CN115490778B - 一种凤尾菇多糖提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种凤尾菇多糖提取物及其制备方法和应用，属于天然产物开发领域。上述凤尾菇多糖提取物包括岩藻糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖，分别占所述凤尾菇多糖提取物的摩尔百分比为2.4％，28.81％，30.63％和37.79％；主要的连接方式为T‑岩藻糖，1,6‑半乳糖，T‑葡萄糖，1,6‑葡萄糖，1,3,6‑葡萄糖，1,3‑甘露糖，1,2,6‑甘露糖，T‑甘露糖。该多糖提取物通过热水浸提、乙醇沉淀以及离子层析纯化即可得到。通过实验证明：该多糖提取物对氧化损伤的神经细胞具有保护作用，并可改善衰老小鼠的学习和记忆能力。可见，本发明制备方法简单，对于神经保护及抗衰老药物的开发提供研究基础。

Description

一种凤尾菇多糖提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然产物开发领域，特别是涉及一种凤尾菇多糖提取物及其制备方法和应用。
背景技术
神经退行性疾病(Neurodegenerative Diseases，ND)是以神经元进行性丧失为特征的疾病，已经成为全球最受关注的公共卫生问题之一，对老年人的身心健康及生活质量产生极大影响。大量研究表明，ND的发病与氧化应激导致的线粒体功能障碍、神经细胞凋亡密切相关。因此，从天然产物中挖掘无毒副作用的、可改善氧化应激损伤的抗氧化及保护神经细胞作用的潜在药物具有重要意义。
凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)，所属担子菌门，蘑菇纲，蘑菇目，侧耳属。凤尾菇味道鲜美，肉质肥厚，具有较高的营养和药用价值，是重要的天然药物资源。目前，对凤尾菇的保护神经细胞和认知功能改善等功效尚未见报道。因此，对其进行药用价值的开发和利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种凤尾菇多糖提取物及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，首次从凤尾菇中提取得到的多糖提取物，具有抗氧化、保护神经细胞作用以及改善学习和记忆能力。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种凤尾菇多糖提取物，其包括岩藻糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖，分别占所述凤尾菇多糖提取物的摩尔百分比为2.4％，28.81％，30.63％和37.79％。
优选的是，所述凤尾菇多糖提取物的连接方式为：T-岩藻糖，1,6-半乳糖，T-葡萄糖，1,6-葡萄糖，1,3,6-葡萄糖，1,3-甘露糖，1,2,6-甘露糖，T-甘露糖。
优选的是，所述凤尾菇多糖提取物的分子量为44.9kDa。
本发明还公开一种所述的凤尾菇多糖提取物的制备方法，包括：以凤尾菇为原料，通过热水浸提、乙醇沉淀以及离子层析纯化，获取凤尾菇多糖提取物。
优选的是，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将凤尾菇菌粉在80℃热水中浸提，浸提液浓缩至原浓度1/4，加入无水乙醇至终浓度为75％，静置、离心，收集沉淀烘干，得到多糖样品；
(2)将所得多糖样品溶解后，再通过2次sevag试剂去除蛋白，之后经透析、冻干，得到凤尾菇多糖(PSP)；
(3)将所得凤尾菇多糖通过离子交换层析法纯化，获取凤尾菇多糖组分一(PSP1)和凤尾菇多糖组分二(PSP2)；再将所述凤尾菇多糖组分二通过离子交换层析法纯化，得到凤尾菇多糖提取物(PSP2-1)。
优选的是，步骤(1)中，所述凤尾菇菌粉与所述热水的料液比为1g：30mL，浸提时间为2h。
优选的是，步骤(2)中，所述多糖样品用去离子水溶解后，按照体积比1:(1-2)加入sevag试剂充分振荡混匀，离心去除蛋白，再按照相同方法加入sevag试剂去除蛋白；其中，所述sevag试剂为正丁醇和氯仿体积比1:4的混合溶液。
优选的是，步骤(3)中，所述凤尾菇多糖用DEAE-琼脂糖凝胶-FF层析柱纯化，洗脱液为0-1mol/L NaCl，洗脱速度为1mL/min；
所述凤尾菇多糖组分二用Sephacry S–400HR层析柱纯化，洗脱液为0-0.15mol/NaCl，洗脱速度为0.5mL/min。
