CN108014150B - 天然药物组合物在制备抗缺氧和抗辐射的药物或食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然药物组合物在制备抗缺氧和抗辐射的药物或食品中的应用，该天然药物组合物，以重量份数计，包括以下组分：芫根多糖10～90份，沙棘黄酮10～90份。本发明将芫根多糖和沙棘黄酮进行组合，并通过试验证明该天然药物组合具有协同增效作用，能够显著提高机体的缺氧耐受力和抗辐射能力，可用于制备预防急性高原反应、高原病和辐射损伤的药物和食品。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及天然药物组合物在制备抗缺氧和抗辐射的药物或食品中的应用。
背景技术
氧是人类及许多生物赖以生存的物质基础之一，与生命的繁衍、进化密切相关。机体对氧的摄入不足或氧的代谢障碍都可能会导致细胞、组织和器官的功能或形态异常，进而引发一系列疾病。
氧和缺氧是生命科学基本理论的重要课题。缺氧的形成一般可分为三类：第一类是外界环境氧含量降低，使正常生理活动过程不能摄取足够氧，如高原、潜水和航空等特殊环境导致的缺氧；第二类是指因疾病等导致外界正常氧量不能充分到达机体内，造成心、脑和呼吸系统等的缺氧；第三类是机体活动所需氧消耗量，超过了生理动员能力，造成相对氧供给不足，常见于剧烈运动和超限量劳动。这些都可能给身体造成损害，威胁健康。
我国海拔3000m以上的高原地区约占整个国土面积的1/4，常住人口约6000多万，主要分布在西藏、青海和新疆一带。其中，青藏高原平均海拔在4000m以上。该地区不仅具有丰富的能源、矿藏、药材、畜牧业资源，也是重要的国防前哨和少数民族聚居地。来自中国军队的统计资料显示，进入3000m和3655m地区时，急性高原病的发病率分别为57.3％和63.8％；进入3900m和4500m地区时，急性高原病的发病率分别高达89.2％和100％。进入高原地带的过程中，急性高原病高发是造成部队大量非战斗性减员、严重影响战斗力的主要因素。
辐射被公认为是继水、大气、噪音污染之后的第四大污染源，无论是生活在天然高辐射地区生活的居民，还是从事辐射相关工作的特殊职业人群，都可能会遭受不定程度的辐射损伤。
所以，积极采取措施预防和治疗机体缺氧和辐射造成的损伤对保证人类的健康具有重要意义。
对于抗缺氧、抗辐射的药物主要分为化学药和中成药，化学药如乙酰唑胺、地塞米松、氨磷汀、尼尔雌醇等，虽然具有较好的抗缺氧和/或抗辐射作用，但由于其副作用明显而受到限制；抗缺氧的中成药包括人参、红景天、冬虫夏草等，虽然可以有效提高机体的低氧耐受力、减少辐射损伤，但因资源有限且价格昂贵，也难以大范围推广使用。
所以，迫切需要开发出高效、经济的抗缺氧和抗辐射损伤的药物。
发明内容
本发明提供了一种天然药物组合物在制备抗缺氧和抗辐射的药物或食品中的应用，该天然药物组合物能够显著提高机体的缺氧耐受力和抗辐射能力，可用于制备预防急性高原反应、高原病和辐射损伤的药物和食品。
具体技术内容如下：
本发明提供了一种天然药物组合物在制备抗缺氧药物或食品中的应用，以重量份数计，所述天然药物组合物，包括以下组分：芫根多糖10～90份，沙棘黄酮10～90份。
本发明还提供了一种天然药物组合物在制备抗辐射药物或食品中的应用，以重量份数计，所述天然药物组合物，包括以下组分：芫根多糖10～90份，沙棘黄酮10～90份。
进一步地，以重量份数计，所述天然药物组合物，包括以下组分：芫根多糖30～70份，沙棘黄酮30～70份。
更优选，以重量份数计，所述天然药物组合物，包括以下组分：芫根多糖70份，沙棘黄酮30份；或者，芫根多糖30份，沙棘黄酮70份；或者，芫根多糖65份，沙棘黄酮35份。
芫根(Brassica rapa L.)，学名芜菁，藏语叫“妞玛”，属十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)，是我国藏区独有的食、药、饲三用植物，也是藏民及其爱畜(牦牛)进入高海拔地区作业时的必备食材(防“山毒”，即高原缺氧)。藏医学典籍《四部医典》、《新编藏医学》和现代的《四川省藏药材标准》等均记载芫根具有清热解毒、滋补增氧、缓解高原性缺氧和高原性疲劳等功效。
