CN109535272A - 一种梨果肉硒多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梨果肉硒多糖的提取方法,该提取方法通过取样品烘干磨粉,然后采用超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法,具体为采用蒸馏水、HCl溶液或碱溶液依次提取后得到不同溶性的梨果肉硒多糖。本申请首次联合超声波辅助提取法,采用一种新型的提取硒多糖方法‑超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法,依次采用蒸馏水、HCl溶液和NaOH溶液在超声波辅助提取下提取水溶性硒多糖、酸溶性硒多糖和碱溶性硒多糖。具有高效提取硒多糖的方法具有广阔的市场推广价值。
Description
技术领域
本发明属于植物生理学领域,具体涉及一种梨果肉硒多糖的提取方法。
背景技术
硒是生物体必须的微量元素,人或动物摄入的硒都直接或间接来自于植物体。硒元素是世界上公认的“抗癌之王”,也是人体不可缺少的微量元素之一。硒元素具有抗氧化、防癌抗癌、解毒排毒、提高机体免疫力等重要功能。由于很多如克山病、动脉粥样硬化、白内障形成等都与活性自由基有关,比如它能与维生素E共同作用,防治氧自由基对细胞膜的攻击性,因此可以补充一定量的硒元素来清除人体内的自由基和胆固醇,预防慢性疾病的发生。目前普遍认为土壤—植物—人体食物链补硒是最有效、最便捷的途径。因此,诸如富硒杂粮、富硒水果等富硒农产品的研发和安全已经成为人们关注的焦点。
硒被植物吸收后,形成非常复杂的化学形态,分为无机硒和有机硒两大类。无机硒较少,包括硒酸、亚硒酸和其他一些无机形态(如Se2-和HSe-),且主要以Se(Ⅳ)形式存在。有机硒占硒总量80%以上,由大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物组成;大分子硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等。多糖具有多种生理活性,是一种广谱的免疫促进剂,具有防癌抗癌、调节免疫功能、延缓衰老、抗感染、抗辐射等生理作用。活性氧自由基对生物分子起损害作用,甚至造成DNA链断裂或变异,硒则对因脂质过氧化产生的自由基具有清除作用。硒多糖兼有多糖和硒两方面的功能,因此表现出更有效的生理活性,,在医药研制和疾病治疗等方面有着广泛的应用前景。
梨的成分有蛋白质、脂肪、糖类和水,其中糖类和蛋白质是梨的两大主要成分。硒多糖作为一种有机硒化合物,兼有多糖与硒二者的活性,是生物体将无机硒转化成有机硒的有效形式之一。研究证明,硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒,更易于机体吸收和利用。硒多糖有抗金属中毒作用;抗氧化作用;对癌细胞病毒的影响:可抑制人胚肺巨细胞病毒,对细胞的辐射遗传损伤具有防护效应。
硒多糖的提取与一般多糖的提取方法相似,通常用水或碱提取,经乙醇沉淀后得到粗硒多糖。关于梨果肉硒多糖对其提取分离工艺的研究较少,尤其是国外学者在此方面的研究还未见报道。因此,研究一种梨果肉里具有高效提取硒多糖的方法具有广阔的市场推广价值。
发明内容
发明目的:为了解决上述技术问题,本发明提供了一种硒多糖的提取方法,采用一种新型的提取硒多糖方法-超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法,依次采用蒸馏水、HCl溶液和NaOH溶液在超声波辅助提取下提取水溶性硒多糖、酸溶性硒多糖和碱溶性硒多糖。其目的比较优化浸提时间,浸提温度,浸提条件对硒多糖的影响,从而在最佳提取条件下对硒多糖进行提取。研究一种具有高效提取硒多糖的方法具有广阔的市场推广价值。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明提供了一种梨果肉硒多糖的提取方法,该提取方法通过取梨果肉样品烘干磨粉,然后采用超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法,具体为采用蒸馏水、HCl溶液和碱溶液依次提取后得到梨果肉硒多糖。
具体的,所述梨果肉硒多糖的提取方法,包括以下步骤:
1)前处理:选取梨果肉作为试验材料,先用自来水洗净,再用蒸馏水反复冲洗,去除果皮和果核,留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用;