本发明还提供所述的凤尾菇多糖提取物，或者所述的制备方法在制备如下(1)-(3)任一项药物中的应用：
(1)抗氧化的药物；
(2)保护神经细胞的药物；
(3)改善学习和记忆能力的药物。
本发明还提供一种药物组合物或者食品，包括所述的凤尾菇多糖提取物。更优选的是，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料，所述食品还包括食品上可用的辅料；更优选的是，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、散剂、微丸、溶液剂、糖浆剂、乳剂或注射剂。
本发明公开了以下技术效果：
本发明首次从天然菌物凤尾菇中获得具有新颖结构和多种生物活性的多糖PSP2-1。同时通过实验验证，发现该多糖具有抗氧化、保护神经细胞和改善学习和记忆能力等功效，可用于制备治疗抗氧化、保护神经细胞和改善学习和记忆能力的药物，为凤尾菇后续的开发和利用提供研究基础，具有重要的经济价值和市场价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明凤尾菇多糖洗脱曲线；(A)DEAE FF洗脱曲线，(B)Sephacry S–400HR洗脱曲线；
图2为本发明PSP2-1单糖组成分析；
图3为本发明PSP2-1分子量图谱；
图4为本发明PSP2-1体外抗氧化活性；
图5为本发明PSP2-1对H2O2诱导的氧化损伤神经细胞的细胞毒性(A)、细胞活性(B)、乳酸脱氢酶释放(C)、细胞形态(D)、细胞凋亡(E)和ROS释放的影响(F)；##：与对照组比，p<0.01；*：与模型组比p<0.05；**：与模型组比p<0.01)；
图6为本发明PSP2-1对H2O2诱导的氧化损伤神经细胞线粒体膜电位和细胞色素c释放的影响；J流式细胞仪JC-1染色检测PSP2-1对H2O2处理HT22细胞线粒体膜电位变化的影(A)、红色/绿色荧光百分比的量化图(B)、激光共聚焦显微镜检测PSP2-1对H2O2处理的HT22细胞细胞色素c释放的影响(C)；##：与对照组比，p<0.01；*：与模型组比p<0.05；**：与模型组比p<0.01；
图7为本发明PSP2-1对D-半乳诱导衰老小鼠水迷宫实验结果；水迷宫中不同组小鼠的热红外轨迹(A)、不同组小鼠的逃避潜伏期(B)、没有平台时,不同组小鼠寻找平台的次数(C)；
图8为发明PSP2-1对D-半乳诱导衰老小鼠脑组织和血清中氧化应激指标的影响；脑组织中CAT水平(A)、脑组织中MDA水平(B)脑组织中SOD水平(C)脑组织中ROS水平(D)、血清中CAT水平(E)、血清中MDA水平(F)血清中SOD水平(G)血清中ROS水平(H)；##：与对照组比，p<0.01；*：与模型组比p<0.05；**：与模型组比p<0.01。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1凤尾菇多糖提取物的制备
将凤尾菇子实体烘干，粉碎过100目筛，将凤尾菇菌粉在80℃热水，液料比为30mL：1g条件下提取2h；提取液浓缩至原浓度1/4，加入无水乙醇至终浓度75％静止过夜后，5000r/min离心去上清，沉淀冻干后备用；
将冻干的多糖样品加入去离子水溶解，按照体积比1:2加入sevag试剂(正丁醇：三氯甲烷＝1:4，v/v)在水平摇床上150rpm/min振荡30min,，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去，再重复加入sevag试剂一次，重复上述步骤；再通过3500Da截留量透析袋透析去除小分子后，旋转蒸发仪浓缩，并通过冷冻干燥机对其冷冻干燥获得凤尾菇多糖PSP；
将PSP用去离子水溶解，上样至DEAE-琼脂凝胶-FF(1.6×10cm)层析柱，并用0-1mol/L NaCl梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，每管收集5mL，通过苯酚-硫酸法测定多糖含量将含有多糖部分收集，分别获得多糖组分PSP1和PSP2，进一步将PSP2上样至Sephacryl S–400HR(1.6×60cm)层析柱，0.15mol/NaCl，洗脱速度为0.5mL/min条件下洗脱，收集多糖部分，透析后，冻干获得凤尾菇多糖提取物PSP2-1(图1)。
实施例2凤尾菇多糖PSP2-1单糖组成分析
(1)多糖样品的水解：准确称取PSP2-1 10mg，将其溶解在4M的三氯乙酸中，充分振摇，使其混匀，在110℃电热恒温鼓风干燥箱中充分反应6h，反应结束后加入无水乙醇以去除多余的三氯乙酸，随后对样品进行干燥等到水解后的多糖样品。
