CN102875625B - 一种具有抗过敏活性的大枣中环磷酸腺苷的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种从大枣中提取具有抗过敏活性的环磷酸腺苷(cAMP)的工艺方法。将大枣经过预处理后,利用乙醇进行闪式提取(乙醇浓度40%-70%、料液比1∶20~30、提取时间20~40s)、提取液在装有大孔吸附树脂的树脂柱中进行吸附(HPD-400型树脂、pH=4.0~5.5、吸附及洗脱流速为2~4BV/H、乙醇浓度40~70%)、经过乙醇梯度洗脱解吸,解吸液浓缩、干燥后得到含cAMP的大枣提取物产品,对提取物进行Elson-Morgan法抗过敏检测,得到抑制率为76.2%。本发明具有工艺简单、提取率高、成本低、原料丰富、提取测试周期短等特点。

Description

一种具有抗过敏活性的大枣中环磷酸腺苷的提取方法
技术领域
本发明涉及一种从大枣中提取具有抗过敏活性环磷酸腺苷的方法
背景技术
枣树是我国特有的一种果树,我国的枣树栽培面积占全世界栽培总栽培面积的95%以上。大枣是一种常用中药,大枣中环磷酸腺苷(cAMP)含量为100~600nmol/g,在180多种天然植物中含量最高。“环磷酸腺苷”(简称cAMP)具有扩张血管和抗过敏作用,过敏性患者大多是由于人体细胞内cAMP浓度下降,环磷酸鸟苷(cGMP)浓度增高,cAMP和cGMP比值偏低所致。cAMP和cGMP是存在于机体的一对重要的环核苷酸酶,广泛存在于一切细胞中,在生命活动以及疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。大枣内含有丰富的cAMP和cGMP活性物质,当cAMP活性物质被消化道吸收,分布到末梢组织,这些组织内cAMP与cGMP的比值将呈显著持续的增高,使得免疫细胞中的环磷酸腺苷的量增加,进而可以对抑制过敏免疫反应有良好的效果。环磷酸腺苷可以通过化学合成、生物发酵、天然产物分离提取等方法获得,但是化学合成所用溶剂有一定的毒性,易污染环境,生物发酵菌种限制且难以分离,而植物尤其是大枣中cAMP含量是目前所知中最高的,如何从天然产物中较简便的分离出cAMP,是当前研究所要解决的主要问题。
目前关于天然来源cAMP提取物的发明专利国内外都比较少,国内的刘孟军、王永惠等以及国外的Truelsen TA等测定了多种植物中的cAMP的含量,其中大枣以38nmol/g居首位。目前国内关于大枣中cAMP的提取方法比较常用的有Hanabusa K等利用溶剂浸提的方法从大枣中提取cAMP,李明润等通过三次阴离子交换柱层析和一次氧化铝层析提取cAMP。但是提取工艺繁琐、提取成本较高、提取效率低且提取过程中糖分没有被完全提取出来。因此,从提高提取效率、降低工艺成本、加强综合利用等方面来看,现有的生产工艺都需要大力提高。这对环磷酸腺苷的工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是充分利用我国丰富的大枣资源,深层挖掘大枣以及枣中cAMP抗过敏的保健价值,具有工艺简单、提取率高、成本低、原料丰富等特点。
为实现上述目的,本发明由以下步骤组成:
1)将筛选后的大枣原料进行去皮、去核、洗涤、粉碎等预处理,利用乙醇进行闪式提取。提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清透明枣汁。
2)将澄清提取液通过装有大孔树脂的树脂柱进行吸附,根据饱和吸附试验的结果确定采用HPD-400型树脂。在一定pH值下通过适宜浓度的乙醇洗脱液进行梯度洗脱,收集洗脱液。
3)将洗脱液收集,经过真空浓缩,浓缩至原体积的1/3,加入无水乙醇,静置、过滤并通过真空冷冻干燥得到大枣cAMP提取物粉末。将得到的大枣cAMP提取物进行Elson-Morgan法抗过敏检测,得到其抗过敏抑制率。
步骤1)所述的乙醇水溶液的浓度为40%~70%。
步骤1)所述的料液比为1∶20~30。
步骤1)所述的提取时间为20~40s。
步骤2)所述的pH值为4.0~5.5。
步骤2)所述的洗脱流速为2~4BV/H。