2)水提取:称取步骤1)处理后的干粉,加入双蒸水于三口瓶中进入回流装置,达到100℃恒温浸提1h,离心后得到上清液和残渣1,在残渣1中加入纯水,再次沸水浴回流浸提2次得到上清液和残渣2,离心取上清液合并3次所取得的液体,即是水溶性硒多糖提取液1;同时,称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒多糖提取液2和残渣3;干粉与双蒸水的料液比为
3)酸溶性硒多糖的提取:在步骤2)水提取后剩余的残渣2中加入HCl溶液,在超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机离心得到上清液和残渣4,再在离心后的残渣4中加入HCl再次在超声波中重复浸提2次得到上清液和残渣5,上清液合并3次所得提取液,即可得酸溶性硒多糖提取液;
4)碱溶性多糖的提取:在步骤2)水提取后剩余的残渣3中加入NaOH溶液,在超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机离心得到上清液和残渣6,再在离心后的残渣6中加入加入NaOH溶液再次在超声波中重复浸提2次得到上清液和残渣,上清液合并3次所得提取液,即可得碱溶性硒多糖提取液;
5)将步骤2)的水溶性硒多糖提取液1、水溶性硒多糖提取液2、步骤3)的酸溶性硒多糖提取液、步骤4)的碱溶性多糖的提取液通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩,浓缩液液即为梨果肉硒多糖。
其中,所述步骤2)、步骤3)、步骤4)中的离心的转速为4000r·min-1~5000min-1。
其中,所述步骤3)中的HCl溶液的浓度为0.1mol/L~0.15mol/L。
其中,所述步骤4)中的NaOH溶液的浓度为0.1mol/L~0.4mol/L。
所述步骤2)的水提取过程中干粉与双蒸水的料液比为1:8~1:50(w/v)。
本发明的实验原理:本发明是在多糖水提液中加入另一种溶剂(如HCl溶液、NaOH溶液)以改变混合溶剂的极性,使一部分硒多糖粗提物沉淀析出,从而实现分离。在多糖水提液中逐级地加入HCl溶液、NaOH溶液极性比水小的溶剂,使混合溶剂的极性逐级减小,而具有不同结构的多糖具有不同极性,随着混合溶剂极性的降低,不同极性的多糖逐步沉淀析出而达到分离。超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法强化固液提取过程,是颇具发展潜力的一项新型辅助提取技术。由于不同溶剂具有不同的介电常数,所以不同的溶剂对超声波的吸收能力也存在差异。正因为这个特点,超声波可以选择性地对某些组分加热提取,可以有效地将目标产物提取出来,同时尽量避免杂质成分的干扰。
有益效果:本发明提供的一种梨果肉硒多糖的提取方法,采用一种新型的提取硒多糖方法-超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法,采用微波消解结合ICP方法测定硒多糖的含量,本发明能在最佳提取条件下对梨果实果实中的硒多糖进行定量分析。
相比现有技术具备以下优点:
(1)本发明首次实现了硒多糖在梨果实内的提取与定量分析,确立了梨果实硒多糖的最佳提取条件,具有较高的利用价值。
(2)应用本发明的方法,能够准确地知道梨果实内硒多糖的多少,为其他水果果实内硒多糖的测定奠定基础。
(3)本发明多糖提取率在60%以上,且提取的硒多糖杂质少,硒多糖含量占总硒含量的75%~88%,硒多糖的硒含量高达6.5~9mg/kg,均显著高于现有的提取技术。
(4)本发明梨果实选择的原材料是市场上最常见的砀山酥梨,提取的是水果中的硒多糖,经济环保,绿色健康,使用安全,吸收效果好。
(5)本发明的方法简便,不使用酶,提取效率高。采用了一种新型的提取硒多糖方法——超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法,生产工艺简单,节省时间,易于工业推广。
附图说明
图1是本发明的梨果实内硒多糖的提取流程示意框图;
图2是本发明实施例1的最佳原始数据:砀山酥梨成熟期果肉硒多糖分布特点附图。
具体实施方式
下面对本发明作更进一步的说明。
实施例1一种梨果肉硒多糖的提取方法
如图1所示,一种梨果肉硒多糖的提取方法,包括以下步骤:
