CN102964466A - 具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖及其制备方法，该多糖是由摩尔比为1:0.91:2.14:1.0的β-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-半乳糖和α-L-吡喃岩藻糖构成，分子量为8867。该多糖的基本单元的结构式为α-D-吡喃半乳糖（1→6），和α-D-吡喃甘露糖（2→6）为主链及甘露糖C-3分支连接α-L-吡喃岩藻糖（1→3）连接β-D-吡喃葡萄糖（→1）。本发明通过大量实验优选提取分离工艺，首先采用水提醇沉法得到粗多糖，再脱蛋白，然后DEAE-52纤维素树脂和SephadexG-100凝胶树脂联用进行纯化，制得纯度高的黄蜀葵花多糖，经过抗肿瘤实验结果表明，本发明提供的黄蜀葵花多糖具有很好的抗肿瘤活性，并且长期使用无不良反应，可以方便和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，临床上服用方便。

Description

具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖及其制备方法与应用。

背景技术

黄蜀葵花为锦葵科黄蜀葵(Abelmoschus manihot L.Medicus)的干燥花冠，具有清热解毒、化瘀、消炎镇痛等功效，主治诸恶疮、水肿、小便淋痛、烫火伤、腮腺炎等疑难杂症。目前，对黄蜀葵花的相关研究主要集中在黄酮类化合物的药学及药效学研究；然而黄蜀葵花中另一类重要的化学成分多糖类物质的研究相对滞后。目前尚未见系统地完成黄蜀葵花多糖类物质制备、结构鉴定及药理活性分析的报道。大量研究资料表明，天然多糖具有很好的抗肿瘤生物活性，因此非常有必要系统地完成黄蜀葵花多糖类物质制备、结构鉴定及药理活性分析，开发出一种具有抗肿瘤活性且不良反应低的黄蜀葵花多糖。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种结构新颖，抗肿瘤活性强，不良反应低的黄蜀葵花多糖，本发明另一个目的是提供该黄蜀葵花多糖的制备方法和其应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

一种具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖，该多糖由摩尔比为1:0.91:2.14:1.0的β-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-半乳糖和α-L-吡喃岩藻糖构成，该多糖的基本单元的结构式

该多糖的分子量为8867。

本发明提供的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)脱脂处理

称取黄蜀葵花药材，用总药材总量8~16倍的无水乙醇，在50~70℃水浴温浸泡6~12小时，趁热抽滤，得药渣挥尽乙醇后60~70℃干燥，得脱脂黄蜀葵花药材；

(2)粗多糖的提取

取步骤(1)脱脂后的黄蜀葵花药材，加入药材总重量8~12倍量的水，在60~70℃温度下浸渍提取1~3次，每次6~8h，滤过，合并滤液，在2000~3000rpm离心10~20min，得上清液在65~70℃下减压浓缩至原体积的1/10，然后加浓度为95%乙醇使乙醇的浓度达70%，然后再4℃静置24h后滤取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，减压干燥，得黄蜀葵花粗多糖；

(3)粗多糖脱蛋白质

取步骤(2)制备得到的黄蜀葵花粗多糖，完全溶解于蒸馏水中，然后加入浓度30%的三氯乙酸溶液至三氯乙酸终浓度为3%，在4℃静置5~8h，然后3000~3500rpm离心10~15min，除去沉淀，得上清液用NaOH溶液调pH至中性，减压浓缩，浓缩液透析，截取分子量8000Da以上成分，得除蛋白的粗制多糖溶液；

(4)DEAE-52纤维柱层析

取步骤(3)脱蛋白后的粗多糖溶液，上样于DEAE-52纤维层析柱中，然后分别用：蒸馏水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.25mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl进行分段洗脱，控制流速0.5mL/min，分别收集洗脱液，采用硫酸-苯酚法跟踪检测多糖部位，合并多糖洗脱部位；

(5)SephadexG-100凝胶柱层析

取步骤(4)经DEAE-52纤维柱纯化后的黄蜀葵花多糖上SephadexG-100凝胶柱，用蒸馏水洗脱，控制流速0.3mL/min，收集洗脱液，采用硫酸-苯酚跟踪检测，得精制的黄蜀葵花多糖。

本发明提供的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖在制备防治肿瘤药物中的应用。

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖在制备防治肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为人胃癌或人肝癌。