本发明采用的芫根多糖提取自海拔3000米以上西藏地区的十字花科芸薹属植物芫根块茎中，是一种浅褐色粉末或粘胶状的大分子活性物质。
沙棘(Hippophaerhamnoides L.)，又名醋柳、黄酸刺、黑刺，属胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)植物，在我国西北部广泛分布，也是我国藏医传统的习用药材。目前，沙棘已被我国卫生部列入既是食品又是药品的物品名单，具有广泛的应用前景。沙棘黄酮是从沙棘果实和沙棘叶片中提取的黄酮类化合物，是沙棘主要的活性成分之一。
本发明采用的沙棘黄酮提取自胡颓子科沙棘属植物沙棘的成熟果实，是一种棕色或深棕色粉末或粘胶状的小分子活性物质。
本发明中芫根多糖的提取方法为传统的水提法，沙棘黄酮的提取方法主要以醇提为主，也可采用水提法，具体内容如下：
(1)芫根多糖：取芫根块茎干粉或鲜品用蒸馏水直接提取；或者，取新鲜芫根块茎榨汁，过滤，滤液浓缩至1/2-1/5，加入质量分数为70～100％的乙醇沉淀，收集沉淀物，得到芫根粗多糖；芫根粗多糖经Sevag法去除蛋白杂质，采用膜分离、透析或超滤手段去除小分子杂质，干燥后，得到芫根多糖(纯度大于70％，指质量分数)；再采用离子交换柱和葡聚糖凝胶层析纯化，按分子量大小分段收集，干燥后，得到不同分子量段的精制芫根多糖(纯度为90～95％，指质量分数)。
(2)沙棘黄酮：取沙棘果实用质量分数为30-95％的乙醇提取，过滤，滤液浓缩，回收乙醇，浓缩液依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取相，浓缩，回收正丁醇，干燥后，得到沙棘粗黄酮；沙棘粗黄酮用去离子水溶解，经膜分离、透析或超滤手段去除大分子杂质(分子量大于1000)，干燥后，得到沙棘黄酮(纯度大于24％，指质量分数)；再用去离子水溶解，依次采用大孔树脂、聚酰胺树脂柱层析纯化，干燥后，得到精制沙棘黄酮(纯度为60～95％，指质量分数)。
上述不同纯度的芫根多糖和沙棘黄酮可以用于制备不同纯度要求的产品，如：芫根粗多糖和沙棘粗黄酮可用于制备普通食用食品；芫根多糖和沙棘黄酮可用于制备保健品；精制芫根多糖和精制沙棘黄酮可用于制备药品。
经试验发现，重均分子量相对较小(33.2～52.4kDa)的芫根多糖是其发挥抗缺氧、抗辐射功效的主要部分。将该分子量段的芫根多糖和沙棘黄酮进行组合能够进一步提高机体的缺氧耐受力和抗辐射能力，即：提高小鼠常压耐缺氧试验中的存活时间和减压缺氧试验中的存活率，改善小鼠脑组织中抗氧化酶SOD和CAT活力；提高人体低氧环境下的血氧饱和度；促进受辐照大鼠的外周血白细胞的恢复，提高骨髓细胞增殖能力，提高有核细胞计数，减少骨髓细胞的凋亡和坏死。
此外，本发明还对多种同样具有抗缺氧、抗辐射的植物多糖和植物黄酮进行了试验，发现：虽然此类植物多糖和植物黄酮本身都具有抗缺氧和抗辐射功效，但是，组合形式的不同会带来抗缺氧、抗辐射效果上的巨大差异。由于试验种类较多，本发明举例几种组合进行说明。例如：黄芪多糖和沙棘黄酮的组合物，枸杞多糖和沙棘黄酮的组合物，芫根多糖和银杏黄酮的组合物。
进一步优选，所述芫根多糖的重均分子量为33.2～52.4kDa，总多糖的含量(苯酚-硫酸法测定)为90～99wt％。试验表明，沙棘黄酮与不同重均分子量的芫根多糖进行组合后，在抗辐射或者抗缺氧的效果上存在差异。
作为优选，所述沙棘黄酮来源于沙棘的成熟果实。
进一步优选，所述沙棘黄酮的总黄酮含量为18.0～95.0wt％(经硝酸铝-亚硝酸钠显色法测定)。
进一步优选，所述沙棘黄酮中含有异鼠李素、槲皮素和山奈素；以质量分数计，异鼠李素的含量≥15.7％，槲皮素的含量≥5.4％，山奈素的含量≥10.3％。(各组分的含量以沙棘黄酮水解后高效液相色谱仪(HPLC)测定得到的异鼠李素苷元含量、槲皮素苷元含量和山奈素苷元含量计)