(2)单糖标准液的配制以及混合标准液的配制：准确称取葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖的单糖标准品10mg，分别用纯净水溶解并定容至5mL即得到2mg/mL的单糖标准液；再一次准确称取葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖的单糖标准品10mg，将6种单糖混合后用纯净水溶解并定容到5mL，即得到2mg/mL的混合糖标准液。
(3)将所有准备好的糖溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤后，通过高效液相色谱进行检测。流动相：A相：ddH2O；B相：200mM NaOH；C相：200mM NaOH/500mM NaAC；流速：0.5mL/min，上机程序如下：
表1
A B C
0min 97.5 2.5 0
25min 97.5 2.5 0
25.1min 77.5 2.5 20
40min 77.5 2.5 20
40.1min 0 0 100
50min 0 0 100
50.1min 97.5 2.5 0
60min 97.5 2.5 0
结果如图2所示，表明凤尾菇多糖PSP2-1主要由岩藻糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖组成，摩尔百分比分别为2.4％,28.81％，30.63％和37.79％。
实施例3凤尾菇多糖PSP2-1的多糖含量测定
将葡萄糖标准品于90℃条件下烘干至恒重，精确称取1.000g，用蒸馏水定容于容量瓶，使之为配制好的10mg/mL的标品母液，准确吸取后定容为1mg/mL的葡萄糖标品溶液，分别精密移取0、10、20、30、40、50、60、70、80μL至管中，并分别补充蒸馏水至200μL，并单独取EP管，加入1mg/mL的PSP2-1多糖溶液200μL后，每管分别加入5％苯酚溶液150μL，混匀，迅速缓慢加入浓硫酸0.5mL，混匀后，静置30min后冷却至室温，于96孔板每个样品200μL，酶标仪检测OD490值后，根据葡萄糖标准曲线计算多糖含量。结果显示凤尾菇多糖含量为85.30％。
实施例4凤尾菇多糖PSP2-1的多糖分子量检测
通过凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，测定PSP2-1的分子量分布，准确称取10mg的PSP2-1组分，加入1mL NaNO3使其充分溶解，随后14000rpm离心10min，最后用0.22μm的微孔滤膜过滤后即可上机检测。
色谱系统采用的是凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，示差检测器为Optilab T-rEX(Wyatt technology，CA，USA)，激光光散射检测器为DAWN HELEOSⅡ(Wyatttechnology，CA，USA)，采用合适分子量范围的凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805HQ(300×8mm)，Ohpak SB-804HQ(300×8mm)，Ohpak SB-803HQ(300×8mm))，柱温45℃，进样量为100μL，流动相A(0.1M NaNO3)。结果如图3所示，该多糖分子量为44.9kDa。
表2流动相梯度
Figure BDA0003856303100000061
实施例4凤尾菇多糖PSP2-1的甲基化分析
(1)将5mg多糖样品PSP2-1溶解在二甲亚砜中，并加入20mg氢氧化钠1小时。然后，分别加入10μL碘甲烷(CH3I)和500μL二氯甲烷20分钟，离心后，丢弃水相，蒸发二氯甲烷。
(2)样品在121℃下用2.5mol/L三氟乙酸水解90分钟，然后在室温下添加50μL2mol/L氨和50μL 1mol/L NaBD4 2.5小时，并添加乙酸终止反应。
(3)通过在100℃下添加250μL乙酸酐对样品进行乙酰化2.5小时，采用GC-MS系统分析。
结果如表3所示，结果表明PSP2-1主要的连接方式为T-岩藻糖，1,6-半乳糖，T-葡萄糖，1,6-葡萄糖，1,3,6-葡萄糖，1,3-甘露糖，1,2,6-甘露糖，T-甘露糖。
表3PSP2-1甲基化结果
Figure BDA0003856303100000062
Figure BDA0003856303100000071
以下通过试验证明本发明得到的凤尾菇多糖的医用用途。
试验例1凤尾菇多糖PSP2-1具有DPPH自由基，羟自由基和超氧阴离子能力
