CN106668321A - 一种人参枸杞子组合物的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人参枸杞子组合物的制备方法及其产品和应用，属于食品、保健品和药品加工技术领域。本发明以鲜枸杞子和鲜人参为原料，制备方法包括：取新鲜的人参、枸杞子→清洗→切碎→加Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚作为护色剂和生物活性稳定剂→粗破碎→酶解→超微低温细破碎等步骤。本发明依据整体鲜药材入药的原理，运用现代食品和药品加工技术，结合临床实践，最有效保留鲜枸杞子和鲜人参整体鲜药材活性成分的天然比例和结构，最大限度的提升了枸杞子、人参及其组合物在抗疲劳、抗缺氧、抗肿瘤能力以及提高免疫力方面的药效，从而最有效实现了枸杞子以及人参的药用价值。

Description

一种人参枸杞子组合物的制备方法及其产品和应用
技术领域
本发明涉及一种人参枸杞子组合物的制备方法及其产品，特别涉及一种以鲜枸杞子和鲜人参为原料经过超微低温破碎、酶解等工艺制备人参枸杞子组合物的方法以及由该方法得到的产品。本发明属于食品、保健品和药品加工技术领域。
背景技术
枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的成熟果实，夏、秋二季果实呈红色时采收。宁夏是枸杞原产地，栽培枸杞已有500多年的历史，而中宁枸杞则是宁夏枸杞中之上品。中宁枸杞色艳、粒大、皮薄、肉厚、籽少、甘甜，品质超群，是惟一被载入新版中国药典的枸杞品种。其成熟果实中富含特殊生物活性功能成分，如枸杞多糖、单糖、甜菜碱、东莨菪碱、牛磺酸、氨基酸、脂肪酸、维生素B1、维生素B2、维生素C、微量元素等。其中，枸杞多糖被认为是枸杞子主要的功能保健因子，也是枸杞子功效研究报道中最多的一个组分。缺氧和疲劳是动物机体复杂的生理生化过程，有关枸杞子耐缺氧和抗疲劳作用的试验早有报道；也有试验证明枸杞子活性成分能够抗肿瘤、抗脂质过氧化，以及作为免疫调节剂被使用等。
据最新出版的中国食物成分表记载，鲜枸杞中胡萝卜素含量显著高于水果蔬菜，还含有维生素E、维生素D、磷脂及微量元素硒等成分。目前市场上，枸杞子通常以干燥颗粒为主要产品类型。通常采用的干燥技术主要为自然风干或者高温干燥，极其容易损失活性成分，对枸杞子最大功效的发挥极为不利，尤其对于产量有限的中宁枸杞更是巨大浪费。
人参(Panax ginseng C.A.Mey)为五加科人参属草本植物，多于秋季采挖。被誉为“百草之王”，是闻名世界的珍贵保健品。鲜人参主根高30-60厘米，肥厚，肉质，黄白色，主要成分有多种人参皂苷，人参多糖，挥发油，多种氨基酸，肽类及多种维生素等。大量研究表明，人参的主要药用活性成分人参皂苷，具有抗肿瘤，抗疲劳，抗衰老，抗休克，抗病毒和抗炎症，抗感染，抗组织损伤，抗神经细胞凋亡，治疗老年痴呆，改善心脏等功效。目前，常规的加工方法是将人参直接干燥处理，后再根据需要碾细制散剂。这些方法工艺简单、易于操作，但不温和，容易造成有效物质的流失，且一些有害物质如农残和重金属等有害物质也易残留，对人体有着潜在的危害，生产周期也较长。
人参作为一种名贵中药材，能最大限度地发挥药效是所有研究者、商家和消费者的理想。据相关报道，新鲜人参与干燥人参成品的化学活性成分存在着很大差别，而且生物活性也极大不同。相比较而言，鲜人参的综合药效更显著。
以鲜药材为原料的人参、枸杞子组方未见报道。本发明依据传统中医药理论，选用道地药材，以整体鲜药材入药保留全部有效成分，保持各有效成分间的天然配比关系。并且在中国药典中，枸杞归肝经肾经，人参归脾经、肺经、心经、肾经。鲜人参与鲜枸杞组方直接作用到人体的心肝脾肺肾，能归五经，入五脏，整体提高心肝脾肺肾的功能强度。因此，有必要开发一种具有针对性的人参枸杞子组合物制备方法，既保留所有活性物质，又能减少有害物质的残留，提高质量和效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人参枸杞子组合物(简称“参杞组合物”)的制备方法及其产品和应用，该方法以鲜枸杞子和鲜人参为基本原料，通过加入Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚作为护色剂和生物活性稳定剂，经过半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的复合酶酶解，结合超微低温破碎技术和酶解工艺，最终能够完整保留枸杞鲜果和鲜人参的营养成分，进而优化参杞组合物的抗疲劳、抗缺氧、抗肿瘤以及提高免疫力的功效。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种人参枸杞子组合物的制备方法，以鲜枸杞子和鲜人参为原料，所述方法包括以下步骤：
(1)清洗：将新鲜的人参根洗净沥干后切碎，鲜枸杞子洗净沥干后切碎；
(2)加入护色剂和生物活性稳定剂：
向切碎的鲜人参、鲜枸杞子颗粒中加入由Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚所组成的复合护色剂和生物活性稳定剂；
(3)粗破碎：
将步骤(2)得到的含有护色剂和生物活性稳定剂的颗粒用粗破碎机作粗破碎处理，备用；
(4)酶解：