步骤2)所述的洗脱乙醇浓度为40~70%。
步骤3)Elson-Morgan法抗过敏检测透明质酸酶活性为500-800U/mL。
一般植物提取过敏抑制率达到50%即认为有抗过敏效果,而本产品抑制率达到76.2%。
附图说明
下面对附图进行简要说明。
图1是大枣环磷酸腺苷通过闪式提取、纯化并进行抗过敏活性检测的工艺流程图。
图2是样品浓度在0~30mg/mL范围内的环磷酸腺苷抗过敏活性检测抑制率图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述,但并不限制本发明的范围。
实施例1:
取100g大枣进行去皮、去核、洗涤等预处理后,加入60%的乙醇溶液放入闪式提取器进行闪式提取,提取时间为40s,料液比为1∶20。提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清枣汁。在内径为1.5cm的交换柱内装入大孔吸附树脂HPD-400,大枣闪提液上柱后除杂(去离子水),pH=4.5,吸附以及洗脱流速为4BV/H,选择40~70%乙醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱,收集洗脱液。洗脱液经过浓缩、真空冷冻干燥后测定cAMP的提取率为135.24ug/g。
实施例2:
称取500g大枣经过进行去皮、去核、洗涤等预处理后加入60%的乙醇溶液放入闪式提取器进行闪式提取,提取时间为40s,料液比为1∶20。提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清枣汁。在内径为5cm的交换柱内装大孔吸附树脂HPD-400型500mL,大枣闪提液5000mL上柱后除杂(去离子水),pH=4.0,吸附及洗脱流速为4BV/H,选择40~70%乙醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱,收集洗脱液。洗脱液经过浓缩、真空冷冻干燥后测定cAMP的提取率为121.43ug/g。
实施例3:
对实施例1中的cAMP提取物通过Elson-Morgan法进行抗过敏检测,将提取物加入2.5mol/L的氯化钙溶液中,加入500U/mL的透明质酸酶0.5mL,加入pH=5.6的醋酸缓冲液0.5mL,在37℃下保温20min,加入1.6mg/L的透明质酸钾0.6mL,并在37℃下保温40min,室温下放置10min并加入NaOH溶液以及1mL乙酰丙酮,经过沸水浴15min、冰水浴5min、放置室温10min后,加入1mLP-DAB显色剂,室温放置30min后测量其在585nm处的吸光值,通过以下抑制率公式进行计算:
[A:溶液(透明质酸酶+样品+透明质酸酶钾)的吸光度值;B:溶液(醋酸缓冲液+样品+醋酸缓冲液)的吸光度值;C:溶液(透明质酸酶+蒸馏水+透明质酸酶钾)的吸光度值;D:溶液(醋酸缓冲液+蒸馏水+醋酸缓冲液)的吸光度值。]
得到抑制率最大值为76.2%。

Claims (1)

1.一种从大枣中提取具有抗过敏活性环磷酸腺苷的工艺方法,其特征在于包括下述步骤:
1)将筛选后的大枣原料进行包括去皮、去核和洗涤的预处理,利用乙醇溶液在闪式提取器进行闪式提取,得到提取液,其中乙醇溶液浓度为40~60%,乙醇料液比为1∶20~30,提取时间为20~40s;
2)提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清透明枣汁;
3)将澄清提取液在装有HPD-400型大孔树脂的树脂柱中进行吸附,pH=4.0~5.5,吸附及洗脱流速为2~4BV/H,选择浓度为40~70%的乙醇溶液为适宜的洗脱液进行梯度洗脱,收集洗脱液;
4)上述步骤中得到的解吸液经浓缩、干燥后得到环磷酸腺苷大枣提取物产品,干燥后环磷酸腺苷的提取率为120~135μg/g,
其中,对环磷酸腺苷大枣提取物产品进行Elson-Morgan法进行抗敏活性检测,并通过抑制率公式得到其过敏抑制率最大为76.2%。
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