本发明还提供了一种抗缺氧和抗辐射的药物，由天然药物组合物和药物学上可接受的载体组成，所述天然药物组合物，以重量百份数计，包含以下组分：芫根多糖10～90份，沙棘黄酮10～90份。
上述药物学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。另外，还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
具体地，本发明提供了上述药物为片剂或胶囊制剂的实例。一种抗缺氧和抗辐射的食品，包括天然药物组合物；所述天然药物组合物，以重量百份数计，包含以下组分：芫根多糖10～90份，沙棘黄酮10～90份。
上述天然药物组合物可以添加在食品如饮料、糖果、糕点、果酱、速食食品等中，也可以制成片剂，丸剂，粉剂，分散剂，气雾剂，溶液剂，软胶囊，硬胶囊。上文所述的食品均指常规食用食品以及保健食品。
针对于上述药物和食品，进一步地，以重量份数计，所述天然药物组合物，包括以下组分：芫根多糖30～70份，沙棘黄酮30～70份。
更优选，以重量份数计，所述天然药物组合物，包括以下组分：芫根多糖70份，沙棘黄酮30份；或者，芫根多糖30份，沙棘黄酮70份；或者，芫根多糖65份，沙棘黄酮35份。
进一步优选，所述芫根多糖的重均分子量为33.2～52.4kDa，总多糖的含量(苯酚-硫酸法测定)为90～99wt％。
作为优选，所述沙棘黄酮来源于沙棘的成熟果实。
进一步优选，所述沙棘黄酮的总黄酮含量为18.0～95.0wt％(经硝酸铝-亚硝酸钠显色法测定)。
进一步优选，所述沙棘黄酮中含有异鼠李素、槲皮素和山奈素；以质量分数计，异鼠李素的含量≥15.7％，槲皮素的含量≥5.4％，山奈素的含量≥10.3％。(各组分的含量以沙棘黄酮水解后高效液相色谱仪(HPLC)测定得到的异鼠李素苷元含量、槲皮素苷元含量和山奈素苷元含量计)。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将芫根多糖和沙棘黄酮进行组合，并通过试验证明该天然药物组合具有协同增效作用，能够显著提高机体的缺氧耐受力和抗辐射能力，可用于制备预防急性高原反应、高原病和辐射损伤的药物和食品。
具体实施方式
实施例1芫根多糖的制备
(1)取海拔3000米以上西藏地区的十字花科芸薹属植物芫根的块茎，干燥后粉碎，得到干粉；
(2)取干粉20kg，用12倍量(质量倍数)的蒸馏水于95℃下浸提2次，每次2小时，过滤，得到浸提液；将两次过滤获得的浸提液合并，浓缩至浸提液体积的1/4，得到浓缩提取液；
(3)持续搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积量的质量分数为95％的乙醇水溶液，将浓缩提取液中的多糖沉淀出，过滤，收集沉淀物，将沉淀物冷冻干燥后，得到芫根粗多糖；
(4)将芫根粗多糖重新用水溶解后，采用Sevag法除去芫根粗多糖中的蛋白，反复进行6次，减压浓缩去除Sevag试剂，加适量去离子水加热至70℃，趁热滤出不溶物，滤液经清水和双蒸水透析去除小分子杂质，干燥后得到总多糖含量(苯酚-硫酸法测定)(质量分数)大于70％的芫根多糖；
(5)采用DEAE-cellulose离子交换柱和Sephacryl S-100葡聚糖凝胶柱层析纯化步骤(4)获得的芫根多糖，按分子量大小分段收集，干燥后，得到BRP-1、BRP-2和BRP-3三个分子量段的精制芫根多糖。其中，BRP-1的总多糖含量(苯酚-硫酸法测定)(质量分数)为94.3％，重均分子量为38.6kDa；BRP-2的总多糖含量(苯酚-硫酸法测定)(质量分数)为95.5％，重均分子量为131.2kDa；BRP-3的总多糖含量(苯酚-硫酸法测定)(质量分数)为96.1％，重均分子量为203.5kDa。
取上述步骤制备的芫根多糖225g，药用淀粉适量，制粒，干燥，整粒，压片，制成芫根多糖片剂500片。
实施例2沙棘黄酮的制备
(1)取沙棘成熟果实，干燥后粉碎，得到干粉；