按照料液比1：8-12的比例向步骤(3)得到的混合粗颗粒中加入纯水，然后加入所述混合粗颗粒重量0.1-5％的复合酶进行酶解，所述复合酶由半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶组成；
(5)超微低温破碎：
将步骤(4)酶解后的浆剂置于超微破碎仪中进行超微低温破碎，制得粒度100-300目的浆料，备用。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述的鲜人参、鲜枸杞子的重量比1～100：1～100，优选的，鲜人参和鲜枸杞子的重量比为1：1.5。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的复合护色剂或生物活性稳定剂由Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比为1～10：1～10：1～10：1～10组成，更优选的，Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚的重量比为3：2：2：3。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的酶解按照以下方法进行：按照料液比1:10的比例向步骤(3)得到的混合粗颗粒中加入纯水，然后加入所述混合粗颗粒重量3.5％的复合酶，调节pH为4.2～5.6，于35～60℃水浴中酶解2.5～4.5h。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的复合酶由半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶按照重量比为1～10：1～10：1～10组成，更优选的，半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的重量比为3.5：2：3。
在本发明中，优选的，步骤(5)中超微所述的超微低温破碎是由将步骤(4)酶解后的浆料置于超微破碎仪中，在电压为380V，输出频率16-50Hz，功率23.5-32kW，电机转速3000-9000rpm，温度为5～-20℃条件下，制得100-300目的浆料。
在本发明中，更优选的，电压为380V，输出频率为50Hz，功率为25kW，电机转速为9000rpm，温度为-5℃。
在本发明中，优选的，还包括向得到的浆料中添加低聚果糖和Vc制成直接口服原液，或根据用药或口感需要，制成果汁、果酱、果冻、丸剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
进一步的，本发明还提出了按照本发明所述的制备方法制备得到的人参枸杞子组合物。
为了说明本发明的鲜参杞组合物在抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤或提高免疫力等方面的药效。本发明通过动物整体药效学实验进行了验证研究。
负重游泳试验表明，采用本发明方法制备得到的参杞组合物的高剂量组与对照组相比能显著延长小鼠负重游泳时间，游泳运动后小鼠血乳酸浓度消除幅度高于对照组，降低运动后血清尿素氮浓度，肝糖原含量显著升高。调节免疫实验提示，高剂量组的溶血空斑数明显增多；高剂量组耳廓肿胀度、半数溶血值和中、高剂量组淋巴细胞转化试验吸光度差值显著增加；高剂量组的单核-巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数显著增加，校正碳廓清指数呈现极其显著增高趋势，NK细胞活性显著增加。说明本发明的鲜人参和鲜枸杞子组合物对小鼠具有抗疲劳，提高运动耐力和增强免疫力的作用。
抗缺氧试验表明，本发明的参杞组合物可以延长小鼠密闭缺氧存活时间，并对血红蛋白(Hb)、丙二醛(MDA)、谷丙转氨酶(GPT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性产生积极影响。说明本发明的参杞组合物具有耐缺氧功效，能够进一步应用于具有人体耐缺氧功能的食品、保健品和药物中。
本发明用小鼠S180实体瘤模型观察研究本发明组合物的体内抑瘤作用，并进行了免疫学指标测定。结果表明，本发明组合物活性成分可显著提高荷瘤鼠胸腺指数、巨噬细胞吞噬功能、脾细胞抗体形成、淋巴细胞转化反应和细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能水平，且呈现出一定的剂量依赖效应，高剂量组能显著抑制移植性肿瘤S180的生长。在体液免疫和细胞免疫水平上均呈现出积极作用，而提高荷瘤鼠免疫功能是抑制肿瘤效应的机制之一。因此，可判定为本发明组合物对抗肿瘤有一定功效。
因此，在上述研究的基础上，更进一步的，本发明还提出了所述的人参枸杞子组合物在制备抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤或提高免疫力药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明以鲜药材为原料，缩短了传统药材饮片的工艺周期，减少了更多活性成分的转化，同时截留更多活性成分。实验证明鲜药材从离开母体开始，伴随生理变化，体内成分即发生分解、转化等一系列生物化学反应，所以药材离开母体时间越短，效果越好。最大限度保留并保护了鲜枸杞子和鲜人参的天然活性成分的天然比例和空间结构，更能体现枸杞子与人参组合物的药效。而且口感鲜美，物料颜色鲜艳，避免了传统中药色泽深、特征药味难闻、口味苦涩的缺点。
