타내는 그래프.

제4도는 LAP-1, LAP-2 투여에 의한 시험쥐 간암세포의 상태를 나타내는 도면 대용 현미경사진.

제5도는 같은 LAP-1, LAP 투여에 의한 시험쥐의 연명효과를 나타내는 그래프.

본 발명은 버어거스 등 키실로오스 성분이 풍부한 고체배지에서 배양된 표고버섯등의 균사체배양물 중에 함유되는 키실로오스를 주성분으로 하는 당 단백으로 구성되는 항암제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명 자등은 오랜 시일에 걸쳐서 표고버섯등 담자균에 속하는 식용버섯의 균사체에 대하여 여러가지로연구를 거듭한 결과 그 균사체속에 함유되는 약효성분의 추출방법에 대하여 많은 발명을 완성하는 한편 이 균사체 추출액속에 사이트카이닌계의 활성물질이 함유되고 있는 사실 및 이 균사체 추출액이 식물바이러스에 대하여 유효하다는 것을 이미 알고 있었다(특공소 55-34769호).

또, 담자균류에 속하는 자실체균자체, 버어거스등에 항암성물질이 존재한다는 사실및 그 물질이 세포벽의 구성성분인 글루칸 또는 펩티드글루칸인 사실도 이미 알려져 있다.

이와 같이 종래에 있어서의 상기와 같은 물질에서 추출한 항암물질의 주된 작용기작은 면역력의 증강, 즉 애듀밴드의 영역을 넘지 못하고 또 합성화학물질로 구성되는 항암제도 물론 개발되고 있으나, 이것으로는 암세포와 더불어 정상세포도 파괴되어 강한 부작용을 초래하는 등의 문제점이 있었다.

본 발명은 이러한 문제점을 고려하여 연구된 것으로 본 발명은 키실로오스 성분이 풍부한 고체배지에서 배양된 균사체 배양물중에 함유되는 키실로오스를 주성분으로 하는 당단백으로 구성되는 항암제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자등은 오랜시일에 걸쳐서 표고버섯등 담자균류에 속하는 균사체배양물에서 추출하는 수단에 대하여 많은 실험연구를 쌓아 왔다. 그 결과, 그 추출수단에 대하여 그 나름대로의 성과를 얻었으나, 그 유효성분의 정체는 명확히 밝혀지지 않았다.

즉, 본 발명자등은 앞서 버어거스등 섬유질성분을 주재로 하고, 그것에 쌀겨등을 첨가하여 구성되는 고체배지로 표고버섯등 담자균에 속하는 균사체를 배양하고, 이 균사체배양물에서 항암물질을 추출하는 추출방법에 대하여 발명을 완성하고 있으나(특원소 56-90265호), 본 발명은 상기 발명을 더욱 발전시키고, 그 추출액을 분석한 결과 얻어진 것이다.

즉, 상기 추출액을 분석한 결과, 이 추출액속에는 키실로오스를 주성분으로 하는 당, 단백이 대량으로 함유되고, 또 배지성분을 분석한 결과, 예를들면 버어거스(사탕수수를 짠 찌꺼기), 쌀겨 등에는 키실로오스가 대량으로 함유되고 있어, 따라서 본 발명자등은 이 키실로오스를 주성분으로 하는 당단백이 항암작용을 하고 있는 것으로 인정했다.

본 발명은 상기와 같은 이유로 키실로오스성분이 풍부한 배지를 채택해야 하나, 이를 위해서는 예를들어버어거스, 짚, 보리짚, 옥수수대, 삼나무등의 단자엽식물을 들 수 있다. 또, 배지영양원으로는 쌀겨를 들 수 있다. 그중 버어거스는 종래 그것의 결정적인 용도는 없고, 주로 소각처분하는 것이 형상으로 되어있기 때문에, 그 입수는 간단하고 염가한다.

또, 본 발명에 있어서 사용되는 담자균류로서는 표고버섯, 평버섯(平葺), 느티나무버섯, 파리버섯등을 들 수 있으나, 표고버섯균사체배양물에서 추출하는 것이 가장 활성이 우수하다.

본 발명방법에 의하여 얻어진 물질은 이것을 세파로우스 6B에 의한 컬럼크로마토에 의하여 분획(分劃)하고, 가스크로마토그래피에 의하여 분석한 결과, 키실로오스를 주성분으로 하는 당 단백이 함유하고 있음이 판명되었다.