(2)取干粉20kg，用8倍量(料液比)的质量分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，减压浓缩滤液至无醇，得到粗浸膏；
(3)向粗浸膏中加入3.0L蒸馏水，加热至50℃使粗浸膏溶解，冷却后，用石油醚萃取5次，每次3.0L，去除石油醚萃取相，再用水饱和正丁醇萃取5次，每次3.0L，收集正丁醇萃取相，50℃减压浓缩除去正丁醇，回收正丁醇，冷冻干燥后即得沙棘粗黄酮，总黄酮含量(硝酸铝-亚硝酸钠显色法测定)(质量分数)为19.3％；
(4)沙棘粗黄酮重新用去离子水溶解分散，经超滤设备去除大分子杂质，采用D101大孔树脂柱层析对沙棘黄酮进行富集，再经聚酰胺树脂柱层析纯化，干燥后，得到总黄酮含量(硝酸铝-亚硝酸钠显色法测定)(质量分数)为86.2％的精制沙棘黄酮。经水解后HPLC分析，异鼠李素苷元占总黄酮的17.4wt％，槲皮素苷元含量为11.3wt％，山奈素苷元含量为16.3wt％。
取上述步骤制备的沙棘粗黄酮225g，药用淀粉适量，制粒，干燥，整粒，压片，制成沙棘黄酮片剂500片。
实施例3
本实施例制备得到精制黄芪多糖、精制枸杞多糖和精制银杏黄酮；其中，精制黄芪多糖提取自黄芪干燥根，精制黄芪多糖的纯度(苯酚-硫酸法测定)为95.2％(质量分数)(具体方法参见：刘荣强.黄芪多糖结构与抗肿瘤活性研究[D].天津科技大学,2011)；精制枸杞多糖提取自枸杞干燥果实，精制枸杞多糖的纯度(苯酚-硫酸法测定)为94.1％(质量分数)(具体方法参见：刘荣强.黄芪多糖结构与抗肿瘤活性研究[D].天津科技大学,2011)；精制银杏黄酮提取自银杏干燥叶，精制银杏黄酮纯度(硝酸铝-亚硝酸钠显色法测定)为84.6％(质量分数)，市售。
将上述制备得到的精制黄芪多糖、精制枸杞多糖和精制银杏黄酮与沙棘黄酮或芫根多糖进行组合，分别得到黄芪多糖和沙棘黄酮的组合物，枸杞多糖和沙棘黄酮的组合物，芫根多糖和银杏黄酮的组合物(具体比例见实施例6)。
实施例4
取实施例1步骤(4)中制得的芫根多糖315g和实施例2步骤(3)中制得的沙棘粗黄酮135g，药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，压片，制成片剂1000片。
实施例5
取实施例1步骤(5)中的BRP-1精制芫根多糖105g和实施例2步骤(4)中的精制沙棘黄酮45g，少量水混匀后，干燥，药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，装入胶囊，制成胶囊剂600粒。
实施例6药效学试验
(1)BRP-1、BRP-2和BRP-3精制芫根多糖抗缺氧功效评价
取健康的雄性ICR小鼠120只，体重18～22g，由浙江中医药大学动物中心提供，试验前适应环境7天。按体重随机分为4组，每组30只，具体分组情况见表1。
以实施例1步骤(5)制得的BRP-1、BRP-2和BRP-3精制芫根多糖(以下分别称BRP-1芫根多糖、BRP-2芫根多糖和BRP-3芫根多糖)分别用蒸馏水充分分散溶解，同时以蒸馏水为空白对照组，灌胃给药7天后，各组随机选取10只小鼠进行常压耐缺氧试验，剩余20只进行急性减压缺氧存活试验。饲喂、给药期间，自由饮水、进食。
表1实验小鼠分组给药情况
①常压耐缺氧试验步骤：根据《功能食品检验与评价技术规范》(2003版)功能学评价检验方法中的“提高缺氧耐受力功能检验方法”。实验小鼠最后一次灌胃给药后，在正常环境下活动1小时后，分别放入装有5g钠石灰的250mL的具塞磨口广口瓶中(每瓶1只)，瓶盖周围涂抹凡士林密封，加盖后立即计时。以小鼠呼吸停止为终点，停止计时，记录小鼠因缺氧而死亡的时间。
②急性减压缺氧存活试验步骤：小鼠最后一次灌胃给药后，禁食禁水，待小鼠在正常环境下活动1小时后，立即放入低压低氧氧舱中，关紧舱门，以1000米/分钟的速度减压上升至相当于海拔5000米和8000米，各停留5分钟，最终上升至海拔10000米，维持此高度的低压低氧环境1小时，缓慢降至正常海拔高度。统计小鼠的死亡率。
