CN106188258B

CN106188258B - 一种提取远志糖蛋白的方法

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Publication number: CN106188258B
Application number: CN201610645106.6A
Authority: CN
Inventors: 王颖莉; 张娟娟; 贺文彬; 刘仕琦; 许凯霞
Original assignee: Shanxi University of Traditional Chinese Mediciine
Current assignee: Shanxi University of Traditional Chinese Mediciine
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2036-08-08
Also published as: CN106188258A

Abstract

本发明公开了一种提取远志糖蛋白的方法。本发明所提供的提取远志糖蛋白的方法，包括如下步骤：(a)将远志粉碎并脱脂；(b)将经脱脂后的远志粉末在pH为7.5‑8.2的缓冲液中浸提；浸提温度为25‑40℃；浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5‑9mL；(c)将所得浸提液过滤，除去滤液中的游离蛋白，得到远志糖蛋白粗提取液。本发明所提供的远志糖蛋白提取工艺是一套提取效率高、条件简便的工艺，远志糖蛋白提取率均值可高达5.96％。本发明对后期远志糖蛋白的分离纯化及活性研究具有一定的参考价值和实际意义。本发明不仅可以提高远志药材的使用价值，而且可以拓展免疫类新型药物或新型保健品的开发渠道。

Description

一种提取远志糖蛋白的方法

技术领域

本发明属于中药糖蛋白提取领域，涉及一种提取远志糖蛋白的方法。

背景技术

糖蛋白(glycoprotein)是一类由寡糖与多肽链或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白，广泛存在于植物中，并以不同的形式存在，对于生物体的各项生命活动起着十分重要的作用，是生物体内必不可少的生物大分子之一。研究报道指出，糖蛋白具有抗癌、抗氧化、抗疲劳、抑制肿瘤等多方面的生物活性及生理功能。基于糖蛋白的生物学功能渐渐被挖掘，以多糖结构、功能为核心的糖工程被认为是继蛋白质工程、基因工程后生物化学和分子生物学领域中又一巨大的科学问题，吸引着众多学科领域的探讨研究。

由于糖蛋白是以蛋白质为主，只是在某些部位连接有一些短的糖链基团，一般可采用提取纯化蛋白质的方法来提取糖蛋白。大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，并且糖蛋白中的糖链具有高度亲水性，所以大多数糖蛋白均以水溶液提取为主，常用的方法有水提取法、稀盐溶液或缓冲溶液提取法、酸碱溶液提取法、醇提取法、酶解液提取法等，具体方法可根据不同实验需求类别选择。但由于糖蛋白活性的保持需要一个相对稳定、平衡的生存环境，所以在提取糖蛋白的过程中，要严格控制提取条件，以免破坏糖蛋白的结构及生物活性[刘兴华,赵浩如.天然糖蛋白的提取、分离与纯化[M].药学进展,2006,30(12):542-547.]。可以说，糖蛋白的分离纯化是一个相对较长并需要重复摸索的过程，通常需要进行大量的预实验来确定不同来源糖蛋白各自特异的分离纯化条件。

远志(Polygala tenuifolia Willd.)作为历代药食同源的药材之一，被称为“养命之要药”，具有安神益智、祛痰、消肿的功能，可用于心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸，神志恍惚，咳痰不爽，疮疡肿毒，乳房肿痛等。目前国内外对动物类、海洋类糖蛋白的研究较多，但针对中药糖蛋白的研究尚不全面。目前还没有提取、分析研究远志药材中的糖蛋白类成分的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取远志糖蛋白的方法。

本发明所提供的提取远志糖蛋白的方法，具体可包括如下步骤：

(a)将远志粉碎并脱脂；

(b)将经步骤(a)脱脂后的远志粉末在pH为7.5-8.2的缓冲液中浸提；进行所述浸提时的温度为25-40℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5-9mL；

(c)将步骤(b)所得浸提液过滤，除去滤液中的游离蛋白，得到远志糖蛋白粗提取液。

在步骤(b)中，所述缓冲液的pH进一步可为7.5-8.0；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比进一步可为1g：7.5-8.5mL。

更加具体的，所述缓冲液的pH最好为7.85；进行所述浸提时的温度最好为33℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比最好为1g：8.0mL。

在步骤(b)中，所述缓冲液具体可为Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液中最好含有浓度为0.05-0.1mol/L的NaCl；进行所述浸提的时间具体可为1-2h。