1)前处理:选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料,先用自来水洗净,再用蒸馏水反复冲洗,去除果皮和果核,留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用;
2)水提取:称取干粉样品5.0g于三口瓶中,加入40ml纯水于三口瓶中进入回流装置,达到100℃恒温浸提1h,加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后拿出取上清液和残渣1,在残渣1中加入40ml纯水,再次沸水浴回流浸提2次得到上清液和残渣2,合并3次所取得的上清液,即是水溶性硒多糖提取液1,同时,称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒多糖提取液2和残渣3;
3)酸溶性硒多糖的提取:在提取水溶性硒多糖后的残渣2中加入40ml的0.1mol/LHCl溶液,在60℃,功率32W的超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后拿出取上清液和残渣4,再在离心后的残渣4中加入10ml0.1mol/L HCl再次在超声波中重复浸提2次得到上清液和残渣5,合并3次所得上清液,即可得酸溶性硒多糖提取液;
4)碱溶性多糖的提取:在提取水溶性硒多糖后的残渣3中加入40ml0.1mol/L的NaOH溶液,在60℃,功率32W的超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后得到上清液和残渣6,再在离心后的残渣6中加入40ml0.1mol/LNaOH再次在超声波中重复浸提2次,合并3次所得上清液,即可得碱溶性硒多糖提取液。
5)分别将所提取到的水溶性硒多糖提取液1、水溶性硒多糖提取液2、酸溶性硒多糖提取液和碱溶性硒多糖提取液通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩至4ml,(不足的均用相对应的溶剂定容)。
浓缩液微波消解后采用ICP-MS测定样品中的硒含量。具体测定步骤如下:4ml浓缩液中取2ml样品加入消煮管,依次在消煮管中加入硝酸5mL并在记录本上标记好,将消煮液加入对应的50mL容量瓶中(为防止倒出,先在容量瓶上加一个玻璃漏斗),并用去离子水冲洗消煮管3遍,最后统一定容。用0.45μm水系滤膜,5mL注射器,过滤,滤液备用将定容好的溶液,取大约10mL,转移至10mL离心管中,待测。采用ICP-MS测定样品中的硒含量,以硒标准液浓度(ppb)为横坐标,进样强度为纵坐标,得标准曲线方y=58.471x-29.006(R2=1.000)(x:硒标准液浓度(ppb),y:进样强度),Se含量(μg·100g-1)=(100CSe·V)/W其中,CSe:样品消化定容后溶液Se的浓度,μg·L-1;V:样品消化后定容体积,L;W:样品的取样量,g。仪器经过进样强度值计算得到硒浓度,再依据硒含量公式依次测得硒多糖提取液中硒的含量,在测定的硒多糖组分中,硒多糖中硒的含量为0.356mg·kg-1,水溶性硒多糖硒的含量最多为0.128mg·kg-1占硒多糖的36%,酸溶性硒多糖硒的含量最多为0.85mg·kg-1占硒多糖的24%,碱溶性硒多糖硒的含量最多为0.99mg·kg-1占硒多糖的28%。在此实施例中,硒多糖含量采用蒽酮比色法测得达总体积的49%,杂质含量12%,硒多糖提取率达88%。
实施例2一种梨果肉硒多糖的提取方法
1)前处理:选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料,先用自来水洗净,再用蒸馏水反复冲洗,去除果皮和果核,留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用;
2)水提取:取干粉样品5.0g于三口瓶中,加入60ml纯水于三口瓶中进入回流装置,达到100℃恒温浸提1h,加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后拿出取上清液和残渣1,再在离心后的残渣1中分别加入60ml水,再次沸水浴回流浸提2次得到上清液和残渣2,合并3次所取得的上清液,即是水溶性硒多糖提取液1,同时,称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒多糖提取液2和残渣3;