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖在制备防治肿瘤药物中的应用，把黄蜀葵花多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或微囊剂剂型的药物。

本发明在制成片剂时把有效成分细粉添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。在制成胶囊剂时，把有效成分细粉添加载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明在制成颗粒剂时，把有效成分细粉和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

有益效果：本发明提供的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖和现有技术相比具有有点：

1、本发明通过大量实验优选提取分离工艺，首先采用水提醇沉法得到粗多糖，再脱蛋白，然后DEAE-52纤维素树脂和SephadexG-100凝胶树脂联用进行纯化，制得纯度高的黄蜀葵花多糖，经过结构测定为一种新的多糖。

2、经过抗肿瘤实验结果表明，本发明提供的黄蜀葵花多糖具有很好的抗肿瘤活性，并且长期使用无不良反应，可以方便和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，临床上服用方便。

附图说明

图1为具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖的制备工艺流程图。

图2为黄蜀葵花多糖的红外光谱图。

图3为黄蜀葵花多糖的¹H NMR谱图。

图4为黄蜀葵花多糖的¹³CNMR谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

1、黄蜀葵花多糖的制备，如图1工艺流程所示，具体包括以下步骤：

(1)脱脂

称取黄蜀葵花400g，用黄蜀葵花总重量8倍体积的无水乙醇，在70℃水浴温浸渍提取8小时，趁热抽滤，得药渣挥尽乙醇后在60℃干燥，得脱脂后药材；

(2)粗多糖的提取

取步骤（1）脱脂后的黄蜀葵花药材200g，加入10倍量的水，在70℃浸渍提取2次，每次8h。滤过，合并滤液，在2000rpm离心10min，得上清液于70℃减压浓缩至原体积的1/10，然后加95%乙醇至乙醇浓度为70%，4℃静置24h后滤取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，减压干燥，得黄蜀葵花粗多糖;

(3)粗多糖脱蛋白质

取步骤(2)制备得到的黄蜀葵花粗多糖，完全溶解于蒸馏水中，然后加入浓度30%的三氯乙酸溶液至三氯乙酸终浓度为3%，在4℃静置8h，然后3000rpm离心10min，除去沉淀，得上清液用NaOH溶液调pH至中性，减压浓缩，浓缩液透析，截取分子量8000Da以上成分，得除蛋白的粗制多糖溶液；

(4)DEAE-52纤维柱层析

取步骤(3)脱蛋白后的粗多糖溶液，上样于DEAE-52纤维层析柱中，然后分别用：蒸馏水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.25mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl进行分段洗脱，控制流速0.5mL/min，分别收集洗脱液，采用硫酸-苯酚法跟踪检测多糖部位，合并多糖洗脱部位；

(5)SephadexG-100凝胶柱层析

取步骤(4)经DEAE-52纤维柱纯化后的黄蜀葵花多糖上SephadexG-100凝胶柱，用蒸馏水洗脱，控制流速0.3mL/min，收集洗脱液，采用硫酸-苯酚跟踪检测，得精制的黄蜀葵花多糖。

2、黄蜀葵花多糖的结构分析

（1）甲基化分析

甲基化方法为①称取40mg已经用P₂O₅真空干燥过的黄蜀葵花多糖，然后将其溶解于0.5mL蒸馏水中DMSO中，磁力搅拌12h，精密吸取200mL，加无水6mL DMSO，磁力搅拌至无絮状物为止，最后所得澄清的糖样DMSO溶液用4A分子筛干燥过夜。②另称取60mg经用石油醚多次洗涤过的NaH固体，将其溶解于另一6mL无水DMSO中，充氮气隔绝氧气，在60℃下磁力搅拌1h，至混合物变为墨绿色与氢气停止逸出时停止搅拌．③多糖羟基去质子反应．将②中所得的反应液加入①中所得澄清的糖样DMSO溶液中，在常温下震摇均匀，放置过夜。④用注射器抽取3mL碘甲烷在氮气保护下逐滴滴入③中所得的溶液中，密封后放置于冰箱中反应2h，然后在室温下避光，反应24h，反应完毕后加少量蒸馏水到上述反应液中中止反应．⑤甲基化多糖的分离提纯．将混合物取出放置在透析袋中用蒸馏水透析24h，一日换3次蒸馏水。将透析液取出，加入适量氯仿，用分液漏斗进行萃取。溶液分为上下两层，收集下层油状的黄棕色液体。