结果显示，连续7天灌胃BRP-1芫根多糖能显著增加小鼠在常压耐缺氧试验中的存活时间(表2)和在急性减压缺氧存活试验中的存活率(p<0.05)(表3)，效果远优于重均分子量更大的BRP-2芫根多糖和BRP-3芫根多糖组(表2和表3)。表明芫根多糖中重均分子量相对较小的BRP-1具有最佳的抗缺氧功效。
表2各组小鼠常压耐缺氧的存活时间(Mean±SD)
注：字母不同表示具有显著性差异，p＜0.05。
表3各组小鼠在减压缺氧存活试验中的存活率
(2)BRP-1、BRP-2和BRP-3精制芫根多糖抗辐射功效评价
取健康的ICR雌性小鼠50只，体重18～22g，由浙江中医药大学动物中心提供，试验前适应环境7天。按体重随机分为5组，每组10只，具体分组情况见表4。
根据《功能食品检验与评价技术规范》(2003版)功能学评价检验方法中的“对辐射危害有辅助保护功能检验方法”。以实施例1步骤(5)制得的BRP-1、BRP-2和BRP-3精制芫根多糖(以下分别称BRP-1芫根多糖、BRP-2芫根多糖和BRP-3芫根多糖)分别用蒸馏水充分分散溶解后灌胃给药，同时，正常组和模型组灌胃蒸馏水。灌胃给药3天后，除正常组外，其余组均用60Co-γ射线进行低剂量辐照处理。
辐照处理条件：60Co-γ射线源；辐射距离：80～100cm；辐射率：1.5Gy/min；单次全身性照射总剂量为5Gy。辐照处理后继续灌胃给药14天，禁食禁水8小时后，颈椎脱臼处死小鼠，取股骨统计骨髓细胞中的有核细胞数，取胸骨统计骨髓细胞微核率。
表4实验小鼠分组给药情况
表5各组小鼠骨髓有核细胞计数和微核率的变化(Mean±SD)
注：同一列的不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
结果显示，连续7天灌胃BRP-1芫根多糖能显著增加小鼠股骨中的骨髓有核细胞数，降低胸骨中骨髓细胞的微核率，且效果远优于重均分子量更大的BRP-2芫根多糖和BRP-3芫根多糖组(表5)。表明芫根多糖中重均分子量相对较小的BRP-1具有最佳的抗辐射功效。
(3)芫根多糖、黄芪多糖、枸杞多糖和沙棘黄酮、银杏黄酮组合物功效评价
①抗缺氧功效评价
取健康的雄性ICR小鼠140只，体重18～22g，由浙江中医药大学动物中心提供，试验前适应环境7天。按体重随机分为14组，每组10只。
以实施例1步骤(5)制得的BRP-1精制芫根多糖(以下称芫根多糖)，实施例2步骤(4)制得的精制沙棘黄酮(以下称沙棘黄酮)，实施例3制得的黄芪多糖、枸杞多糖和银杏黄酮，按重量配比制成多糖+黄酮组合物进行试验。
将各样品用蒸馏水充分分散溶解，同时以蒸馏水为空白对照组，灌胃给药7天后，进行常压耐缺氧小鼠试验，具体分组情况见表6。饲喂、给药期间，自由饮水、进食。
表6实验小鼠分组给药情况
常压耐缺氧小鼠试验操作步骤同实施例6第(1)部分的①，缺氧死亡后的小鼠立即解剖，取脑组织，均浆后用南京建成试剂盒测定脑组织抗氧化酶SOD(货号：A001-3)和CAT(货号：A007-1)活力。
结果表明，与空白对照组相比，各黄酮+多糖组合物(除沙棘黄酮+黄芪多糖组合物1)和黄酮、多糖单品均能显著延长小鼠的常压耐缺氧时间(p＜0.05)；且沙棘黄酮+芫根多糖组合物1具有最佳的抗缺氧功效，效果显著高于其它试样组(p＜0.05)，表现出沙棘黄酮和芫根多糖良好的抗缺氧协同增效作用。相反的，沙棘黄酮+黄芪多糖组合物1组的抗缺氧能力显著低于各自的单品试样组(p＜0.05)(表7)，说明沙棘黄酮和黄芪多糖这两种抗缺氧功能成分的组合具有一定的拮抗作用。
研究表明，缺氧和辐射的不良刺激均会使机体产生大量的活性氧自由基(ROS)，而机体清除能力减弱，脂质过氧化反应加重，导致自由基对机体组织细胞的损害加强。同时，ROS的过度累积还会影响低氧反应的核心因子——低氧诱导因子1(HIF-1)的过表达，使机体代谢异常。
因此，抗氧化能力的提升对改善机体的抗缺氧和抗辐射能力具有重要作用。测定小鼠脑组织中的抗氧化酶SOD和CAT活力发现，芫根多糖+沙棘黄酮组合物1(质量比＝70:30)对提高机体的抗氧化能力也具有最佳的协同效果(表8)。