更加具体的，所述缓冲液中NaCl的浓度最好为0.1mol/L；进行所述浸提的时间最好为1.5h。

在步骤(a)中，所述“将远志粉碎并脱脂”具体可通过包括如下步骤的方法实现：将远志粉碎后的粉末用5倍量的石油醚30-60(即30-60℃沸程规格的石油醚)，40-45℃水浴脱脂1h，过滤，向滤渣中继续加入3倍量的所述石油醚30-60，40-45℃水浴脱脂0.5h，过滤，滤渣自然晾干，即得脱脂后的远志粉末。其中，“n倍量”的单位为mL/g，表示1g远志粉末应加入的所述石油醚30-60毫升数为n。如5倍量表示1g远志粉末应加入5ml所述石油醚30-60。

其中，在将远志粉碎后，加入5倍量的石油醚30-60前可还包括用对远志粉末进行过筛的步骤。具体可为过50目筛(3号筛，50目，孔径大小为355±13μm)。

在步骤(c)中，所述除去滤液中的游离蛋白的方法具体可为经Sevage法脱除游离蛋白。其中，所述经Sevage法脱除游离蛋白的具体方法可参见“赵梅,丁霄霖.甘薯糖蛋白脱游离蛋白的研究[J].食品与生物技术学报,2006,01:89-91.”一文。

另外，本发明所提供的提取远志糖蛋白的方法在步骤(c)之后，还可包括如下“步骤(d)”或“步骤(d)和(e)”或“步骤(d)、(e)和(f)”：

(d)将所述远志糖蛋白粗提取液在无NaCl的pH7.85的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h，离心(如常温3500r/min离心10分钟)，取上清液。

该步骤的目的是除去其中的一些无机盐、色素、低聚糖等小分子杂质。

(e)将步骤(d)所得的上清液用DEAE-52阴离子交换层析，收集用0.1mol/LTris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.3mol/L NaCl洗脱所得的洗脱液。

(f)将步骤(e)所得洗脱液进行冷冻干燥，即得远志糖蛋白。

在步骤(e)中，将预处理过的DEAE-52用缓冲液A(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85不含NaCl)平衡；再以2个柱体积缓冲液A洗脱未被吸附的糖蛋白液，并收集；然后分别依次以2倍柱体积的缓冲液B(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.06mol/L NaCl)、缓冲液C(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.1mol/L NaCl)、缓冲液D(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.3mol/L NaCl)、缓冲液E(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.5mol/L NaCl)进行阶段洗脱，收集各阶段的洗脱液。

在步骤(f)中，所述冷冻干燥具体可为：-86℃冷冻24h以上。

本发明所提供的提取远志糖蛋白的方法即为制备含有远志糖蛋白的提取物的方法或者为制备远志糖蛋白的方法。

利用本发明所提供的提取远志糖蛋白的方法所得的含有远志糖蛋白的提取物或者远志糖蛋白，以及所述提取物或者远志糖蛋白在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围。

(1)制备具有抗衰老活性的产品；

其中，所述抗衰老活性可体现为如下中的至少一种：减缓D-半乳糖导致的脏器萎缩；提高血清中SOD和/或CAT的活力；提高脑组织中SOD的活力；降低脑组织中MDA的含量。

(2)制备具有免疫促进活性的产品。

其中，所述免疫促进活性可体现为如下中的至少一种：减缓免疫器官的萎缩；提高血清中IL-2和/或IL-6的含量。

在本发明中，所述远志具体为中药材远志。

本发明采用响应曲面法对远志糖蛋白的提取工艺进行优化，确定了一套提取效率高、条件简便的提取工艺，在此提取条件下，远志总糖蛋白提取率均值可高达5.96％。同时，本发明确定了远志糖蛋白的分离方法，因此，本试验从蛋白稳定性、提取得率与分离三个方面进行了综合考量。本发明不仅可以提高远志药材的使用价值，而且可以拓展免疫类新型药物或新型保健品的开发渠道。

附图说明

图1为蛋白质的标准曲线。

图2为缓冲液pH值对远志糖蛋白提取率的影响。

图3为温度对远志糖蛋白提取率的影响。

图4为盐浓度对远志糖蛋白提取率的影响。

图5为液料比对远志糖蛋白提取率的影响。

图6为提取时间对远志糖蛋白提取率的影响。

图7为pH值、温度的等高线图和响应曲面图。

图8为pH、液料比的等高线图和响应曲面图。

图9为温度、液料比的等高线图和响应曲面图。

图10为五种缓冲液的洗脱曲线。A为Buffer A的洗脱曲线；B为Buffer B的洗脱曲线；C为Buffer C的洗脱曲线；D为Buffer D的洗脱曲线；E为Buffer E的洗脱曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

