CN102895321A - 具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，属于中药、食品技术领域其制备方法是：a、将车前草粉碎成粗粉，用乙醇溶液回流提取，回流提取时间为0.5-2h，提取后回收乙醇，加水制成提取溶液，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液；b、车前草多酚提取溶液上到D101大孔树脂柱上，吸附时间1-3h，洗脱溶剂10-90%乙醇溶液，洗脱速度2-6BV/h；乙醇洗脱得到车前草多酚洗脱液，回收乙醇，冻干，得到车前草多酚。有益效果是：大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、再生处理方便、使用期长、节省费用等，适合于工业生产。制备得到车前草多酚具有清除自由基、抗氧化的功能。在食品、医药、化妆品及功能食品方面具有很大开发潜力。

Description

具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法

技术领域

本发明属于中药、食品技术领域。

背景技术

植物多酚是广泛分布于植物之中的一类复杂化合物，现代研究表明，很多疾病如组织器官老化等都与体内过剩的自由基有关，多酚通过清除自由基能对自由基诱发的生物大分子损伤起保护作用，因此，多酚类化合物在抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抑制高血压、降血脂等很多方面具有良好的生理活性。

车前草是车前科植物车前（Plantago asiatica L.）的干燥全草，是一味传统中药，也是卫生部规定可以用于保健食品的植物之一，具有清热利尿、渗湿通淋、明目、祛痰之功效，还具有保肝、降压、抑菌、降低血清胆固醇等多种药理作用。具有很好的医疗保健价值。

近年来，国内外对多酚的应用研究在逐渐增多，枇杷多酚（申请号/专利号：201010538005）、苹果多酚（申请号/专利号： 201010171146）、茶多酚（申请号/专利号： 200810181108）等已申请专利。而对车前草多酚的研究较少。

发明内容

本发明的目的是：提供一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，它是从车前草植物中提取、纯化车前草多酚的方法。

本发明的制备方法是：

1、车前草多酚的提取，将车前草粉碎成20目-40目的粗粉，用乙醇溶液回流提取，车前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比为6-10倍，乙醇溶液浓度60-80%，回流提取时间为0.5-2h，提取后回收乙醇，加水制成0.5g车前草/mL的提取溶液， 5000rpm/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液。

2、车前草多酚的纯化，车前草多酚提取溶液上到D101大孔树脂柱（上样量20-30mL/g树脂）上，上样速度2-4BV/h，吸附时间1-3h，洗脱溶剂10-90%乙醇溶液，洗脱速度2-6BV/h。经吸附，乙醇洗脱得到车前草多酚洗脱液，回收乙醇，冻干，得到车前草多酚。

车前草多酚的提取过程中，车前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比优选为8倍；乙醇溶液浓度优选为70%；回流提取时间为1h。

车前草多酚的纯化过程中，车前草多酚提取液上样速度优选为3BV/h；吸附时间优选为2 h；洗脱溶剂乙醇溶液，优选为30%；洗脱速度优选为4BV/h。

本发明的有益效果是：利用车前草为原料经乙醇溶液提取，采用大孔吸附树脂进行富集纯化，制备得到车前草多酚。大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、再生处理方便、使用期长、节省费用等诸多优点。适合于工业生产。制备得到车前草多酚具有清除自由基、抗氧化的功能。在食品、医药、化妆品及功能食品方面具有很大开发潜力。

附图说明

图1是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织MDA水平的影响；

图2是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织GSH-Px活力的影响；

图3是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织T-AOC活性的影响；

图4是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织SOD活性的影响；

图5是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠脑组织MAO活力的影响。

具体实施方式

实施例1

（1）车前草多酚的提取

车前草粗粉100g，加入800mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，加水制成200mL的提取液， 5000rpm/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液。

（2）车前草多酚的纯化

车前草多酚提取液以3BV/h的速度上到D101大孔树脂柱上（上样量20-30mL/g树脂），吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草多酚3.8g。

实施例2

（1）车前草多酚提取

车前草粗粉200g，加入1600 mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，加水制成400mL的提取液， 5000rpm/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液。

（2）车前草多酚的纯化

车前草多酚提取液以3BV/h 的速度上到D101大孔树脂柱上（上样量20-30mL/g树脂），吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草总多酚8g。

实施例3

（1）车前草多酚提取

车前草粗粉300g，加入2400 mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，加水制成600mL的提取液， 5000rpm/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液。

（2）车前草多酚的纯化

车前草多酚提取液以3BV/h 的速度上到D101大孔树脂柱上（上样量20-30mL/g树脂），吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草多酚10g。

实施例4

（1）车前草多酚提取

车前草粗粉500g，加入4000 mL的80%乙醇溶液回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，加水制成1000mL的提取液， 5000r/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液。