分别对凤尾菇多糖的清除羟自由基，DPPH和超氧阴离子能力进行测定，以其说明其抗氧化活性，采用VC作为阳性对照，。
(1)清除DPPH活性方法：0.75mL的0.1mM DPPH分别与1.5mL不同浓度凤尾菇多糖(1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mg/mL)溶液混匀，避光30min，测定无水乙醇在517nm处吸光度A1；0.75mL无水乙醇与1.5mL凤尾菇多糖溶液混匀，避光30min后，测定517nm处吸光度A2；0.75mL的0.1mM DPPH与1.5mL无水乙醇混匀，避光30min后，测定517nm处吸光度A0。按以下公式计算凤尾菇多糖对DPPH自由基的清除能力：
清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0)]×100％
(2)清除羟自由基活性实验：取1mL 0.02M的磷酸盐缓冲液(pH＝7),0.8mL 0.15mM亚甲蓝溶液，0.4mL 0.01M Fe(Ⅱ)-EDTA溶液，0.2mL 7.5mM H2O2溶液，分别加入不同浓度凤尾菇多糖(1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mg/mL)0.5mL，用90％乙醇溶液稀释至10mL,混匀反应2h,测定660nm处吸光度，A0为初始亚甲蓝溶液的吸光度，A1为加入Fenton试剂后的吸光度，A2为加入Fenton试剂及凤尾菇多糖溶液后的吸光度。按以下公式计算凤尾菇多糖对羟自由基的清除能力：
清除率(％)＝[1-(A0-A2)/(A0-A1)]×100％
(3)清除超氧阴离子活性方法：取4mL Tris-HCl溶液(pH＝8.2),分别加入不同浓度凤尾菇多糖(1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mg/mL)0.5mL，采用乙醇定容至10mL，48℃反应40min，加入48℃预热后的3mM邻苯三酚0.3mL,立刻混匀，测定其319.5nm处吸光度，空白样品的吸光值为A0，加入凤尾菇多糖后样品的吸光值为A1。按以下公式计算凤尾菇多糖对超氧阴离子的清除能力：
清除率(％)＝[1-A1/A0]×100％
以上三种抗氧化实验结果如图4所示，凤尾菇多糖对DPPH，羟自由基和超氧阴离子均有较强的自由基清除能力。
试验例2凤尾菇多糖PSP2-1对神经细胞的保护作用
(1)细胞培养
使用含有10％灭活的胎牛血清以及1％的双抗(青霉素和链霉素)和1％Biomyc-3抗生素溶液的DMEM培养体系，在含有5％CO2和95％空气，37℃的培养箱中培养小鼠海马体神经元细胞(HT22细胞)，待细胞生长到密度为80％时开始进行实验。
(2)细胞活力测定
将小鼠海马神经元细胞系(HT22细胞)以2×104/孔的细胞密度接种到96孔板中，每孔加入100μL的培养基培养24h，然后分别用不同浓度的PSP2-1(50、100、150μg/mL)预处理细胞24h后，用500μmol/L H2O2刺激细胞2h，将96孔板中的培养液全部吸出后添加含有CCK8的培养液100μL(10μL CCK8溶液和90μL无血清的培养基)，在37℃培养箱中孵育1h后，通过酶标仪在450nm条件下测定吸光度值。细胞释放LDH检测。
将HT22细胞以2×104/孔的细胞密度接种到96孔板板中，待细胞密度为80％时，弃掉旧的培养基，并用室温下的PBS洗涤HT22细胞一次，然后在96孔板中加入含有1％血清的培养液，通过不同浓度PSP2-1(50、100、150μg/mL)以及500μmol/L H2O2处理细胞后，将96孔板用多孔板离心机在400g的条件下离心5min，到达预定时间后分别取各孔上清液120μL加入一新的96孔板中，按照乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒的操作说明配制LDH检测工作液后，每孔加入60μL的工作液后在室温避光的水平摇床上孵育30min，随后通过酶标仪测定490nm处的吸光度值。
(3)细胞凋亡检测
将HT22细胞以3.2×105的细胞密度接种到6孔板中，分别用不同浓度PSP2-1(50、100、150μg/mL)以及500μmol/L H2O2处理细胞后，用预冷的PBS洗涤细胞，胰酶消化后1500rpm离心5min收集细胞，转入到流式管中，用100μL 1×Binding buffer缓冲液重悬细胞，加入5μL FITC和5μL PI在避光条件下染色15min，到达预定时间后1500rpm离心5min弃掉上清，用预冷的1×Binding buffer缓冲液洗涤细胞3次，随后用200μL 1×Bindingbuffer缓冲液重悬细胞后用细胞流式检测。