远志(河北百合中药饮片有限公司生产，批号：815020161)经山西中医学院王兵老师鉴定为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd的干燥根，符合2015版《中国药典》相应药材项下的有关规定，药材实物与名称相符，且质量符合标准。

SPF级昆明小鼠，雌雄各半，4周龄，体重20±2g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号：SCXK-(军)2012-0004)，适应饲养5天，3天换一次垫料，饲养期间自由摄食及饮水。

实施例1、响应曲面试验法优化远志糖蛋白的提取工艺

一、药材预处理(粉碎脱脂)

取洁净的远志药材用粉碎机粉碎，过3号筛(50目，孔径大小为355±13μm)。将过筛的远志粉末置于圆底烧瓶中，加入5倍量的石油醚30-60(即30-60℃沸程规格的石油醚)(5倍量指液料比，单位为mL/g，比如1g药材应加入5mL的石油醚)，40-45℃水浴脱脂1h，过滤，药渣继续加入3倍量(具体含义参照以上“5倍量”)的所述石油醚30-60，同样条件下脱脂0.5h，过滤，将脱脂后的远志粉末自然晾干，备用。

二、蛋白标准曲线的建立

采用考马斯亮蓝法测定远志糖蛋白中的蛋白质含量。将牛血清蛋白配置成0.2mg·mL^-1的蛋白质标准液，各取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，由蒸馏水补足1mL后，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，静置5min，于波长595nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，拟合回归方程。

结果显示，蛋白质标准曲线的回归方程为：y＝5.785x+0.0272(r＝0.9991)，其中x为蛋白质的浓度(单位为mg·mL^-1，线性范围：0.04～0.12mg·mL^-1)，y为吸光度值，r＞0.999，表明该回归方程具有较好的线性关系。见图1。

三、单因素试验设计

1、缓冲液pH值的影响

称取步骤一脱脂后的远志粉末各5g，分别加入pH＝7、8、9、10的Tris-HCl缓冲液(含有NaCl，NaCl浓度为0.1mol·L^-1)40mL，于40℃水浴条件下浸提1.5h，过滤，提取液经Sevage法脱除游离蛋白[参考文献：赵梅,丁霄霖.甘薯糖蛋白脱游离蛋白的研究[J].食品与生物技术学报,2006,01:89-91.]，以所得脱除游离蛋白后的提取液中蛋白含量为指标，根据步骤二建立的蛋白标准曲线考察pH值对远志糖蛋白提取率的影响。提取率＝所得脱除游离蛋白后的提取液中蛋白的总质量/所用脱脂后的远志粉末的总质量×100％。

结果如图2所示，由图可知，pH从7到8，蛋白得率呈上升趋势，之后开始下降。提取液pH值的改变可以直接影响到蛋白质的带电情况，进而影响到蛋白质在溶剂中的溶解能力，由于糖蛋白中蛋白质的等电点偏低，故适宜采用偏碱性的环境进行提取，但pH值不宜过大，否则会导致蛋白质变性，因此选择pH＝8作为最佳提取pH值。

2、提取温度的影响

根据步骤1的试验结果，称取步骤一脱脂后的远志粉末各5g，加入pH＝8的Tris-HCl缓冲液(含有NaCl，NaCl浓度为0.1mol·L^-1)40mL，分别于0、20、40、60、80、100℃条件下浸提1.5h，过滤，提取液经Sevage法脱除游离蛋白(具体方法同上)，以所得脱除游离蛋白后的提取液中蛋白含量为指标，根据步骤二建立的蛋白标准曲线考察提取温度对远志糖蛋白提取率的影响。

结果如图3所示，由图可知，0-40℃范围内，随着温度的上升，糖蛋白得率不断增加，当温度超过40℃之后，随着温度的升高得率反而开始下降，最佳提取温度为40℃。在适宜的温度范围内，随着温度的升高，可加速溶剂对药物成分的解吸和溶解，但是温度过高会使杂质类成分也溶解出来，从而影响糖蛋白的得率，而且也会给后期的分离纯化增加难度，所以必须适当控制提取温度。

3、盐浓度的影响

根据步骤1和2的试验结果，称取步骤一脱脂后的远志粉末各5g，分别加入pH＝8的Tris-HCl缓冲液(含有NaCl，NaCl浓度设置如下梯度：0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol·L^-1)40mL，于40℃条件下浸提1.5h，过滤，提取液经Sevage法脱除游离蛋白(具体方法同上)，以所得脱除游离蛋白后的提取液中蛋白含量为指标，根据步骤二建立的蛋白标准曲线考察缓冲液中盐浓度对远志糖蛋白提取率的影响。