2、本发明加入强效抗氧化剂Vc、Vc钠、Vc磷酸酯以及茶多酚在组合物里，有效的保护了在加工和储运过程中，枸杞子及人参的各种天然成分的空间结构、配比和稳定性。
3、半纤维素、纤维素、淀粉及果胶是枸杞子和人参体内主要的高分子，也是生物活性小分子形成的底物，通过高选择性的半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶酶解这些大分子底物，能够有效游离活性小分子，提高活性小分子的利用度，进而提高整体药效。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1鲜参杞组合物的制备
(1)清洗：将新鲜的人参根、枸杞子，洗净沥干后切碎，鲜人参和鲜枸杞子的重量比为1：1.5；
(2)加入护色剂和生物活性稳定剂：
向切碎的鲜人参、枸杞子颗粒中加入由Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比为3：2：2：3所组成的复合护色剂及生物活性稳定剂；
(3)粗破碎：
将步骤(2)得到的含有护色剂及生物活性稳定剂的颗粒用粗破碎机作粗破碎处理，备用；
(4)酶解：
按照料液比1:10的比例向步骤(3)得到的混合粗颗粒中加入纯水，然后加入所述混合粗颗粒重量3.5％的复合酶，调节pH为4.5，于45℃水浴中酶解3.5h；
所述复合酶由半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶按照重量比为3.5：2：3组成；
(5)超微低温破碎：
将步骤(4)酶解后的浆剂置于超微破碎仪中进行超微低温破碎，微波破碎仪的电压为380V，输出频率为50Hz，功率为25kw，电机转速为9000rpm，温度为-5℃，制得粒度为300目的浆料，即得鲜参杞组合物浆剂。
还可将得到的鲜参杞组合物浆剂根据用药或口感需要，制成果汁、果酱、果冻、丸剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
实施例2鲜参杞组合物的制备
(1)清洗：将新鲜的人参根、枸杞子，洗净沥干后切碎，鲜人参和鲜枸杞子的重量比为1：1.0；
(2)加入护色剂和生物活性稳定剂：
向切碎的鲜人参、枸杞子颗粒中加入由Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比为5：4：5：3所组成的复合护色剂及生物活性稳定剂；
(3)粗破碎：
将步骤(2)得到的含有护色剂及生物活性稳定剂的颗粒用粗破碎机作粗破碎处理，备用；
(4)酶解：
按照料液比1:8的比例向步骤(3)得到的混合粗颗粒中加入纯水，然后加入所述混合粗颗粒重量2％的复合酶，调节pH为5，于40℃水浴中酶解3h；
所述复合酶由半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶按照重量比为1：1：1组成；
(5)超微低温破碎：
将步骤(4)酶解后的浆剂置于超微破碎仪中进行超微低温破碎，微波破碎仪的电压为380V，输出频率为33Hz，功率为24.5kw，电机转速为6000rpm，温度为5℃，制得180目的浆料，即得鲜参杞组合物浆剂。
还可将得到的鲜参杞组合物浆剂根据用药或口感需要，制成果汁、果酱、果冻、丸剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
实施例3鲜参杞组合物的制备
(1)清洗：将新鲜的人参根、枸杞子，洗净沥干后切碎，鲜人参和鲜枸杞子的重量比为1：2.0；
(2)加入护色剂和生物活性稳定剂：
向切碎的鲜人参、枸杞子颗粒中加入由Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比为1：1：1：1所组成的复合护色剂及生物活性稳定剂；
(3)粗破碎：
将步骤(2)得到的含有护色剂及生物活性稳定剂的颗粒用粗破碎机作粗破碎处理，备用；
(4)酶解：
按照料液比1:12的比例向步骤(3)得到的混合粗颗粒中加入纯水，然后加入所述混合粗颗粒重量2％的复合酶，调节pH为5.5，于50℃水浴中酶解2.5h；
所述复合酶由半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶按照重量比为2：1：1组成；
(5)超微低温破碎：
将步骤(4)酶解后的浆剂置于超微破碎仪中进行超微低温破碎，微波破碎仪的电压为380V，输出频率为16Hz，功率为23Kw，电机转速为3000rpm，温度为-12℃，制得100目的浆料，即得鲜参杞组合物浆剂。
还可将得到的鲜参杞组合物浆剂根据用药或口感需要，制成果汁、果酱、果冻、丸剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
实验例1鲜参杞组合物的抗疲劳实验及对免疫功能的影响
1、实验分组
参杞组合物I组：采用传统方法制备的人参枸杞子干燥粉剂。
制备方法：干人参，产于东北长白山；干枸杞，由宁夏早康枸杞股份有限公司提供。按传统方法加工制备并分为0.25g/kg(组合物/小鼠体重)和0.50g/kg(组合物/小鼠体重)2个剂量组，即低、高实验剂量组。