3)在提取水溶性硒多糖后的残渣2中先后加入60ml的0.1mol/L HCl溶液,在60℃,功率32W的超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后拿出取上清液,再在离心后的残渣中加入60ml0.1mol/L HCl再次在超声波中重复浸提2次,上清液合并3次所得提取液,即可得酸溶性硒多糖提取液。
4)在提取水溶性硒多糖后的残渣3中先后加入60ml0.1mol/L的NaOH溶液提取,在60℃,功率32W的超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机5000r/min离心,离心15min后拿出取上清液,再在离心后的残渣中加入60ml0.1mol/L NaOH溶液再次在超声波中重复浸提2次,上清液合并3次所得提取液,即可得碱溶性硒多糖提取液。
5)分别将所提取到的水溶性硒多糖提取液1、水溶性硒多糖提取液2、酸溶性硒多糖提取液和碱溶性硒多糖提取液通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩至5ml,(不足的均用相对应的溶剂定容)。
浓缩液微波消解后采用ICP-MS测定样品中的硒含量。具体测定步骤如下:5ml浓缩液中取2ml样品加入消煮管,依次在消煮管中加入硝酸5mL并在记录本上标记好,将消煮液加入对应的50mL容量瓶中(为防止倒出,先在容量瓶上加一个玻璃漏斗),并用去离子水冲洗消煮管3遍,最后统一定容。用0.45μm水系滤膜,5mL注射器,过滤,滤液备用将定容好的溶液,取大约10mL,转移至10mL离心管中,待测。采用ICP-MS测定样品中的硒含量,以硒标准液浓度(ppb)为横坐标,进样强度为纵坐标,得标准曲线方y=58.471x-29.006(R2=1.000)(x:硒标准液浓度(ppb),y:进样强度),Se含量(μg·100g-1)=(100CSe·V)/W其中,CSe:样品消化定容后溶液Se的浓度,μg·L-1;V:样品消化后定容体积,L;W:样品的取样量,g。仪器经过进样强度值计算得到硒浓度,再依据硒含量公式依次测得硒多糖提取液中硒的含量,在测定的硒多糖组分中,硒多糖中硒的含量为0.356mg·kg-1,水溶性硒多糖硒的含量最多为0.121mg·kg-1占硒多糖的34%,酸溶性硒多糖硒的含量最多为0.64mg·kg-1占硒多糖的18%,碱溶性硒多糖硒的含量最多为0.114mg·kg-1占硒多糖的32%。在此实施例中,硒多糖含量采用蒽酮比色法测得达总体积的45%,杂质含量16%,硒多糖提取率达84%。
实施例3一种梨果肉硒多糖的提取方法
1)前处理:选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料,先用自来水洗净,再用蒸馏水反复冲洗,去除果皮和果核,留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用;
2)水提取:取取干粉样品5.0g于三口瓶中,加入40ml纯水于三口瓶中进入回流装置,达到100℃恒温浸提1h,加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后拿出取上清液和残渣1,再在离心后的残渣1中分别加入40ml水,再次沸水浴回流浸提2次得到上清液和残渣2,合并3次所取得的上清液,即是水溶性硒多糖提取液1,同时,称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒多糖提取液2和残渣3;
3)在提取水溶性硒多糖后的残渣2中先后加入40ml的0.15mol/L HCl溶液,在60℃,功率32W的超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后拿出取上清液,再在离心后的残渣中加入40ml0.1mol/L HCl再次在超声波中重复浸提2次,上清液合并3次所得提取液,即可得酸溶性硒多糖提取液。
4)在提取水溶性硒多糖后的残渣3中先后加入40ml0.4mol/L的NaOH溶液提取,在60℃,功率32W的超声波中浸提1h后取加入离心管在离心机4000r/min离心,离心15min后拿出取上清液,再在离心后的残渣中加入40ml0.4mol/L NaOH溶液再次在超声波中重复浸提2次,上清液合并3次所得提取液,即可得碱溶性硒多糖提取液。