结果如图4所示，由图可知，盐浓度在0.05～0.10mol·L^-1，糖蛋白得率相对较高，之后随着盐浓度的增大，得率反而呈现急剧下降的趋势，盐浓度在0.10mol·L^-1时，蛋白得率最高。低浓度盐溶液可以增加蛋白质分子表面的电荷，使蛋白质溶解度增大，但是当盐浓度达到一定程度时，反而会使蛋白质发生沉淀，产生盐析现象，影响蛋白得率。

4、液料比的影响

根据步骤1-3的试验结果，称取步骤一脱脂后的远志粉末各5g，分别加入pH＝8的Tris-HCl缓冲液(含有NaCl，NaCl浓度为0.1mol·L^-1)30、40、50、60、70mL，于40℃条件下浸提1.5h，过滤，提取液经Sevage法脱除游离蛋白(具体方法同上)，以所得脱除游离蛋白后的提取液中蛋白含量为指标，根据步骤二建立的蛋白标准曲线考察液料比对远志糖蛋白提取效果的影响。

结果如图5所示，由图可知，液料比在6～8mL·g^-1，蛋白得率呈上升态势，但8mL·g^-1以后基本保持不变，这是由于随着液料比的增大可以增加药材与溶剂的接触面积，使目标成分更充分地溶解出来，但是液料比过大，杂质溶出过多，对后期的浓缩及分离纯化都会增加难度，所以，应该控制合适的液料比例。

5、提取时间的影响

根据步骤1-4的试验结果，称取步骤一脱脂后的远志粉末各5g，加入pH＝8的Tris-HCl缓冲液(含有NaCl，NaCl浓度为0.1mol·L^-1)40mL，分别于40℃条件下浸提0.5、1、1.5、2、2.5h，过滤，提取液经Sevage法脱除游离蛋白(具体方法同上)，以所得脱除游离蛋白后的提取液中蛋白含量为指标，根据步骤二建立的蛋白标准曲线考察提取时间对糖蛋白提取率的影响。

结果如图6所示，由图可知，提取时间在0.5～1.5h内增加趋势较为明显，1.5h后得率开始下降，趋势较缓，这是由于刚提取的时候，蛋白质的溶出率尚未达到平衡，随着时间的延长，溶出的成分不断增加；1.5h后，溶出率达到平衡，之后随着时间的延长，溶剂开始挥散，溶出率开始下降，最佳的提取时间应保持在1.5h左右。

四、响应曲面试验优化远志糖蛋白提取条件

1、响应曲面设计与结果

根据步骤三的单因素考察结果，选择其中影响较大的3个因素(pH值、温度和液料比)作为响应变量，以蛋白质得率为响应值，设计3因素3水平的试验方案，并根据单因素考察结果选定各个因素的零水平和波动区间，本试验因素与水平的取值如表1所示。根据Box-Behnken的中心组合设计原理，经Design-Expert V 8.0.6软件分析处理，设计出3因素3水平共15个试验点的响应面试验，试验方案及结果如表2所示。实验中，缓冲液中盐浓度设定为0.1mol·L^-1，提取时间设定为1.5小时，远志糖蛋白的具体提取方法及糖蛋白提取率的计算方法参见步骤三进行。

表1因素水平表

表2响应曲面试验方案与试验结果

2、建立模型方程与显著性检验

应用Design-Expert V 8.0.6软件对表2中的数据进行多元回归拟合及显著性检验，结果为表3所示。

表3回归模型的方差分析结果

pH值(A)、温度(B)、液料比(C)与蛋白得率(Y)之间的二次多项回归方程：Y＝5.99-0.33A-0.86B-2.500E-0.03C+0.17AB-0.16AC+0.14BC-1.21A²-1.19B²-2.06C²，R²＝0.9902，模型的复相关系数r＝0.9951，说明该模型对试验实际情况拟合良好，试验误差较小；从上表可以看出，整体模型的P＝0.0002(P<0.001)，表明该二次方程模型比较显著；模型失拟项的P值为0.7659>0.05，表明模型选择较为合适，整体说明应用该响应曲面模型预测远志糖蛋白的提取试验是可行的。由回归方程系数及其显著性检验结果可知，因素A(P<0.05)与因素B(P<0.05)对提取效果的线性效应显著，因素C(P>0.05)差异无显著性；因素A²、B²、C²(P<0.05)对提取效果的曲面效应均显著；因素AB、AC、BC(P>0.05)对提取效果的交互影响不显著。