参杞组合物II组：采用本发明实施例1方法制备的参杞组合物浆剂。
制备方法：新鲜人参，产于东北长白山；新鲜枸杞，由宁夏早康枸杞股份有限公司提供。按本发明实施例1方法加工制备并分为0.25g/kg(组合物/小鼠体重)和0.50g/kg(组合物/小鼠体重)2个浆剂剂量组，即低、高实验剂量组。
对照组：按等量生理盐水灌胃。
2、实验器材
游泳箱，铁球，ACE全自动生化分析仪，721分光光度计，恒温培养箱，ELX 800酶标仪、离心机，CO2培养箱。
血清尿素氮、血乳酸、肝糖原、SOD试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
都氏试剂(碳酸氢钠1.0g、氰化钾0.05g、高铁氰化钾0.2g、蒸馏水1000m1)、补体(新鲜豚鼠血清)、RPMI1640培养液自制、盐酸、异丙醇、MTT、Hank’s液(pH7.2-7.4)、绵羊红细胞(SRBC)、鸡红细胞(CRBC)、SA缓冲液、琼脂糖、印度墨汁、0.1％Na2CO3；刀豆蛋白A(ConA)；小牛血清。
3、实验方法
3.1抗疲劳作用
3.1.1抗疲劳游泳：采用负重游泳试验，取昆明种小鼠100只，随机分为5组，每组20只，按分组剂量连续喂养28d，每日1次，于末次灌胃后30min，将小鼠放人25cm深的水中游泳，水温保持在25℃，鼠尾根部负荷6％体重铁球，立即开始计时，记录小鼠从游泳开始到呼吸衰竭的时间。
3.1.2肝糖元测定：取昆明种小鼠100只，随机分为5组，每组20只，按剂量设计连续喂养28天，于末次灌胃后30min，将小鼠放入25-28℃水中游泳90min取出，立刻取鼠肝脏，离心匀浆后测肝糖元。
3.1.3血乳酸测定：取昆明种小鼠100只，随机分为5组，每组20只，按剂量设计连续喂养28天。在末次给样后30min后，负重2％体重，在温度25-28℃水中游泳60min取出，安静30分钟后，再测血乳酸。
3.1.4尿素氮测定：取昆明种小鼠100只，随机分为5组，每组20只，按剂量设计连续喂养28天，于末次灌胃后30min，将小鼠放入25-28℃水中游泳90min取出，采血、离心，测血清测尿素氮。
3.2免疫调节作用
3.2.1迟发型变态反应：将灌胃后36h的小鼠，腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm，用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。第6天后再将其涂抹于耳部并进行攻击，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24～48h达高峰，选择攻击后36h时颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，测定其肿胀程度。用左右耳重量差表示迟发型变态反应的程度。
3.2.2Con A诱导的小鼠淋巴细胞转化试验：无菌取脾，制成单细胞悬液。用Hank's液洗涤2次，然后将细胞悬浮于2mL的RPMI-1640完全培养液中，调整细胞浓度为3×106个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加50μL Con A(相当于5μg/mL)，另一孔不加Con A作为对照组，置5％CO2、37℃的CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不加小牛血清的RPMI-1640细胞培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL盐酸异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每组分装3孔作为平行样，用酶标仪，在波长570nm下读取OD值，作统计处理。
3.2.3血清溶血素试验：于灌胃给药后第2天，每鼠每天腹腔注射20％压积绵羊红细胞(SRBC)生理盐水细胞混悬液0.2ml，连续给药5天，于最后一次给药后1h，从小鼠眼眶静脉丛取血，离心分离血清，取血清用生理盐水稀释500倍，取稀释血清1ml置试管中，加5％SRBC混悬液0.5ml，置冰浴，再加入以生理盐水1：10稀释的豚鼠血清1ml混合，另设不加血清的空白对照。移置37℃恒温水浴保温30min后，立即移入冰浴终止反应。用1500r/min离心5min，取上清1ml，加都氏试剂3m1，混匀放置10分钟，取上清液用96孔板于540nm处比色，测吸光度值(OD)。另取5％SRBC混悬液0.25ml加都氏试剂4ml，同上测定OD值，作为半数溶血值。血清溶血素含量以半数溶血值(HC50)表示。按下式计算：HC50＝样品的OD值/SRBC半数溶血时的OD值×稀释倍数。
3.2.4抗体生成试验：每只小鼠经腹腔注射2％(V/V)压积羊红细胞(SRBC)0.2mL免疫5d后，取脾，放在Hank’s液中撕碎制成细胞悬液。将表层培养基加热溶解后，与等量双倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10％SRBC(用SA缓冲液配制)、20μL脾细胞悬液，混匀倾倒于琼脂糖玻片上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后加用SA缓冲液稀释过的补体，继续温育1.5h，计数溶血空斑数。