본 발명방법으로 얻어진 물질은 특히 항암효과가 우수하고 이것의 특징은 화학발암물질에 의한 발암작용의 저하, 즉 발암예방효과 및 자가발암의 단암상태의 연명효과에 있어서 우수한 효과를 지니는 동시에 암세포에 대해서만 작용하고, 정상세포에 대해서는 하등 영향을 주지 않고, 부작용이 전혀 없는 것이 실험의 결과 판명되었다.

이하 실시예를 설명한다.

분쇄한 버어거스 90%, 쌀겨 5%, 밀기울 등의 영양 5%를 배합한 고체배지를 상법으로 살균하여, 이것에 표고버섯의 고체종균을 접종한다. 접종이 완료된 배지는 실온 18℃~20℃, 습도 60%로 공조(空調)한 배양실내에 옮겨서 균사체의 배양을 실시한다.

상기 배양이 완료된 배지는 재배실에 옮겨서 방치하면, 배지표면에서 표고자실체의 발생이 시작되나, 이 시점에서 배지를 재배실에서 꺼내서 이것을 쇄분기로 모지(拇指)정도의 크기로 분쇄한다.

이 분쇄한 배지균(사체와 배지를 혼합한 상태의 것으로 이하 이것을 균사체배양물로 호칭한다)는 이것을 탱크속에 충전하는 동시에 균사체배양물 600g에 대하여 pH3~pH8로 조정한 5ℓ의 청수(淸水)를 첨가하여 일정시간을 유지하면서 단계적으로 변화시켜서 혼합, 교반을 실시한다. 즉, 온도는 40℃~60℃로 각 pH에 맞추어서 변화시키나, 이것은 균사체배양물중에 존재하는 셀루라아제, 키티나아제, 글르코시다아제, 프로테아제등의 효소의 활성조건에 맞추어서 엔티메이션을 촉진하기 위한 것이다. 최종적으로는 효소의 실활(失活)을 겸하여 온도를 80℃로 상승시켜서 혼합, 교반을 실시하나, 이 교반으로 균사체 성분 균사체의 대사산물 및 배지성분중의 목질분해물이 물에 용탈(溶脫)된다.

이와 같이 얻어진 현탁액은 이것을 플란넬천의 여과대에 넣어 이것을 가압여과해서 그 여액을 덴블란필터로 여과, 멸균하여 추출액을 얻는다.

다음에 상기와 같이 얻어진 추출액을 동결건조 해서 분말체(이하 LEM로 호칭한다)로 하여, 다시 이 LEM의 수용액에 4배용의 알코올을 첨가하여, 생성된 침전을 80% 알코올으로 2회 세척하는 동시에 이 침전물을 원심분리하여 동결건조해서 분말체를 만들었다(이하 이것을 LAP로 호칭한다).

또, 상기 LAP의 특성은 갈색을 띤 분말이고, 융점은 불명확하고, 강하게 가열하면 탄화되고, 일반유기 용매에는 불용이고, 물에는 가용이고, 용해도는 높다.

(1) LAP-1, LAP-2의 조정

상기와 같이 얻어진 LAP를 소량의 물에 용해하여, 세파로우스 6B의 컬럼크로마토에 의하여 분획하고, Lowry법 Anthrone H₂SO₄법에 의하여 당단백의 반응을 측정했다. 그 결과는 제1도는 도시한다.

도면에서……선은 28nm-●-선은 Lowry법에 의한 660nm, -○-선은 안델론황산법에 의한 620nm 흡수도를 나타낸다. 이로 인해 LAP은 크게 2획분되고 분획번호 14-30번까지를 LAP-1, 31-42번까지를 LAP-2로 하고, 이들을 동결, 건조했다. 이들 2획분의로 부터의 총수율은 95%이상, LAP-1/LAP-2의 중량비는 약 1/2이었다.

양획분은 하기의 표 1의 표시와 같이, 당과 단백질을 주성분으로 하고, LAP-1은 갈색광택을 지니는 엿모양의 분말로, LAP-2 담갈색 광택을 가지는 미세 분말로서 얻어졌다.