3、响应曲面图与等高值线图的分析

经Design-expert软件分析得到响应曲面图与等高值线图。

图7至图9分别显示不同交叉因素对远志糖蛋白得率的交互影响趋势。等高线图可以直观地反映两个因素间交互作用的显著程度，圆形表示交互作用不明显，椭圆越扁平则代表两因素间的交互作用越显著。椭圆越大代表在该圆上取值时，蛋白得率越低，反之，在越靠近中心的较小椭圆上取值，蛋白得率越高。图8和图9中的椭圆明显扁平于图7，说明pH值和液料比、温度和液料比的交互影响明显高于pH值和温度的交互影响。

由图7可得，在液料比为8mL·g^-1、pH值在7.5～8、温度在25～40℃范围时，远志蛋白的提取率最高；由图8可得，在温度为40℃、pH值在7.5～8.2、液料比在7.5～9mL·g^-1范围时，远志蛋白的提取率最大；由图9可得，在pH值为8、温度在25～40℃、液料比在7.5～8.5mL·g^-1范围时，远志蛋白的提取率最大。以上结果与单因素试验结果基本保持一致，说明响应曲面试验分析蛋白提取率的方法比较可行。

应用Design-Expert V 8.0.6软件预测试验的最优化条件为：A＝7.84、B＝32.51、C＝7.99，此条件下远志蛋白的得率预计达到6.17％。考虑到实际操作条件，将提取方案修正为：pH＝7.85、温度33℃、液料比8mL·g^-1。本发明的发明人进一步对该结果进行3次验证性实验，得到蛋白得率分别为5.92％、6.01％、5.96％，平均值高达5.96％，与理论预测结果相差不大，表明该回归模型可以较好地预测远志糖蛋白得率。

实施例2、远志糖蛋白的分离纯化研究

1、除杂

采用实施例1确定的最优提取方案(pH＝7.85、温度33℃、液料比8mL·g-1、缓冲液中盐浓度0.1mol·L-1，提取时间1.5小时)，按照实施例1步骤三中的相关步骤获得脱除游离蛋白后的提取液。然后将所得脱除游离蛋白后的提取液用Cell-Sep即用型透析袋(12KDa)透析除去其中的一些无机盐、色素、低聚糖等小分子杂质，具体操作如下：将所得脱除游离蛋白后的提取液分装于透析袋中，将透析袋放置在0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH＝7.85，无NaCl)透析24h，透析结束后将提取液常温3500r/min离心10分钟，取上清液。

2、远志糖蛋白的DEAE-52阴离子交换层析

将预处理过的DEAE-52填料装柱，用平衡缓冲液平衡几个柱体积，取适宜量的糖蛋白粗提液(即步骤1离心后的上清液)上样，待样品完全吸附后，先用平衡缓冲液洗脱未被吸附的糖蛋白，再依次用不同离子强度的缓冲液洗脱各个组分的糖蛋白，洗脱液分管收集，分别检测各管中蛋白含量和糖含量，收集重合峰。具体操作步骤如下：

A、根据预实验结果，设置不同离子浓度的缓冲液

Buffer A：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液PH＝7.85不含NaCl(即平衡缓冲液)；

Buffer B：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液PH＝7.85含0.06mol/L NaCl；

Buffer C：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液PH＝7.85含0.1mol/L NaCl；

Buffer D：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液PH＝7.85含0.3mol/L NaCl；

Buffer E：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液PH＝7.85含0.5mol/L NaCl。

B、DEAE-52阴离子交换剂的预处理

取一定量(20g)的DEAE-52填料，加入一定体积Buffer A(6mL/g，表示每g的DEAE-52填料加入6mL的Buffer A，轻轻摇动搅拌2-3min，让悬液沉降并倾出上清液中的细小颗粒，然后再次使用Buffer A(6mL/g，含义同上)使离子交换剂松散，溶胀1小时后用于装柱。

C、装柱

将玻璃层析柱洗净后垂直安装于支架上，装入约10mL Buffer A，打开下嘴阀让缓冲液慢慢滴出(目的：排除空气)，同时，将悬浮于Buffer A中处理好的DEAE-52填料一边搅动一边倒入层析柱中，让其自然沉降到全部加入为止。装柱时最好一次倒入，若分次倒入，则需在再次添加前将界面处的交换剂搅起，以保证柱床不分节，柱面平整，柱中无气泡。待液面离填料沉降面1cm后，关闭下嘴阀。