3.2.5小鼠碳廓清试验：小鼠尾静脉注射稀释后的印度墨汁5mL/kg，注入后立即开始计时，分别于2min和10min时，从眼静脉丛中取血20μL，并将其加入0.1％Na2CO3溶液，用分光光度计在600nm波长处测光密度值。以Na2CO3溶液作空白对照，根据动物体重和脾重计算吞噬指数。
3.2.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：每只鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml，30～60min后颈椎脱臼处死。腹腔注射生理盐水2ml，间隔1min后，剖腹吸出腹腔洗液1ml，分别滴于2片载玻片上，于37℃恒温箱内孵育30min，后用生理盐水漂洗、晾干，以丙酮+甲醇(1+1)固定，4％Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗、晾干，用油镜观察并计数，计算出吞噬率和吞噬指数。
3.2.7NK细胞活性测定：取脾脏，制成细胞悬液为效应细胞。在96孔板上分别加入不同剂量组和对照组处理过的效应细胞100μL(20μL药+80μL细胞)，再加入100μL靶细胞悬液(E/T＝50/1)，并同时设靶细胞自然释放组(100μL靶细胞+100μLRPMI-1640)和最大释放对照组(100μL靶细胞+100μL 1％NP-40)，每个样本设4个复孔平行。置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。慢慢吸出各孔上清100μL，加入另一培养板中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的底物液100μL，室温避光反应10～15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μL，终止反应，用酶标仪于570nm波长处测定OD值。
NK细胞活性(％)＝(试验组OD值-自然释放组OD值)/(最大释放组OD值-自然释放组OD值)×100％。
3.3统计方法：运用SPSS 22.0的t检验统计分析数据。
4、实验结果
4.1参杞组合物的抗疲劳试验
参杞组合物的抗疲劳试验结果如表1所示：
表1参杞组合物的抗疲劳试验数据
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
从表1可以看出，与对照组相比，参杞组合物I、II各剂量组均能不同程度的提高肝糖原含量和延长游泳时间，也能降低血尿素氮和血乳酸水平，说明两种组合物都有一定的抗疲劳作用。与参杞组合物I低剂量组相比，参杞组合物II低剂量组的肝糖原含量更高、游泳时间更长，血尿素氮和血乳酸水平更低；与参杞组合物I高剂量组相比，参杞组合物II高剂量组的肝糖原含量显著升高、游泳时间显著延长，血尿素氮和血乳酸水平显著降低。灌服参杞组合物II各剂量组合物后，小鼠的血乳酸消除幅度明显加快，运动后血清尿素氮含量显著降低。其中，相较低剂量组，高剂量组有极其显著的疗效。说明参杞组合物II高剂量组能极其显著提高运动耐力。
4.2调节免疫实验
参杞组合物的迟发型变态反应、淋巴细胞转化试验、溶血空斑和血清溶血素试验结果如表2所示，碳廓清、巨噬细胞吞噬指数和NK细胞活性测定结果如表3所示：
表2迟发型变态反应、淋巴细胞转化试验和溶血空斑试验
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
表2结果表明，参杞组合物I、II高剂量组与对照组相比，高剂量组溶血空斑数和半数溶血值显著增加，具有显著的体液免疫功能。在细胞免疫功能上，各组小鼠耳廓肿胀度随剂量而逐渐增加，高剂量组肿胀度与对照组相比差异有极其显著性。参杞组合物II高剂量组加与不加ConA的吸光度差值差异有显著性。说明参杞组合物II高剂量组能产生更强的免疫应答反应。
表3碳廓清、巨噬细胞吞噬指数和NK细胞活性测定
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
如上表3所示，对照组的巨噬细胞只有少量被吞噬的鸡红细胞，与对照组相比，参杞组合物I、II各剂量组的参杞浆剂均能使吞噬率和吞噬指数增加，表明巨噬细胞数量有明显增加，吞噬鸡红细胞的能力得到显著增强。巨噬细胞功能方面，巨噬细胞吞噬指数均随剂量增加而增加，且高剂量组吞噬指数增加亦有显著差异。与对照组相比，各剂量组的校正碳廓清指数明显升高，高剂量组具有极其显著的升高，说明高剂量组相较于低剂量组具有非常明显的吞噬作用。校正碳廓清指数随着剂量增加不断升高，说明更多的碳粒经血液带到肝、脾等部位后，被相应部位的巨噬细胞吞噬消除。与参杞组合物I各剂量组相比，参杞组合物II各剂量组的校正碳廓清指数、吞噬率、吞噬指数和NK细胞活性更高；且各剂量组的作用与剂量成正比。
综上，说明参杞组合物II各剂量组均能明显提高抗疲劳功效，而高剂量组具有更显著的抗疲劳作用。
而《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)规定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个指标显示阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。故可判定为本发明参杞组合物II具有明显的增强免疫力功能作用。