5)分别将所提取到的水溶性硒多糖提取液、酸溶性硒多糖提取液和碱溶性硒多糖提取液通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩至5ml,(不足的均用相对应的溶剂定容)。
浓缩液微波消解后采用ICP-MS测定样品中的硒含量。具体测定步骤如下:5ml浓缩液中取2ml样品加入消煮管,依次在消煮管中加入硝酸5mL并在记录本上标记好,将消煮液加入对应的50mL容量瓶中(为防止倒出,先在容量瓶上加一个玻璃漏斗),并用去离子水冲洗消煮管3遍,最后统一定容。用0.45μm水系滤膜,5mL注射器,过滤,滤液备用将定容好的溶液,取大约10mL,转移至10mL离心管中,待测。采用ICP-MS测定样品中的硒含量,以硒标准液浓度(ppb)为横坐标,进样强度为纵坐标,得标准曲线方y=58.471x-29.006(R2=1.000)(x:硒标准液浓度(ppb),y:进样强度),Se含量(μg·100g-1)=(100CSe·V)/W其中,CSe:样品消化定容后溶液Se的浓度,μg·L-1;V:样品消化后定容体积,L;W:样品的取样量,g。仪器经过进样强度值计算得到硒浓度,再依据硒含量公式依次测得硒多糖提取液中硒的含量,在测定的硒多糖组分中,硒多糖中硒的含量为0.356mg·kg-1,水溶性硒多糖硒的含量最多为0.128mg·kg-1占硒多糖的36%,酸溶性硒多糖硒的含量最多为0.60mg·kg-1占硒多糖的17%,碱溶性硒多糖硒的含量最多为0.99mg·kg-1占硒多糖的32%。在此实施例中,硒多糖含量采用蒽酮比色法测得达总体积的43%,杂质含量15%,硒多糖提取率达85%。
表1
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种梨果肉硒多糖的提取方法,其特征在于,该提取方法通过取梨果肉样品烘干磨粉,然后采用超声波辅助结合溶剂连续浸提硒多糖法,具体步骤为采用蒸馏水、HCl溶液和碱溶液依次提取后得到梨果肉硒多糖。
2.根据权利要求1所述的一种梨果肉硒多糖的提取方法,其特征在于,包括以下
步骤:
1)前处理:选取试验材料,先用自来水洗净,再用蒸馏水反复冲洗,切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用;
2)水提取:称取步骤1)处理后的干粉,加入双蒸水于三口瓶中进入回流装置,达到100℃恒温浸提1h,离心后得到上清液和残渣1,在残渣1中加入纯水,再次沸水浴回流浸提2次得到上清液和残渣2,离心取上清液合并3次所取得的液体,即是水溶性硒多糖提取液1;同时,称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒多糖提取液2和残渣3;
3)酸溶性硒多糖的提取:在步骤2)水提取后剩余的残渣2中加入HCl溶液,在超声波中浸提1h后加入离心管在离心机离心得到上清液和残渣4,再在离心后的残渣4中加入HCl溶液再次在超声波中重复浸提2次得到上清液和残渣5,离心取上清液合并3次所得提取液,即可得酸溶性硒多糖提取液;
4)碱溶性多糖的提取:在步骤2)水提取后剩余的残渣3中加入NaOH溶液,在超声波中浸提1h后加入离心管在离心机离心得到上清液和残渣6,再在离心后的残渣6中加入NaOH溶液再次在超声波中重复浸提2次得到上清液和残渣,上清液合并3次所得提取液,即可得碱溶性硒多糖提取液;
5)将步骤2)的水溶性硒多糖提取液1、水溶性硒多糖提取液2、步骤3)的酸溶性硒多糖提取液、步骤4)的碱溶性多糖的提取液通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩,最后定容,浓缩液即为梨果肉硒多糖。
3.根据权利要求2所述的硒多糖的提取方法,其特征在于,所述步骤2)、步骤3)、步骤4)中的离心的转速为4000r·min-1~5000min-1。
4.根据权利要求2所述的硒多糖的提取方法,其特征在于,所述步骤3)中的HCl溶液的浓度为0.1mol/L~0.15mol/L。
5.根据权利要求2所述的硒多糖的提取方法,其特征在于,所述步骤4)中的NaOH溶液的浓度为0.1mol/ L~0.4mol/L。
6.根据权利要求1所述的硒多糖的提取方法,其特征在于,所述步骤2)的水提取过程中干粉与双蒸水的料液比为1:8~1:50。
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