（2）车前草多酚的纯化

车前草多酚提取液以3BV/h 的速度上到D101大孔树脂柱上（上样量20-30mL/g树脂），吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草多酚17.2g。

试验例1 车前草多酚的体外抗氧化试验

（1）清除DPPH自由基能力的测定（DPPH法）

    方法：在试管中加入1.95mL质量浓度为24mg/L的DPPH乙醇溶液和0.05mL 95%的乙醇溶液，混匀后，用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值（A）,记为A₀。另取试管分别加入1.95mL质量浓度为24mg/L的DPPH乙醇溶液和0.05mL不同浓度的提取物溶液，混匀后，记录加入提取物溶液后不同时间的吸光度值直到吸光度稳定。用稳定后的吸光值At计算提取物对DPPH自由基的清除能力SR%，绘制清除率曲线，计算IC₅₀。

SR%=[(A₀-At)/ A₀]×100%

式中：A₀—DPPH乙醇溶液的吸光值。

　　　     At—加入提取物溶液后的DPPH乙醇溶液的最终吸光度值。

IC₅₀=0.2848 mg/mL。此结果可以看出车前草多酚对DPPH自由基有一定的清除作用。

（2）OH·自由基能力的测定

方法：取7支具塞试管，分别加入0.75mmoL﹒L^-1邻二氮菲溶液1mL、PH=7.4的PBS缓冲溶液3.8mL，充分混匀后再加入0.75 mmoL﹒L^-1FeSO₄溶液1.5mL，立即混匀。然后向其中5支试管分别加入一定量的车前草多酚溶液（每管加的体积不同），混再分别加入0.01%的H₂O₂溶液1mL，混匀，另取2支分别为损伤和未损伤管，不加车前草多酚溶液，在损伤管中加入0.01% H₂O₂溶液1mL，未损伤管不加H₂O₂，最后用蒸馏水补至相同体积10mL,7支试管于37°保温1h，测A₅₃₆，计算OH·清除率，绘制清除率曲线。

                OH·清除率=(A₂-A₁)/(A₀-A₁)

式中：A₀—未损伤管的吸光度； A₁—损伤管的吸光度；A₂—加车前草多酚溶液的吸光度。

IC₅₀=0.2469 mg/mL，车前草总多酚对H₂O₂/Fe²⁺体系通过Fenton反应所产生的OH·具有清除作用。

(3)光化学发光法（PCL）

PCL法分析原理是由光化学法生成自由基,并利用化学发光法检测自由基，抗氧化活性是用相当于抗坏血酸的纳摩尔数来计算。

方法：配制混合液为1. 0 mL反应缓冲液,包括0.1 moL/L Sodium Carbonate和0.1mmoL/LNa₂-EDTA; 1.5 mLACW-diLuent(water); 1 mmoL/L Lu-minoL(25μL),作为光敏剂激发反应分子,使其迅速产生自由基,同时又作为光致化学发光物质。样品和标准品均为10μL。每个样品平行测试2次。不同物质的量(0, 0. 5, 1, 2和3 nmoL)的抗坏血酸)得到标准曲线，结果表明，车前草多酚清除作用相当于抗坏血酸2.122575 nmoL/mg。

 

试验例2车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤模型小鼠的保护作用

1、动物分组及模型建立

试验前小鼠自由摄食饮水，适应性饲养一周后，随机分为6组，每组10只，如表1 所示。D-半乳糖亚急性氧化损伤模型小鼠的给药方式采用颈背部皮下注射。除正常对照组每日颈背部皮下注射生理盐水外，各实验组每日皮下注射5%（w/v）的D-半乳糖500mg/kg/d，建立模型，连续6周。造模同时，正常对照组和衰老模型组小鼠灌胃生理盐水；阳性对照组小鼠灌胃5mg/mL维生素E；高剂量、中和低剂量组分别灌胃车前草多酚100、50和25mg/kg/d。

2组织样品的制备

第六周末次灌胃和注射D-半乳糖24h后，乙醚麻醉动物，摘除眼球取血，37℃放置1h，4℃放置3h，离心（4000r/min，10min，4℃）分离血清后-20℃保存备用。采血后颈椎脱臼处死动物，摘取脑、肝、肾、脾和心脏，称重，与动物终体重的比值即为脏器指数。肝和脑分别制成10%（w/v）的组织匀浆，离心（4000r/min，10min）取上清液，-20℃保存。蛋白采用Lowry 的方法测定。