实验例2参杞组合物的抗缺氧实验
1实验分组
同实验例1。
2实验器材
同实验例1。
3实验方法
将体重为20±2.3g的两月龄昆明种小鼠饲养3天后，依体重随机分为对照组和参杞组合物I、II组的高、低剂量组(分组同实验例1)，每组10只。正常进食饮水，各剂量组按不同剂量每天分别灌胃参杞组合物，对照组给予等量的生理盐水，14天后，全部小鼠按下述指标进行检测。
密闭缺氧试验：于末次灌胃1h后，将小鼠装入250ml的透明广口瓶中，并放入10g钠石灰以吸收CO2。密闭，观察并记录存活时间。当小鼠停止呼吸后，立即取出，迅速断头取血，取心、肝，匀浆后，备用。
存活时间判定：自放人密闭瓶后开始计时，以呼吸停止为死亡指标。
血红蛋白含量：高铁氰化法测定。在测定管中准确加入HiCN稀释试剂5.0mL，吸取20μL全血，冲洗3次，混匀。放置3min后，用分光光度计于540nm测定吸光度值(OD540nm)。
血红蛋白(g/L)＝测定管OD540nm×367.6。
MDA含量：TBA法。称取心、肝匀浆各1g，加入2ml 0.6％磷酸盐缓冲液，混匀后，沸水浴15min，取出冷却，在10000r/min离心10min，分离出上清，用分光光度计分别于450nm(OD450nm)、532nm(OD532nm)和600nm(OD600nm)处测定吸光度值。
C(μmol/L)＝6.45×(OD532nm-OD600nm)-0.56×OD450nm。
GPT活性：金氏法(King法)。取两管，分别为测定管和空白管。测定管中加入0.5mLGPT底物液和0.1mL血清，混匀，置于37℃水浴中60min；再加2,4-二硝基苯肼溶液0.5mL，混匀后于37℃水浴中20min，最后加入0.4mol/L NaOH 5.0mL混匀，放置10min后，在520nm波长处进行比色测定。以空白组调零，读取测定分光光度值(OD520nm)。每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
SOD活性：取匀浆200mL加酶活测定试剂，混匀后放置1min，于3500-4000r/min4℃离心15min，取上清液按照试剂盒测定吸光度值。
4统计方法：运用SPSS 22.0的t检验统计分析数据。
5结果与分析
5.1参杞组合物对密闭缺氧时间的影响
参杞组合物对小鼠缺氧耐受力的影响如表4所示：
表4参杞组合物对小鼠缺氧耐受力的影响
剂量组 小鼠数(只) 存活时间(min) 增加率(％)
对照组 10 12.36±1.12 -
II组低 10 12.79±0.85 3.47
II组高 10 16.82±1.23** 36.08
I组低 10 12.83±1.08 3.80
I组高 10 14.48±1.31* 17.15
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
表4结果表明，各剂量组均延长了小白鼠的存活时间，其中高剂量组分别延长了17.15％和36.08％。与各低剂量组和参杞组合物I高剂量组相比，参杞组合物II高各剂量组能极显著提高小鼠缺氧耐受力。
5.2对血红蛋白含量的影响
参杞组合物对血红蛋白含量的影响如表5所示：
表5对血红蛋白含量的影响
剂量组 血红蛋白(g/L) 抑制率(％)
对照组 258.49±12.67 -
II组低 236.34±14.89* 8.57
II组高 196.52±15.38** 23.97
I组低 252.63±14.25 2.27
I组高 214.47±13.15** 17.03
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
表5比较了各剂量组中小鼠血红蛋白浓度的变化。结果显示不同剂量组参杞组合物可以不同程度地缓解缺氧对机体的损害，参杞组合物II高各剂量组能极显著降低抗缺氧处理后小鼠的血红蛋白含量，这对于研究高原耐缺氧功能新食品有一定意义。
5.3对MDA含量和酶活性的影响
参杞组合物对MDA含量和酶活性的影响如表6所示：
表6对MDA含量和酶活性的影响
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
从表6结果可以看出，与对照组相比，各剂量组小鼠的心、肝MDA含量显著升高，与低剂量组相比，高剂量组的MDA含量增长更显著；其中，参杞组合物II高剂量组小鼠心、肝中的MDA含量增长极其显著(P＜0.01)。
表中的GPT(谷丙转氨酶)含量，随着鲜人参枸杞子组合物剂量的增大，呈现出增多的趋势，而高剂量组相较对照组，呈极其显著变化。
受试药物能明显增加肝脏SOD活力，降低MDA含量，提高抗氧化酶的活性，增强消除自由基的能力，使脂质过氧化损伤降低。
与参杞组合物I各剂量组相比，参杞组合物II各剂量组的功效更显著。参杞组合物均可以延长小鼠密闭缺氧存活时间，对血红蛋白(Hb)、丙二醛(MDA)、谷丙转氨酶(GPT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性均有影响，为进一步研究人体耐缺氧功能保健食品、药物提供依据。
实验例3参杞组合物活性成分的抗肿瘤实验
1、实验材料