D、平衡

用Buffer A以1.0mL/min的流速，平衡3个柱体积，待填料基本不再沉降时，关闭下嘴阀。

E、上样

将步骤1透析后的样品液(离心后所得的上清液)吸取适宜量10mL均匀加到纤维素柱面上，打开下嘴阀，待降至柱面后关闭，加入少量Buffer A冲洗残留于柱内壁的样品，最后在柱面上留一层1cm左右的Buffer A，吸附至少12小时以上。

F、洗脱

先以2个柱体积Buffer A洗脱未被吸附的糖蛋白液，并收集；然后分别依次以2倍柱体积的Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E进行阶段洗脱，并收集各阶段的洗脱液。

G、检测各管蛋白和多糖含量，并绘制洗脱曲线

采用考马斯亮蓝法测定远志糖蛋白中的蛋白质含量，采用苯酚-硫酸法测定糖蛋白中多糖的含量。

3、实验结果

从以上5个不同离子强度洗脱液所得到的洗脱曲线来看，远志糖蛋白粗品在DEAE-52阴离子交换柱上利用Buffer D溶液洗脱得到了有效的分离，产生了明显的蛋白和多糖的重叠峰，收集多糖和蛋白重叠的高峰部分洗脱液，透析、冷冻干燥(-86℃冷冻24h以上)即得远志糖蛋白(图10)。

实施例3、远志糖蛋白的体内抗衰老作用研究

一、远志总糖蛋白的制备

采用实施例1确定的最优提取方案(pH＝7.85、温度33℃、液料比8mL·g-¹、缓冲液中盐浓度0.1mol·L^-1，提取时间1.5小时)，按照实施例1步骤三中的相关步骤获得脱除游离蛋白后的提取液。然后将所得脱除游离蛋白后的提取液用Cell-Sep即用型透析袋(12KDa)透析除去其中的一些无机盐、色素、低聚糖等小分子杂质，具体操作如下：将所得脱除游离蛋白后的提取液分装于透析袋中，将透析袋放置在0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH＝7.85，无NaCl)透析24h，透析结束后将提取液常温3500r/min离心10分钟，取上清液分装于培养皿中，-86℃冷冻干燥24h，取出即得远志总糖蛋白冻干粉，备用。

二、动物分组、造模、给药

选取SPF级昆明小鼠84只，随机分为空白组、模型组、阳性对照组、远志糖蛋白低、中、高剂量组，每组14只，雌雄各半。采用边造模边给药的方法，除空白组外，其余各组均颈背部皮下注射D-半乳糖1.25g/kg(每天每千克体重的小鼠注射D-半乳糖1.25g)，建立衰老模型[参考文献：林映雪,庄朋伟,张金保,等.D-半乳糖剂量及小鼠性别对衰老模型的影响[J].天津中医药大学学报,2013,03:144-147.]；阳性对照组灌胃维生素E溶液1.25g/kg(每天每千克体重的小鼠灌胃维生素E 1.25g)，低、中、高剂量组分别灌胃远志总糖蛋白100mg/kg体重、200mg/kg体重、400mg/kg体重(均为每天的给药剂量)，其余各组给予同等剂量蒸馏水，各组自由摄食饮水，连续4周。

三、血样处理、脏器称重

末次造模灌胃后，禁食不禁水12h，称量体重，摘眼球取血后，3500r/min离心10min分离血清于离心管中，冷冻备用。然后颈椎脱臼处死，摘取胸腺、脾脏、脑组织，剥除周围结缔组织，并用滤纸除去脏器表面血迹，新鲜称重，记录数据。

四、组织匀浆的制备

将准确称重后的脑组织加入9倍体积的生理盐水，于匀浆机处理制备匀浆，再将匀浆液3500r/min离心10min，取上清液得10％脑组织匀浆，冷冻备用。

五、指标测定及分析方法

计算各脏器指数，即胸腺指数、脾脏指数、脑指数。

公式为：脏器指数(mg/g)＝脏器重(mg)/小鼠体重(g)。

血清中SOD、CAT活力的测定以及脑组织中SOD、MDA的测定，在酶标仪或紫外-可见分光光度计上进行，均按照试剂盒说明书严格操作。

超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(货号：A001-3，生产批号：20160415)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(货号：A007-1，生产批号：20160308)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(货号：A003-1，生产批号：20160415)，均由南京建成生物工程研究所提供。