(4)细胞内ROS含量检测
将HT22细胞以3.2×105的细胞密度接种于6孔板中，分别用不同浓PSP2-1(50、100、150μg/mL)以及500μmol/L H2O2处理细胞后，通过原位装载探针的方法用DCFH-DA探针检测细胞内活性氧含量的水平，弃掉细胞培养基，在避光的条件下每孔中加入1mL用无血清稀释1000倍的DCFH-DA探针，在37℃培养箱中孵育20min，到达预定时间后，用无血清培养基洗涤细胞3次，每次3min。接下里1500rpm离心5min收集细胞，重悬细胞后用细胞流式仪检测细胞中的DCF荧光强度。
(5)线粒体膜电位检测
将HT22细胞以3.2×105的细胞密度接种到6孔板中，分别用不同浓度PSP2-1(50、100、150μg/mL)以及500μmol/L H2O2处理细胞后，用0.5mL的培养基重悬细胞，加入0.5mLJC-1染色工作液重悬细胞，用移液枪吹打混匀，在37℃的细胞培养箱中避光孵育20min，孵育结束后600g离心5min弃掉上清，用预冷的JC-1染色缓冲液洗涤细胞3次，收集细胞后用200μL JC-1染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪进行分析。
(6)DAPI染色
将HT22细胞以1.6×105/孔接种于12孔板中，分别用不同浓度PSP2-1(50、100、150μg/mL)预处理细胞24h后，再用500μmol/L H2O2处理细胞2h，弃掉细胞培养板中的上清液，用PBS洗涤细胞两遍，每次3min，洗涤结束后用4％多聚甲醛将细胞固定20min，到达预定时间后用PBS洗涤细胞，然后在避光的条件下向每孔中加入DAPI染料(1:1000)染色10min，接下来用PBS洗涤细胞2次，每次5min，最后用荧光显微镜进行观察拍照。
(7)细胞色素C释放的检测
在共聚焦细胞培养皿中接种4×105的HT22细胞，分别用不同浓度PSP2-1(50、100、150μg/mL)以及500μmol/L H2O2处理细胞后，将培养基吸出，用PBS洗涤细胞3遍，每次3min，洗涤结束后为使细胞固定向每个培养皿中用巴氏加入1mL 4％多聚甲醛，固定细胞30min。到达预定时间后用PBS洗涤细胞3遍，每次3min，为使抗体能够进入细胞内部接下来用0.5％Triton X 100通透20min，到达预定时间后用PBS洗涤细胞3次，每次3min，随后用山羊血清封闭30min，封闭结束后孵育一抗Cytochrome c(1:400)，4℃封闭12h。第二天,用PBS洗去细胞培养皿中的一抗，每次洗涤3min，共三次，随后在避光的条件下向培养皿中加入荧光二抗(1:200)，在水平摇床上避光震荡1h，到达预定时间后，用PBS洗涤细胞三次，每次3min，最后用DAPI(1:1000)染料对细胞核进行染色10min，到达预定时间后用PBS洗掉DAPI染料即可用共聚焦显微镜进行拍照，拍照后用Image J软件对照片进行处理。
凤尾菇多糖PSP2-1对神经细胞保护的结果如图5所示，结果表明该多糖无细胞毒性，可提高H2O2诱导的氧化损伤神经细胞的活力，降低半乳脱氢酶的释放，降低神经细胞的凋亡和ROS的释放。进一步研究发现，PSP2-1可以抑制由H2O2诱导的线粒体膜电位的改变和细胞色素C的释放(图6)。这些结果说明，凤尾菇多糖PSP2-1可以，抑制细胞凋亡，对氧化损伤的神经细胞具有保护作用。
试验例3凤尾菇多糖PSP2-1对D-半乳糖诱导衰老小鼠认知能力和氧化应激指标的影响
1、测定小鼠鼠认知能力
8周龄60只SPF级BALB/c小鼠，雌雄各半，随机分为5组，对照组(生理盐水)、模型组(D-半乳糖200mg/kg)、PSP2-1低剂量组(100mg/kg)，PSP2-1中剂量组(200mg/kg)和PSP2-1高剂量组(400mg/kg)。前49天，除对照组外，各组每天注射一次D-半乳糖；从第50天起，除每日腹腔注射D-半乳糖外，每天一次，低剂量组给予PSP2-1(100mg/kg)、中剂量组给予PSP2-1(200mg/kg)，高剂量组每天给予PSP2-1(400mg/kg)，连续给药42天。然后进行水迷宫实验。