药物(人参、枸杞子活性成分)：枸杞子多糖、人参皂苷均由宁夏早康枸杞股份有限公司提供。
动物：ICR小鼠，体重18～22g。
2、实验分组
小鼠60只，随机分为6组，即正常对照组、荷瘤模型组和参杞组合物I、II组10、20mg/kg(组合物/小鼠体重)人参皂苷、枸杞子多糖混合组。除正常对照组外，其余5组小鼠的右前腋下接种2×106个/ml S180瘤(小白鼠肉瘤)细胞液0.2ml建立荷瘤模型，接种3d后开始按上述剂量灌胃给药，对照组小鼠灌胃等容量的生理盐水，连续10d，间隔12小时后处死小鼠，取样测定指标。
接种3天后，荷瘤模型组皮下有可触及到的肿块，且逐渐的长大，肉眼观察局部可见隆起，并且肿块向胸廓蔓延，小鼠活跃度降低，活动减少。提示本实验腋下荷瘤鼠模型建模成功。
疗效评价方法：于停药后次日处死动物，剥取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率＝(荷瘤模型组平均瘤重－给药组平均瘤重)/荷瘤模型组平均瘤重×l00％。
3、实验方法
采用小鼠S180实体瘤模型观察研究本发明组合物的体内抑瘤作用，并进行了免疫学指标测定。
研究本发明组合物的抑瘤率和对荷瘤鼠胸腺指数的影响：小鼠灌胃2周后，间隔12小时后眼眶取血处死，摘取瘤、胸腺，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干称重。
巨噬细胞吞噬功能试验：于试验前3d，每只小鼠腹腔注射6％淀粉肉肠1ml，试验当日，每只小鼠腹腔注射1％鸡红细胞(CRBC)1ml，30min后腹腔注射Hank’s液1ml轻揉腹边缘部，20min后用注射器吸取腹腔液涂片，甲醇固定，吉姆萨染色，显微镜下计算吞噬率和吞噬指数。
对荷瘤鼠脾细胞抗体形成的影响：小鼠给药5d后腹腔注射0.2ml 20％的绵羊红细胞(SRBC)第10d后眼眶取血处死，摘除脾脏，并用PBS缓冲液制成5×106/ml的脾细胞悬液，后在试管中依次加入1ml脾细胞悬液，0.4％SRBC和1∶10的豚鼠血清各1ml，37℃水浴1h后3000r/min离心5min，取上清液于413nm处测定吸光度值。
淋巴细胞转化试验：将小鼠脱臼处死后无菌取出小鼠脾脏，剪碎，过200目尼龙网配制成单个细胞悬液，用0.01％Tris-NH4Cl溶解红细胞，PBS洗涤3次后配成细胞浓度为5×106/ml的悬液，每孔0.1ml加入96孔培养板中，再分别加入终浓度为5μg/ml刀豆蛋白A(ConA)，将培养板放入含有5％CO2的37℃培养箱中培养72h，用MTT比色分析法570nm处测定吸光值。
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的测定：小鼠给药10d后，取脾脏，制备浓度为5×106/ml的效应细胞，浓度为1×105/ml的S180细胞为靶细胞，效靶比为50∶1。放入37℃恒温箱24h，用MTT法测定490nm处吸光值(OD490nm)，进而得到CTL效应细胞对靶细胞的杀伤率。
细胞杀伤率＝[1-(实验组OD490nm-效应细胞对照组OD490nm)/靶细胞对照组OD490nm]×100％。
4、统计分析方法
不同数据间用t检验作统计学分析，采用SPSS22.0软件处理。
5、结果
参杞组合物活性成分的抗肿瘤效果及其对免疫功能影响如表7-9所示：
表7人参枸杞子活性成分对S180瘤和对荷瘤鼠胸腺指数的影响(n＝10)
剂量组 瘤重(g) 抑制率(％) 胸腺指数(mg/g)
荷瘤模型组 2.18±0.08 - 1.26±0.34
正常对照组 - - 1.93±0.10
II组低 1.59±0.35 27.06 1.57±0.13
II组高 1.02±0.09** 53.21** 1.88±0.16**
I组低 1.65±0.19 24.31 1.31±0.19
I组高 1.28±0.24* 41.28* 1.72±0.11**
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
表7结果表明，各剂量组的人参枸杞子活性成分都能在一定程度上抑制移植性肿瘤S180的生长，各低剂量组人参枸杞子活性成分的抑瘤率分别为24.31％和27.06％，高剂量组的抑瘤率则达到了41.28％和53.21％，抑制率非常显著。《现代肿瘤治疗药物学》中抗肿瘤中草药有效性的标准中复方中药的抑瘤率＞40％，本实验中人参枸杞子活性成分I、II高剂量组都能有效抗肿瘤。荷瘤鼠的胸腺指数显著低于正常对照组，但与荷瘤模型组相比，经低、高剂量组人参枸杞子活性成分治疗后的荷瘤鼠的胸腺指数显著增加，人参枸杞子活性成分I、II高剂量组均能取得极其显著的治疗效果。与荷瘤模型组相比，各剂量组的瘤重均有降低，取得显著的抑瘤效果。其中，人参枸杞子活性成分II高剂量组能极其显著提高荷瘤鼠的胸腺指数，具有极其显著地抗肿瘤功效。
表8人参枸杞子活性成分对荷瘤鼠吞噬细胞吞噬功能的影响(n＝10)
剂量组 吞噬率(％) 吞噬指数(mg/g)
荷瘤模型组 30.46±2.83 0.34±0.16
正常对照组 50.66±2.25 1.29±0.21
II组低 33.25±2.84 0.74±0.13
II组高 49.71±1.62** 1.25±0.11**
I组低 34.51±2.65 0.72±0.18
I组高 37.96±3.26* 0.87±0.19*