表7各组小鼠常压耐缺氧的存活时间(Mean±SD)
注：同一列的不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
表8各组小鼠脑组织中SOD和CAT酶的活力(Mean±SD)
注：同一列的不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
②抗辐射功效评价
取健康的SD雄性大鼠150只，体重170～210g，由浙江中医药大学动物中心提供，试验前适应环境7天。按体重随机分为15组，每组10只。具体分组情况见表9。
根据《功能食品检验与评价技术规范》(2003版)功能学评价检验方法中的“对辐射危害有辅助保护功能检验方法”。以实施例1步骤(5)制得的BRP-1精制芫根多糖(以下称芫根多糖)，实施例2步骤(4)制得的精制沙棘黄酮(以下称沙棘黄酮)，实施例3制得的黄芪多糖、枸杞多糖和银杏黄酮，按重量配比制成多糖+黄酮组合进行试验。将各样品用蒸馏水充分分散溶解后灌胃给药，同时，正常组和模型组灌胃蒸馏水。具体分组情况见表9。饲喂、给药期间，自由饮水、进食。
试验步骤：各组大鼠正常饲喂5天后，除正常组外，其余组均用60Co-γ射线进行低剂量辐照处理。辐照处理条件：60Co-γ射线源；辐射距离：80～100cm；辐射率：1.5Gy/min；单次全身性照射总剂量为5Gy。
处理结束后各组大鼠开始灌胃相应试样，连续14天。每3天记录一次体重。于辐照处理前、辐照处理后第3天和第14天对大鼠进行尾静脉采血测定外周血白细胞含量，且于第14天将大鼠颈椎脱臼处死，取股骨计数骨髓有核细胞，取肝脏、胸腺和脾脏称重，计算肝脏、胸腺和脾脏的脏器指数。
表9实验大鼠分组给药情况
结果如下：
a.对辐照大鼠白细胞计数的影响
由表10可知，接受5Gy 60Co-γ射线照射后，模型组大鼠的外周血白细胞数较正常组相比均显著减少(p<0.05)，且直至试验结束(辐射后第14天)依然显著低于正常组(p<0.05)。而灌胃3天芫根多糖+沙棘黄酮组合物1便能显著提升大鼠的外周血白细胞数(p<0.05)。
同时，连续灌胃各试样14天后，与空白对照组相比，各组大鼠的外周血白细胞数也显著提高(p<0.05)，且沙棘黄酮+芫根多糖组合物1的效果最佳(p<0.05)，表现出沙棘黄酮和芫根多糖良好的抗辐射协同增效作用。相反的，枸杞多糖+沙棘黄酮组合物2的抗辐射效果最弱，相比于枸杞多糖和沙棘黄酮单品，效果均有一定的降低。
表10各组大鼠白细胞计数的变化(×109/L)(Mean±SD)
注：同一列的不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
b.对辐照大鼠骨髓有核细胞计数的影响
由表11可知，与正常组相比，经5Gy 60Co-γ射线辐照后，大鼠骨髓有核细胞数显著降低(p<0.05)。而连续灌胃14天各多糖、黄酮或其组合物均使大鼠的骨髓有核细胞数较模型组相比有显著回升(p<0.05)，显示出各试样良好的抗辐射效果。同时，在芫根多糖+沙棘黄酮组合物1和2组中观察到大鼠的骨髓有核细胞数显著高于芫根多糖组和沙棘黄酮组(p<0.05)，表现出两种功能组分良好的抗辐射协同增效作用。
表11各组大鼠骨髓有核细胞计数的变化(Mean±SD)
注：同一列的不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05。
c.对辐照大鼠脏器指数的影响
由表12可知，经5Gy 60Co-γ射线辐照后，大鼠肝脏、胸腺和脾脏受到严重损伤，表现在较正常组相比，大鼠肝脏指数、胸腺指数和脾脏指数均显著降低(p<0.05)。而连续灌胃14天各试样均能较大程度地降低大鼠脏器的辐射损伤。同样，在芫根多糖+沙棘黄酮组合物1和2组中也观察到最佳的辐射损伤防护效果。
表12各组大鼠脏器指数的变化(Mean±SD)
| 组别 | 肝脏指数(％) | 胸腺指数(‰) | 脾脏指数(‰) |