水迷宫实验进行6天。在前5天对小鼠进行训练。将每只老鼠从四个不同的象限放入池中120秒，以找到隐藏的平台。如果小鼠没有找到平台，则在结束后将其放置在隐藏平台上15秒，以便小鼠能够记住平台的位置。经过5天的训练后，正式测试开始对小鼠进行120秒的检测实验，记录在此期间发现隐藏平台的逃逸潜伏期。考试的最后一天分为两种方式。第一种方法是无平台测试，移除平台，并调查小鼠在指定时间(60s)内找到平台位置的次数；第二种方法是进行平台测试，调查小鼠找到平台所需的时间。
2、测定小鼠氧化应激
10％脑组织匀浆的制备：称取30mg脑组织，加入270μL生理盐水，进行组织匀浆研磨。将研磨液在10000r/min离心10min，收集上清液，待用。
血清的制备：采集小鼠血液，静置30min后，3500r/min离心10min，分离血清，4℃保存备用。
氧化指标检测：10％脑组织匀浆通过BCA试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测定蛋白含量。采用ELISA试剂盒(中国江苏京美生物技术有限公司)按照说明书检测小鼠血清及10％脑组织匀浆中MDA，CAT，ROS，SOD水平。
3、结果
衰老小鼠认知能力实验结果如图7所示，发现对照组小鼠可以很快找到平台，或者在没有平台时，在平台附近游动，而模型组小鼠，寻找平台的轨迹是混乱，说明模型小鼠发生学习和记忆障碍，而凤尾菇多糖PSP2-1组能有效改善这一状况。说明凤尾菇多糖可改善D-半乳糖诱导衰老小鼠的学习和记忆能力。
凤尾菇多糖PSP2-1对D-半乳糖诱导衰老小鼠氧化应激指标的影响如图8所示，与对照组相比，模型组小鼠显著降低了脑组织和血清中CAT和SOD水平，提高了MDA和ROS水平，说明小鼠发生氧化损伤，而与模型组相比，PSP2-1多糖组显著提高了脑组织和血清中CAT和SOD水平，降低了MDA和ROS水平，说明凤尾菇多糖PSP2-1对D-半乳糖诱导衰老小鼠具有保护作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种凤尾菇多糖提取物，其特征在于，其包括岩藻糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖，分别占所述凤尾菇多糖提取物的摩尔百分比为2.4％，28.81％，30.63％和37.79％；
所述凤尾菇多糖提取物的连接方式为：T-岩藻糖，1,6-半乳糖，T-葡萄糖，1,6-葡萄糖，1,3,6-葡萄糖，1,3-甘露糖，1,2,6-甘露糖，T-甘露糖；
所述凤尾菇多糖提取物的分子量为44.9kDa。
2.一种如权利要求1所述的凤尾菇多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括：以凤尾菇为原料，通过热水浸提、乙醇沉淀以及离子层析纯化，获取凤尾菇多糖提取物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将凤尾菇菌粉在80℃热水中浸提，浸提液浓缩至原浓度1/4，加入无水乙醇至终浓度为75％，静置、离心，收集沉淀烘干，得到多糖样品；
(2)将所得多糖样品溶解后，再通过2次sevag试剂去除蛋白，之后经透析、冻干，得到凤尾菇多糖；
(3)将所得凤尾菇多糖通过离子交换层析法纯化，获取凤尾菇多糖组分一和凤尾菇多糖组分二；再将所述凤尾菇多糖组分二通过离子交换层析法纯化，得到凤尾菇多糖提取物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述凤尾菇菌粉与所述热水的料液比为1g：30mL，浸提时间为2h。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述多糖样品用去离子水溶解后，按照体积比1:(1-2)加入sevag试剂充分振荡混匀，离心去除蛋白，再按照相同方法加入sevag试剂去除蛋白；其中，所述sevag试剂为正丁醇和氯仿体积比1:4的混合溶液。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述凤尾菇多糖用DEAE-琼脂糖凝胶-FF层析柱纯化，洗脱液为0-1mol/L NaCl，洗脱速度为1mL/min；
所述凤尾菇多糖组分二用Sephacry S–400HR层析柱纯化，洗脱液为0-0.15mol/NaCl，洗脱速度为0.5mL/min。
7.如权利要求1所述的凤尾菇多糖提取物，或者权利要求2-6任一项所述的制备方法在制备如下(1)-(3)任一项药物中的应用：
(1)抗氧化的药物；
(2)保护神经细胞的药物；
(3)改善学习和记忆能力的药物。
8.一种药物组合物或者食品，其特征在于，包括权利要求1所述的凤尾菇多糖提取物。
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