[표 1]

(2) 아미노산조성

표 2에 LAP, LAP-1, LAP-2획분의 아미노산 조성을 나타낸다. 이들 3획분이 다같이 아스팔라긴산, 글로타민산, 글리신, 세린을 주성분으로 하고, 사스테인이 LAP-2획분에서 많고, LAP-1획분의 약 5배가 검출 되었다.

[표 2]

(3) 당조성

표 3에 LAP, LAP-1, LAP-2 획분의 당조성을 나타낸다. 이들 획분이 다같이 키실로오스를 가장 많이 함유하고, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 아라비노오스도 상당한 검출되었다. 또, 표고버섯자실체(Fluit body)는 글르코오스와 만노오스를, 표고버섯균사체(Mycelium)는 글르코오스와 주요구성당으로 하고 있는 것을 알 수 있다.

또, 배지성분인 버어거스와 쌀겨에서는 글루코오스 이외에, 갈락토오스, 아라비노오스, 키실로오스도 상당한 비율로 검출되었다.

[표 3]

한편 상기 표 1의 표시와 같이 상기 3획분의 당함량은 LAP, LAP-1에서 대략 60%, LAP에서 약 50%이었다. 이상과 같은 분석결과에서 본 발명에 관한 항암제는 키실로오스를 주성분으로 하는 당단백임이 판명되었다. (4-1)실험과 방법(21)

A. 아조색소간암

위스터계 수시험쥐(5주령)을 0.06% 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene(m DAB) 배합사료(닛본크레어사제)로 6개월간 사육하고, 그후, 보통사료로써 간종양을 유도했다.

B.복수(腹水)간암세포

4-dimethylaminoazobenzene으로 유도한 간암 유래의 AH 414담양시험쥐(사사끼연구소, 사토오박사로부터 받음)의 복수세포를 동류우계 수시험쥐(140~150g)에 계대(繼代)이식하여 본 실험에 사용했다.

C. LEM의 투여

LEM분말을 0.9% 식염수에 용해하고, 이것을 사육개시후 10일간 1일 간격으로, 또 30일간 2일 간격으로 700mg/kg을 계속해서 60일간을 2일간격으로 250mg/kg을, 그 다음 4일간격으로 100mk/kg을, 또연명효과 시험에서는 2일간격으로 300mg/kg을 각각 복강내에 주사투여 했다. 복수세포의 증식시험에서는 1마리당 50mg 또는 100mg을 이식직전에, 또 1일 간격으로 동량을 계 4회, 복강내에 주사투여 했다. 그 다음에 8일째에 개복하여 세포수, 복수량을 측정했다.

D. LEM 투여와 체중 변화

도면 2에 LEM 또는 mDAB 투여에 의한 시험쥐의 체중증가율 (

×100)을 나타냈다. C는 보통사료로 사육하고 0.9% 식염수를 L는 LEM를 각각 투여한 군, LD는 mDAB 배합시료로 사육하고 LEM을, 0은 0.9% 식염수를 각각 투여한 군이다. C군에 대하여 다른 3군의 증가율은 사육 100~150일간으로 모두 5~15% 낮았다.

E. LEM 투여와 간의 중량 변화

체중에 대한 간의 중량의 비율(%)은 사육 41주간일(287)에서 대략 D군이 16%, LD군이 9%, L군이4%, C군이 3.5%이었다(표 4). 또 LD군의 D군에 대한 간중 증가억지율[(D군간중~LD군간중)×1/D]군 간중]은, 사육 23주간으로 14.0%, 41주간으로 50.6%이었다(표 5). 또 L군의 간장은 그 색조형태가 C군의 것과 변함이 없고, 이것에 대하여 LD군의 간장은 700mg/kg 투여기간중에 흑갈색을 나타내고, LEM의 간장내 저류가 시사되었다.

[표 4]

아조색소 간암형성에 의한 체중에 대한 간중증가율과 LEM의 투여

( ) 내의 숫자는 마리수

[표 5]

아조색소간암형성에 의한 간의 중량증가와 LEM의 투여

( ) 내의 숫자는 마리수

Sr, DL군의 간의 중량증가 억지율

F. 생존율

mDAB 배합사료로 10주간, 또는 20주간 사육하고 투여를 개시했다. 각군의 50% 생존율은 비투여군(D)에서 209일, 20주간 후 투여군(DLE20)에서 206일, 10주후 투여군(DLE 10)에서 279일이었다(도면 3).