| 正常组 | 3.77±0.38<sup>a</sup> | 0.0234±0.0017<sup>a</sup> | 2.41±0.22<sup>a</sup> |
| 模型组 | 3.21±0.34<sup>e</sup> | 0.0187±0.0014<sup>d</sup> | 1.87±0.25<sup>e</sup> |
| 芫根多糖 | 3.52±0.27<sup>a,e</sup> | 0.0214±0.0017<sup>b,c</sup> | 2.19±0.25<sup>b,c,d</sup> |
| 黄芪多糖 | 3.29±0.58<sup>d,e</sup> | 0.0210±0.0016<sup>c</sup> | 2.07±0.22<sup>c,d,e</sup> |
| 枸杞多糖 | 3.50±0.26<sup>a,e</sup> | 0.0207±0.0011<sup>c</sup> | 2.21±0.18<sup>a,d</sup> |
| 沙棘黄酮 | 3.45±0.36<sup>a,e</sup> | 0.0215±0.0019<sup>b,c</sup> | 2.25±0.16<sup>a,d</sup> |
| 银杏黄酮 | 3.43±0.38<sup>b,c,d,e</sup> | 0.0215±0.0016<sup>b,c</sup> | 2.11±0.24<sup>c,d</sup> |
| 芫根多糖+沙棘黄酮组合物1 | 3.72±0.32<sup>a,b</sup> | 0.0229±0.0019<sup>a,b</sup> | 2.33±0.21<sup>a,b</sup> |
| 芫根多糖+沙棘黄酮组合物2 | 3.65±0.27<sup>a,c</sup> | 0.0219±0.0016<sup>a,c</sup> | 2.27±0.19<sup>a,c</sup> |
| 黄芪多糖+沙棘黄酮组合物1 | 3.55±0.44<sup>a,d</sup> | 0.0215±0.0019<sup>b,c</sup> | 2.22±0.25<sup>a,d</sup> |
| 黄芪多糖+沙棘黄酮组合物2 | 3.44±0.33<sup>b,c,d,e</sup> | 0.0217±0.0024<sup>b,c</sup> | 2.20±0.48<sup>a,d</sup> |
| 枸杞多糖+沙棘黄酮组合物1 | 3.31±0.36<sup>d,e</sup> | 0.0211±0.0017<sup>c</sup> | 2.17±0.18<sup>b,c,d</sup> |
| 枸杞多糖+沙棘黄酮组合物2 | 3.35±0.39<sup>c,d,e</sup> | 0.0218±0.0019<sup>b,c</sup> | 2.07±0.27<sup>c,d,e</sup> |
| 芫根多糖+银杏黄酮组合物1 | 3.48±0.36<sup>a,e</sup> | 0.0217±0.0020<sup>b,c</sup> | 2.14±0.18<sup>b,c,d</sup> |
| 芫根多糖+银杏黄酮组合物2 | 3.57±0.34<sup>a,d</sup> | 0.0208±0.0022<sup>c</sup> | 2.21±0.27<sup>a,d</sup> |
综上所述，芫根多糖和沙棘黄酮的组合物能促进受辐照大鼠的外周血白细胞的恢复，增加骨髓细胞增殖能力，提高有核细胞计数，减少骨髓细胞的凋亡和坏死，对机体造血组织和免疫器官均有不同程度的辐射防护作用，且效果优于单一的芫根多糖和沙棘黄酮。
(5)芫根多糖和沙棘黄酮组合物的抗缺氧人群试食试验
为了进一步证实芫根多糖和沙棘黄酮抗缺氧的协同增效作用，本发明采用实施例1中的芫根多糖片剂、实施例2中的沙棘黄酮片剂以及实施例4中的芫根多糖+沙棘黄酮组合物片剂(以下简称组合物)进行人群试食试验，结合低氧耐受试验对各试样的抗缺氧功效进行评价。安慰剂组服用同规格的药用淀粉片剂。