将所得的油状的黄棕色液体进行旋蒸浓缩，然后用P₂O₅进行真空干燥得黄棕色的固体。得甲基化多糖。⑥将所得甲基化多糖固体进行IR分析，若IR谱中在3400cm^-1处无吸收峰，即无羟基吸收峰，在2900cm^-1处有很强的吸收峰，即有很强的甲基吸收峰，则证明多糖已经被完全甲基化。若未完全甲基化，重复上述操作直至完全甲基化。

（2）甲基化多糖水解和阿尔迪醇衍生物制备和GC/MS分析

取以上完全甲基化中的溶液用88％的甲酸（3毫升），8小时，在100℃下在密封管中，然后除去甲酸。残余物加热2M三氟乙酸（3毫升）在120℃下3小时。水解产物浓缩至干。再加入3ml 2M的三氟乙酸（TFA）溶解，封口，120℃烘箱中水解反应2h，取出，减压蒸干，再加甲醇蒸干三次，重复操作以完全除尽TFA。水解后残余物加入100mg NaBH₄和2ml水，室温还原反应过夜。加冰醋酸反应以除去过量的NaBH4，于旋转蒸发仪上浓缩至粘稠液体，加入甲醇-冰醋酸（5：1）5ml，蒸干三次，再加甲醇蒸干两次，得到白色粉末，放入烘箱105℃15min以除去水分，加入3ml乙酸酐，101℃烘箱中乙酰化反应1h，取出，多次加甲苯50℃水浴减压共沸蒸干至粉末状。加适量水溶解，加氯仿萃取三次，合并氯仿层，用水洗三次，分出氯仿层，用无水硫酸钠干燥后浓缩后进行气相分析。

GC/MS条件：HP-5毛细管柱(30m×0．25mm)，程序升温：起始温度120°C，以升温至200°C，保持2min。然后以

升至270°C。

甲基化测定结果表明，本发明提取分离得到的黄蜀葵花多糖的组成单元为：α-D-吡喃半乳糖（1→6），α-L-吡喃岩藻糖（1→3），和α-D-吡喃甘露糖（2,3→6），β-D-吡喃葡萄糖（→1）

（3）本发明采用PMP衍生法测定黄蜀葵花多糖中单糖组成。结果表明黄蜀葵花多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和岩藻糖组成，其摩尔比为1:0.91:2.14:1.09。

（4）黄蜀葵花多糖的部分酸水解

部分酸水解方法为：称取20mg黄书葵花多糖于具塞瓶中，用0.05mol/L H₂SO溶解，100℃下分别水解6，12h。去离子水透析(Mw3500Da)，得低分子量透过液与高分子量截留液，分别减压浓缩、冻干，每一部分透过液与截留液都进行单糖分析。

部分酸水解结果提示：大量的葡萄糖、岩藻糖可能位于支链上，而大量甘露糖及半乳糖位于主链。

（5）黄蜀葵花多糖的红外分析

取以上1制备得到的黄蜀葵花多糖(2mg)用KBr(200mg)压片，于4000～400cm^-1范围内进行扫描。如图1所示，红外光谱中，在3600～3200cm-1处出现一个较强的宽峰，为羟基(-OH)的伸缩振动；在3000～2800cm^-1处出现的吸收峰较弱，为C-H的伸缩振动，这两组峰为多糖的特征吸收峰。1639.2cm^-1是的结合水的特征吸收带。1350~1450cm-1区域的是CH2和COH基团对应的弯曲振动。842.7cm^-1较强吸收在表示黄蜀葵花多糖含一定量的α-构型；而894.2cm^-1出现的较弱的吸收峰表明黄蜀葵花多糖含有少量的β-构型。

（6）黄蜀葵花多糖的¹H NMR和¹³C NMR分析

将干燥的黄蜀葵花多糖用D₂O溶解，室温条件下，在BrukerAVANCE 500Digital NMR型核磁共振仪上测试样品的氢谱和碳谱，图2中δH4.915，5.040，5.237，5.385，图3中δC97.49，99.71，103.24和106.00分别为单糖异头质子和异头碳的信号。结合甲基化结果、红外分析结果及文献资料，信号106.00/4.915可以归属于β-D-Glcp→；1103.24/5.040归属于→6α-D-Galp1→；99.71/5.385归属于→3α-Fucp 1→；97.49/5.237归属于→3,6α-D-Manp2→。