E. LEM 투여와 복수세포

표 6에 LEM 투여에 의한 복수세포의 증식변화를 표시했다. 이들의 값은 2회의 반복시험에서의 각군 10마리중 체중이 최대위, 중위, 최소위의 3마리의 평균치이다. 이와 같이 복수 1ml중의 세포수는 LEM 투여군에서 적고, 비투여군(AS)에 대한 비율(%)은 50mg 투여군(ASLE 50)에서 52%, 100mg 투여군(ASLE 100)에서 22%이었다. 참고로, 세포수에 복수량을 곱한 값(전세포수)도 적고, 그 비율(%)은 ASLE 50군에서 58.3%, ASLE 100군에서 24.6%이었다. LEM 투여군을 위상차 현미경으로 시찰하면 세포경, 외부형태가 일정하지 않고, 각소에 세포의 응집괴가 보인다. 특히 ASLE 100군에서는 이 현상이 심하고, 거대한 세포응집괴나 액포상 구조를 가지는 세포가 각소에서 볼 수 있다.

[표 6]

복수간암세포 AH 414의 중식과 LEM의 투여

G. LAP 투여와 복수세포

LEM는 80% 알코올중에서 그 전중량의 약 30%가 침전한다. 이 불용획분 LAP의 투여량을 상기의 LEM 투여량의 30%(15mg 또는 30mg)로 하고, LEM와 동일한 시험을 실시했다. 이와 같이 비투여군(AS)에 대한 투여군의 복수 1ml당의 세포수는 모두 적고, 그 비율(%)은 15mg 투여군(ASLA 15)에서 48%, 30mg 투여군(ASLA 30)에서 39%이었다(표 7). 이들의 결과는 ELM 증식억제물질이 LAP획분에 존재하는 것을 강력히 시사했다. 참고로, 이 획분은 물에 극히 잡용해하고, 당(약 58%), 단백질(약 25%)을 주성분으로 하고, 또 폴리페놀류의 존재가 추정되었다.

[표 7]

복수간암세포 AH 414의 증식과 LAP의 투여

Sr, 비투여군(AS)의 세포수를 100으로 했을때의 값 ASLA 15, 15mg 투여군 ASLA30, 30mg 투여군

H. 결 과

LEM의 항암성획분 LAP는 물에 이용이고 알코올에 불용이고, 그 약 80% 이상이 당과 단백질로 구성되는 것이 판명되었다. 또 LAP의 항암성이 혼합물로서의 상승효과에 의한 것인지, 또는 단일성분에 의한 것인지, 또 숙주개재성에 의한 것인지, 항암스펙트르는 어떻게 되는 것인지, 많은 과제가 남아있기는하나, 보제에는 우수한 항암성과 연명 효과가 인정된다. (4-2) 시험과 방법(22)

A. 복수간암세포

4-디메틸아미노아조벤젠으로 유도한 간암유래의 AH 414세포(사사끼 연구소 사토오박사증여)를 똑류우계 수시험쥐(140~150g)에 계대(繼代)이식하고 본 시험에 사용했다.

B. LAP-1, LAP-2의 투여

AH 414세포이식 직전에 LAP-1 5mg, LAP-2 10mg를 그후 1일 간격으로 6일째까지 합계 2회, 복강내에 주사투여 했다. 8일째에 개복하여 복수량, 세포수를 측정했다.

LAP-1, LAP-2 투여군(ASLA1, ASLA2)은 복수 1ml당의 세포수가 비투여군(AS)에 비교해서 모두 적고, 그 비율은 ASLA1군에서 68%, ASLA2군에서 46%이었다(표 8). 그러나 복수량을 승한 값(전 세포수)은 ASLA1군에서는 오히려 증가했다. 이것은 이군의 복수량이 AS군에 비해서 상당히 많은 데에 기인한다. 참고로 이들의 결과는 2회의 반복시험에서의 1군 10마리중 체중이 최대위, 중위, 최소위의 3마리의 평균치이다. 이들 투여군은 세포경이 고르지 않고, 외부 및 내부형태도 AS군과 상당히 다른 세포도 볼 수 있었다.