六、数据处理

实验数据采用SPSS16.0软件进行统计分析，以平均值和标准差表示，用t检验法进行组间比较，以P<0.05或P<0.01为差异，说明组间差别有统计学意义。

七、实验结果

1、远志糖蛋白提取物对各脏器指数的影响

结果如表4所示。由表可知，与空白组比较，模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数和脑指数均显著降低(P<0.05或P<0.01)。衰老常表现为组织器官的退行性变化，即免疫器官等脏器的重量减轻，本实验结果说明注射D-半乳糖溶液会引起小鼠免疫器官萎缩，进一步说明致衰老模型建立成功。与模型组比较，从胸腺指数水平来看，阳性对照组、远志糖蛋白低、高剂量组均显著升高(P<0.05)，中剂量组极显著升高(P<0.01)；从脾脏指数水平来看，远志糖蛋白中、高剂量组均显著升高(P<0.05)；从脑指数水平来看，阳性对照组与远志糖蛋白中、高剂量组均显著升高(P<0.05或P<0.01)。综合三种器官指数的变化结果来看，可以说明远志糖蛋白在一定程度上能够减缓D-半乳糖导致的脏器萎缩。

表4远志糖蛋白对D-半乳糖致衰老小鼠各脏器指数的影响(n＝14，单位mg/g)

注：*.与空白组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；△.与模型组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01。

2、远志糖蛋白对小鼠血清中SOD、CAT活力的影响

结果如表5所示，由表可知：与空白组相比，模型组的SOD、CAT活力均明显降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，远志糖蛋白高剂量组SOD活力显著升高(P<0.05)，其差别具有统计学意义；与远志糖蛋白阳性组比较，高剂量组血清中SOD活力显著升高(P<0.05)，两者差异具有统计学意义，从SOD这一指标来看，远志糖蛋白组的SOD活力高于阳性组，说明远志糖蛋白与维生素E有类似的抗氧化功效，其作用可能优于维生素E。与模型组相比，以CAT水平来看，阳性对照组活力显著升高(P<0.05)，远志糖蛋白中、高剂量组极显著升高(P<0.01)。SOD、CAT均属抗氧化酶类，可清除活性氧，减轻对机体的损害，延缓衰老。远志糖蛋白可显著提高小鼠血清中SOD、CAT的活力，SOD、CAT活力的升高表明远志糖蛋白具有延缓衰老的作用。

表5远志糖蛋白对血清中SOD、CAT活力的影响(n＝14)

注：*.与空白组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；△.与模型组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；#.与阳性组比较，^#P<0.05。

3、远志糖蛋白对小鼠脑组织中SOD活力、MDA含量的影响

结果如表6所示，由表可知：与空白组比较，模型组SOD活力显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，从SOD这一水平来看，远志糖蛋白低、中剂量组能显著提高SOD活力(P<0.05或P<0.01)；从MDA这一水平来看，阳性对照组和远志糖蛋白中剂量组能显著降低脑组织中MDA的含量(P<0.05)，远志糖蛋白高剂量组脑组织中MDA的含量极显著降低(P<0.01)。MDA在脑组织中的含量升高，使自由基对机体的损伤程度加大，加速衰老，实验结果表明远志糖蛋白有效的抑制了脂质过氧化物的产生，起到了一定的抗衰老作用。

表6远志糖蛋白对小鼠脑组织中SOD活力、MDA含量的影响(n＝14)

注：*.与空白组比较，^*P<0.05；△.与模型组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01。

实施例4、远志糖蛋白对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的免疫调节作用研究

一、远志糖蛋白的制备

远志糖蛋白的制备具体参照实施例2。

二、实验动物的分组、免疫低下模型的建立及给药

选取SPF级昆明小鼠72只，适应性喂养3天，随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性组、远志糖蛋白低、中、高剂量组，每组12只，雌雄各半。除空白组外，其他各组连续14天腹腔注射环磷酰胺(30mg·kg^-1小鼠体重)建立免疫低下模型，空白组注射等量生理盐水作为对照。阳性组灌胃给予盐酸左旋咪唑(20mg·kg^-1小鼠体重)，远志糖蛋白组灌胃给予远志糖蛋白低量(100mg·kg^-1小鼠体重)，中量(200mg·kg^-1小鼠体重)，高量(400mg·kg^-1小鼠体重)，其余各组灌胃给予等量蒸馏水。灌胃体积为0.025mL·g^-1小鼠体重，连续灌胃14天。以上各药物的剂量均为每天的给药剂量。