试验分组：招募年龄在20～35岁之间的健康男性受试者40名，按BMI指数随机分成4组，即安慰剂组、芫根多糖组、沙棘黄酮组和组合物组。
试验方案：每天分2次(上午10点和下午4点)按时服用，每次2片。服用周期为7天。分别于服用前及服用7天后进行低氧耐受试验，进行服用前后的自身对照数据分析。
低氧耐受试验：模拟海拔高度为7500米(吸入的氮氧混合气体中O2含量为7.1％)，为保证受试者安全，经预试验确定，测试时间为3分钟。
在服用各试样前后，受试者在低氧耐受试验中血氧饱和度(SpO2)变化如表13所示。以测试末(180秒)为基准，芫根多糖组、沙棘黄酮组和组合物组的SpO2均有了显著的提升(p＜0.05)，分别提升了6.2％、5.4％和8.0％；而空白对照组受试者SpO2变化很小，说明这三种片剂均具有较好的抗缺氧作用，且以组合物的效果最佳，再一次证实，芫根多糖和沙棘黄酮组合具有优良的抗缺氧协同增效作用。
表13服用试样前后受试者在低氧耐受试验中SpO2的变化(Mean±SEM)
注：*表示与服用前比较，具有显著性差异，p＜0.05。
综上所述，重均分子量相对较小的BRP-1是芫根多糖中发挥抗缺氧、抗辐射功效的主要部分。同时，BRP-1芫根多糖与沙棘黄酮组合物较芫根多糖或沙棘黄酮单品相比具有更显著的抗缺氧、抗辐射功效，显示出优良的协同增效作用，这可能与两种功能成分协同增强机体的抗氧化能力有关。
实施例7
取实施例1步骤(4)中制得的芫根多糖和实施例2步骤(3)中制得的沙棘粗黄酮，按芫根多糖和沙棘粗黄酮的质量份数比为：10:90(组合物I)、90:10(组合物II)和65:35(组合物III)；利用实施例6第(1)部分的抗缺氧功效评价方法和第(2)部分的抗辐射功效评价方法进行组合物I、II和III的抗缺氧、抗辐射能力的评价。结果表明，组合物I、II和III均具有抗缺氧和抗辐射功效。其中，以组合物III的抗缺氧和抗辐射的效果最佳，结果见表14-16。
表14各组小鼠常压耐缺氧的存活时间(Mean±SD)
注：字母不同表示具有显著性差异，p＜0.05。
表15各组小鼠在减压缺氧存活试验中的存活率
表16各组小鼠骨髓有核细胞计数和微核率的变化(Mean±SD)
注：字母不同表示具有显著性差异，p＜0.05。
Claims (1)
1.天然药物组合物在制备抗急性高原病药物中的应用，其特征在于，所述天然药物组合物，以重量份数计，由芫根多糖 30~70份，沙棘黄酮30~70份组成；所述沙棘黄酮的总黄酮含量为60~95 wt%； 所述的芫根多糖的提取方法为： 取芫根块茎干粉用蒸馏水直接提取；过滤，滤液浓缩至1/2-1/5； 加入质量分数为70~100%的乙醇沉淀，收集沉淀物，得到芫根粗多糖； 芫根粗多糖经Sevag法去除蛋白杂质，采用透析手段去除小分子杂质，干燥后，得到纯度大于70wt%的芫根多糖； 再采用离子交换柱和葡聚糖凝胶层析纯化，按分子量大小分段收集，干燥后，得到不同分子量段的精制芫根多糖；所述芫根多糖的重均分子量为33.2~52.4 kDa，总多糖含量为90~95 wt%； 所述沙棘黄酮来源于沙棘的成熟果实；所述的沙棘黄酮的提取方法为： 取沙棘果实用质量分数为30-95%的乙醇提取，过滤，滤液浓缩，回收乙醇，浓缩液依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取相，浓缩，回收正丁醇，干燥后，得到沙棘粗黄酮； 沙棘粗黄酮用去离子水溶解，经超滤手段去除分子量大于1000的大分子杂质，干燥后，得到纯度大于24 wt %沙棘黄酮；再用去离子水溶解，依次采用大孔树脂、聚酰胺树脂柱层析纯化，干燥后，得到纯度为60~95 wt %的精制沙棘黄酮； 所述沙棘黄酮中含有异鼠李素、槲皮素和山奈素；以质量分数计，异鼠李素的含量≥15.7 %，槲皮素的含量≥5.4 %，山奈素的含量≥10.3 %。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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