AS군의 90% 이상의 세포가 10~20㎛의 크기에 비해 ASLA1군에서는 10㎛이하의 소세포가 전체의 약 40%, 나머지 60%중 4~5%가 20㎛ 이상의 거대세포이었다. ALA2군에서는 10㎛이하의 것이 약 20%, 나머지 80%에는 ALA1군과 동일한 거대세포가 동일한 빈도로 볼 수 있었다. 또 투여군은 세포응집괴가 많고 이들의 세포의 거의가 토외판블루우로 강하게 염색되었다(도면 4). 또, ASLA1군은 1군 10마리중 2 3마리의 비율로 상당한 연명효과를 볼 수 있었고, 복수의 소실로 외부형태, 행동이 정상시험쥐와 하등 차이가 없는 정도까지 회복하는 고체도 볼 수 있었다.(제5도).

[표 8]

C. 결 과

표고버섯, 부채살버섯, 구름버섯등의 자실체 추출액의 항암성에 대해서는 이미 광범하고 또 상세한 연구가 진행되고 있고, 그 유효성분의 분석도 진전되어 있다. 참고로 표고버섯이나 부채살버섯의 유효성분은 β-1, 3-글르칸을 주쇄로 하는 분지형태의 다당류이고, 기와버섯은 단백질다당으로 보고있다.

그런데, LAP-1, LAP-2의 분획에 대해서는 본 발명자등도 또 상기와 같은 다당을 의식하여 성분해석을 진행해 왔다. 그러나, 예상과는 다른 결과를 얻었다.

즉, 이들 분획은 상기와 같이 모두 키실로오스를 주요당으로 하고, 다시 글르코우스, 가라크토오스, 만노오스, 아라비노오스등도 상당한 양이 검출되었다. 이들의 결과는 분명히 배지의 다당조성을 반영하고, 글르코우스대신에 키실로오스를 주요당으로 하는 것은 표고버섯균사체효소의 작용과의 관련을 강하게 시사한다.

또, 표고버섯균사체 및 포자에서 추출정제된 2줄 쇄 RNA에 인터페론 유기성이 있는 사실, 표고버섯자실체에 함유되는 바이러스 모양 RNA에 항암성이 있는 사실은 명백히 되어있다.

그런데, LAP-1획분은 세파로오즈 6B에서 Voidvolume의 위치에, LAP-2획분은 totalvolume 직전의 위치에 각각 용출된다.

따라서 이들 획분은 고분자획분이고, 키실로글르칸이나, 더욱 복잡한 구성다당의 존재를 강력히 시사하고 있다. 또, 버어거스나 얼룩조릿대등 단자엽식물다당획분에는 이미 항암성이 확인되고 있고, 키실로오스를 주로 하는 다당 또는 다당단백질에도 항암성을 기대할 수 있을 것이다. 참고로 LAP-1, LAP-2획분을 7% 폴리아크릴아미드 슬러그겔로 전기영동(電氣泳動)하고, 이들을 PAS 염색하면 LAP-1획분은 원선에서 대상(帶狀)으로 강한 적자색을 나타내고, LAP-2획분은 원선만이 염색되었다. 이것에 대하여 크마시이블로 염색하면 LAP-2획분에는 분자량 75,000, 47,000, 32.000의 위치에 3줄의 밴드가 확인되었다. 따라서 지금까지 보고된 담자균자실체 추출물의 항암작용기작과도 아울러 생각하여 LAP-1획분에는 숙주개재성의, 또, LAP-2획분에는 다시 별도의 암세포파괴등의 항암 효과도 기대할 수 있다. 또, LAP는 물론이고 LAP-1, LAP-2도 세포독성은 보이지 않고, 백혈구의 감소, 비장의 위축식욕감퇴등의 종래의 제암제에서 볼 수 있는 부작용은 일체 없었다.

Claims (1)

1. 버어거스등의 키실로오스성분이 풍부한 고체배지에서 표고버섯등 담자균류에 속하는 식용버섯균사체를 배양하는 공정과, 상기 공정에서 얻은 자실체 발생전의 균사체와 배지를 혼합하여 분해하는 공정과, 상기 공정으로 얻은 균사체 배양물(균사체와 배지와의 혼합물)을 탱크속에 충전하고, 가수하는 공정과, 상기 탱크속의 균사체배양물을 가온시켜서 엔티메이션을 촉진하고 균사체배양물중의 유효성분을 물에 용탈(溶脫)시키는 공정과, 상기 탱크속의 현탁액을 가압, 여과하여 추출액을 얻는 공정으로 구성되는 항암물질의 제조방법.

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