三、远志糖蛋白对小鼠脏器系数的影响

第14天晚上禁食，在第15天眼眶静脉丛取血，离心取血清，分装，冻存于冰箱待测。取血结束后，取其胸腺和脾脏，称重记录。

四、远志糖蛋白对小鼠免疫分子的影响

按试剂盒提供的ELISA法测定血清中IL-2和IL-6的含量。具体操作按照试剂盒说明书进行。

小鼠白介素2(IL-2)ELISA检测试剂盒(CK-E20010)，小鼠白介素6(IL-6)ELISA检测试剂盒(CK-E20012)，均由上海研吉生物科技有限公司提供。

五、统计处理

采用SPSS16.0软件统计分析，实验结果以平均值和标准差表示。P<0.05表示差异具有显著性意义，P<0.01表示差异具有极显著性意义。

六、结果

1、远志糖蛋白对免疫低下小鼠脏器系数的影响

结果如表7所示，从表可知：与空白组比较，模型组小鼠胸腺系数极显著降低(P<0.01)，脾脏系数显著降低(P<0.05)。以胸腺系数水平来看，阳性组与模型组相比，其差异具有统计学意义(P<0.05)；远志糖蛋白中剂量组相比模型组，胸腺系数显著升高(P<0.01)；以脾脏系数水平来看，与模型组相比，阳性组、远志糖蛋白低、中剂量组均显著升高(P<0.05)，表明因造模引起的胸腺和脾脏萎缩，在给予药物治疗后得到了一定程度的改善。

表7远志糖蛋白对免疫低下小鼠脾脏、胸腺指数的影响

注：*.与空白组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；#.与模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01

2、远志糖蛋白对免疫低下小鼠血清IL-2、IL-6含量的影响

结果如表8所示，由表可知：与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-2和IL-6含量均显著降低(P<0.01或P<0.05)，说明以这两种白介素水平来看，模型建立成功。与模型组相比，远志糖蛋白低剂量组能显著提高免疫低下小鼠IL-2水平，远志糖蛋白高剂量组能显著提高血清IL-6水平，其差别均具有统计学意义(P<0.05)。阳性组、远志糖蛋白中量组与模型组相比，在IL-2、IL-6水平，均显著升高(P<0.01)。

表8远志糖蛋白对免疫低下小鼠血清细胞因子IL-2、IL-6含量的影响

注：*与空白组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；#与模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

Claims

1.一种提取远志糖蛋白的方法，包括如下步骤：

(a)将远志粉碎并脱脂；

(b)将经步骤(a)脱脂后的远志粉末在pH为7.5-8.2的缓冲液中浸提；进行所述浸提时的温度为25-40℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5-9mL；所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液中含有浓度为0.05-0.1mol/L的NaCl；进行所述浸提的时间为1-2小时；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述缓冲液的pH为7.5-8.0；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5-8.5mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述缓冲液的pH为7.85；进行所述浸提时的温度为33℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：8.0mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述缓冲液中NaCl的浓度为0.1mol/L；进行所述浸提的时间为1.5小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述“将远志粉碎并脱脂”是通过如下实现的：将远志粉碎后的粉末用5倍量的石油醚30-60，40-45℃水浴脱脂1h，过滤，向滤渣中继续加入3倍量的石油醚30-60，40-45℃水浴脱脂0.5h，过滤，滤渣自然晾干，即得脱脂后的远志粉末；

其中，“n倍量”的单位为mL/g，表示1g远志粉末加入的所述石油醚30-60的毫升数为n。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中，所述除去滤液中的游离蛋白为经Sevage法脱除游离蛋白。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法在步骤(c)之后，还包括如下“步骤(d)”或“步骤(d)和(e)”或“步骤(d)、(e)和(f)”：

(d)将所述远志糖蛋白粗提取液在无NaCl的pH7.85的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h，离心取上清液；

(e)将步骤(d)所得的上清液用DEAE-52阴离子交换层析，收集用含0.3mol/L NaCl的pH＝7.85的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱所得的洗脱液；

(f)将步骤(e)所得洗脱液进行冷冻干燥，即得远志糖蛋白。

8.利用权利要求1-7中任一所述方法所得的含有远志糖蛋白的提取物或者远志糖蛋白。

9.权利要求8所述的含有远志糖蛋白的提取物或远志糖蛋白在如下任一中的应用：

(1)制备具有抗衰老活性的产品；

(2)制备具有免疫促进活性的产品。