3生化指标测定

肝组织的MDA含量、GSH-Px活性和T-AOC活性，血清的SOD活性，及脑组织的MAO活力采用比色法测定，按试剂盒说明书操作：MDA测定采用硫代巴比妥酸法；GSH-Px）测定根据GSH-Px可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽（GSH）反应，生成氧化型谷胱甘肽，通过在412nm处测定还原型谷胱甘肽消耗量，计算酶活；T-AOC活性根据机体中抗氧化物质能使Fe³⁺ 还原成Fe²⁺，后者与菲林类物质形成有色络合物，在520nm处测定吸光度值；SOD活力分析采用黄嘌呤氧化酶法；MAO测定以苄胺为底物，在MAO作用下，生成苄醛，在242nm下测定吸光度，计算酶活。

4统计分析

采用SPSS12.0 软件完成统计处理。计量资料以x±s表示；计量资料组间差异比较采用t检验。差异显著水平为P＜0.05，极显著水平为P＜0.01。

（1）车前草多酚对小鼠肝组织MDA水平的影响

如图1所示，D-半乳糖诱导氧化损伤模型组小鼠肝组织中MDA浓度显著高于正常对照组。与氧化损伤模型组比较，车前草多酚各剂量组，特别是高剂量组小鼠肝组织MDA浓度显著降低（P＜0.05）。而车前草多酚降低小鼠肝组织MDA水平与阳性对照组（维生素E）相当，与正常对照组比较，差异不显著（P＞0.05），说明车前草多酚对恢复D-半乳糖诱导衰老模型小鼠肝组织MDA水平具有一定的作用。

（2）车前草多酚对小鼠肝组织GSH-Px活性的影响

GSH-Px是机体内一种重要的催化过氧化氢分解的酶, 其特异的催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应, 可以保护细胞膜结构和功能完整的作用^[12]。衰老模型组小鼠血清GSH-Px活性显著低于对照组，三个车前草多酚处理组小鼠血清GSH-Px活性均明显高于模型组。与模型组比较，车前草多酚能显著提高小鼠肝组织GSH-Px活性（P＜0.05）（图 2）。说明车前草多酚对提高D-半乳糖诱导衰老小鼠肝组织GSH-Px 活性具有良好的效果。但与正常对照组比较，差异不显著（P＞0.05）。

（3）车前草多酚对小鼠肝组织T-AOC能力的影响

总抗氧化能力（T-AOC）能有效反应机体非酶抗氧化系统的作用。从图3中可知，衰老模型组肝组织总抗氧化（T-AOC）能力最低，与正常对照组相比差异达极显著水平（P＜0.01），说明D-半乳糖小鼠衰老模型造模成功；车前草多酚处理高、中和低剂量组及阳性对照组肝组织T-AOC活性高于模型组，但低于正常对照组。

（4）车前草多酚对小鼠血清SOD活性的影响

车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤模型小鼠血清SOD活力分析结果如图4所示，车前草多酚处理高剂量组SOD活力明显高于模型组（P＜0.05），但低剂量组与模型组差异不显著，说明车前草多酚能提高D-半乳糖诱导衰老小鼠血清SOD活力，且呈剂量依赖关系。车前草多酚处理高剂量组与阳性对照组SOD活力相当，与正常对照组差异不显著（P＞0.05）。

（5）车前草多酚对小鼠脑组织MAO活性

脑组织单胺氧化酶（MAO）活性结果如图5所示，阳性对照组及低、中和高剂量组脑组织MAO活力降低，但与衰老组相比差异未达到显著水平（P＞0.05）；氧化损伤模型组脑组织MAO活力显著高于正常对照组，差异达到显著性水平（P＜0.05）；正常对照组、阳性对照组及车前草多酚各剂量组间脑组织MAO活力差异不显著（P＞0.05）。

Claims (2)

1.一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，其制备方法是：

a、车前草多酚的提取，将车前草粉碎成20目-40目的粗粉，用乙醇溶液回流提取，车前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比为6-10倍，乙醇溶液浓度60-80%，回流提取时间为0.5-2h，提取后回收乙醇，加水制成0.5g车前草/mL的提取溶液， 5000rpm/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液；

b、车前草多酚的纯化，车前草多酚提取溶液上到D101大孔树脂柱上，上样速度2-4BV/h，吸附时间1-3h，洗脱溶剂10-90%乙醇溶液，洗脱速度2-6BV/h；经吸附，乙醇洗脱得到车前草多酚洗脱液，回收乙醇，冻干，得到车前草多酚。

2.如权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，其制备方法是：

车前草多酚的提取过程中，车前草回流提取所用的乙醇溶液量优选为8倍；乙醇溶液浓度优选为70%；回流提取时间为1h；

车前草多酚的纯化过程中，车前草多酚提取液上样速度优选为3BV/h；吸附时间优选为2 h；洗脱溶剂乙醇溶液，优选为30%；洗脱速度优选为4BV/h。

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