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
表8结果表明，荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均显著低于正常对照组，人参枸杞子活性成分II组10mg/kg和20mg/kg均可明显增强荷瘤鼠巨噬细胞吞噬功能，以20mg/kg人参枸杞子活性成分效果最好，可使荷瘤鼠巨噬细胞吞噬功能恢复到接近正常小鼠水平。
表9人参枸杞子活性成分对荷瘤鼠脾细胞抗体形成、淋巴细胞转化和CTL杀伤功
能的影响(n＝10)
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
从上表9中可以看出，在413nm处吸光值人参枸杞子活性成分对低、高剂量组的影响呈递增趋势，但人参枸杞子活性成分高剂量组高于正常对照组和荷瘤鼠模型组，与低剂量组相比，有显著性差异。人参枸杞子活性成分能提高机体免疫力，增强小鼠细胞毒性淋巴细胞杀伤活性的作用。与低剂量组相比，高剂量组的杀伤活性明显升高，数据具有统计学意义。
荷瘤鼠脾细胞抗体生成、淋巴细胞转化和CTL杀伤功能均明显低于正常对照组。经过人参枸杞子活性成分II治疗过荷瘤鼠的脾细胞抗体生成量、淋巴细胞转化和CTL杀伤功能增加，与荷瘤模型鼠相比达到极显著水平。

Claims (10)

1.一种人参枸杞子组合物的制备方法，其特征在于以鲜枸杞子和鲜人参为原料，所述方法包括以下步骤：
(1)清洗：将新鲜的人参根洗净沥干后切碎，鲜枸杞子洗净沥干后切碎；
(2)加入护色剂和生物活性稳定剂：
向切碎的鲜人参、鲜枸杞子颗粒中加入由Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚所组成的复合护色剂和生物活性稳定剂；
(3)粗破碎：
将步骤(2)得到的含有护色剂和生物活性稳定剂的颗粒用粗破碎机作粗破碎处理，备用；
(4)酶解：
按照料液比1：8-12的比例向步骤(3)得到的混合粗颗粒中加入纯水，然后加入所述混合粗颗粒重量0.1-5％的复合酶进行酶解，所述复合酶由半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶组成；
(5)超微低温破碎：
将步骤(4)酶解后的浆剂置于超微破碎仪中进行超微低温破碎，制得粒度为100-300目的浆料，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的鲜人参、鲜枸杞子的重量比1～100：1～100，优选的，鲜人参和鲜枸杞子的重量比为1：1.5。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的复合护色剂和生物活性稳定剂由Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比为1～10：1～10：1～10：1～10组成，优选的，Vc、Vc钠、Vc磷酸酯、茶多酚的重量比为3：2：2：3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的酶解按照以下方法进行：按照料液比1:10的比例向步骤(3)得到的混合粗颗粒中加入纯水，然后加入所述混合粗颗粒重量3.5％的复合酶，调节pH为4.2～5.6，于35～60℃水浴中酶解2.5～4.5h。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的复合酶由半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶按照重量比为1～10：1～10：1～10组成，优选的，半纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的重量比为3.5：2：3。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的超微低温破碎是由将步骤(4)酶解后的浆料置于超微破碎仪中，在电压380V，输出频率16-50Hz，功率23.5-32kw，电机转速3000-9000rpm，温度为5～-20℃条件下，制得100-300目的浆料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于电压380V，输出频率为50Hz，功率为25kw，电机转速为9000rpm，温度为-5℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于还包括向得到的浆料中添加低聚果糖和Vc制成直接口服原液，或根据用药或口感需要，制成果汁、果酱、果冻、丸剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
9.按照权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的人参枸杞子组合物。
10.根据权利要求9所述的人参枸杞子组合物在制备抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤或提高免疫力药物中的应用。
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