（7）黄蜀葵花多糖的分子量的测定

（7.1）色谱条件：色谱柱：Shodex suger KS-805流动相：蒸馏水，流速：0.8mL/min，柱温：50℃，检测器：Alltech-ES2000蒸发光散射检测器，进样量：10μl。

（7.2）标准曲线的建立

取多糖对照品D1、D3、D4、D5、D6、D7、D8（分子量分别为2500Da、7100Da、10000Da、21400Da、41100Da、84400Da、133800Da）及葡萄糖，按“7.1”项下色谱条件测定相对应对照品的保留时间，绘制标准曲线。

（7.3）多糖分子量测定

分别取适量的黄蜀葵花多糖稀释成1mg/ml作为样品溶液，按“7.1”项下色谱条件测定，保留时间为14.796min，计算黄蜀葵花多糖的分子量为8867。

实施例2黄蜀葵花多糖的抗肿瘤活性实验

1材料与试剂

1.1主要试剂DMEM培养基：GIBCO，小牛血清：HyClone公司；胰蛋白酶：GIBCO公司；MTT：美国amresco公司。

1.2实验用细胞株人肝癌SMMC-7721、HepG2，胃癌MGC-803、MKN-45细胞由江苏省中医院肿瘤内科实验室惠赠。

2方法

2.1细胞培养人肝癌SMMC-7721、HepG2，胃癌MGC-803、MKN-45细胞培养于DMEM培养液（含青霉素100U/ml；链霉素100μg/ml；10%胎牛血清），置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

2.2黄蜀葵花多糖对细胞增殖的影响取对数生长期的细胞按1*10⁵细胞密度接种至96孔板中，24h后更换无血清培养基，采用不同浓度的本发明实施例1制备得到的黄蜀葵花多糖（12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml）对其进行干预，同时设立空白对照和阳性对照氟尿嘧啶（5-FU）50μg/ml。每个浓度均设5个复孔，混合均匀后，放置孵箱孵育48h，培养结束前4h各孔加入MTT（5mg/ml）20μl，放置上述孵箱中继续孵育4h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μl/孔，震摇溶解10min后，用酶标仪测定570nm的光吸收度（OD）值。细胞抑制率(%)=(细胞对照组A－实验组A)/(细胞对照组A－空白对照组A)×100%。

2.3统计学处理数据数据采用

表示，IC50通过origin8.5统计软件算出。

3结果

3.1黄蜀葵花多糖对肝癌细胞株HepG2，SMMC7721和人胃癌细胞株MGC-803，MKN45的体外抗肿瘤活性

表1黄蜀葵花多糖对肝癌细胞株和人胃癌细胞株的抑制活性

由以上表1的抗肿瘤实验结果表明，不同浓度的实施例1制备得到的黄蜀葵花多糖作用于肿瘤细胞48h后，细胞生长均受到一定程度的抑制，并且随着黄蜀葵花多糖浓度增加，细胞生长抑制率增加，呈现出较好的量效关系。作用48h后，黄蜀葵花多糖对SMMC-7721、HepG2、MGC-803、SGC7901细胞的IC50分别为36.3±3.14、24.5±2.39、33.9±3.01、69.2±5.87μg/mL（n=3），显示出了较好的抗肿瘤活性。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖，其特征在于，该多糖由摩尔比为1:0.91:2.14:1.0的β-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-半乳糖和α-L-吡喃岩藻糖构成，该多糖的基本单元的结构式为：

该多糖的分子量为8867。

2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)脱脂处理

    称取黄蜀葵花药材，用总药材总量8~16倍的无水乙醇，在50~70℃水浴温浸泡6~12小时，趁热抽滤，得药渣挥尽乙醇后60~70℃干燥，得脱脂黄蜀葵花药材；

(2)粗多糖的提取

取步骤(1)脱脂后的黄蜀葵花药材，加入药材总重量8~12倍量的水，在60~70℃温度下浸渍提取1~3次，每次6~8h，滤过，合并滤液，在2000~3000rpm离心10~20min，得上清液在65~70℃下减压浓缩至原体积的1/10，然后加浓度为95%乙醇使乙醇的浓度达70%，然后在4℃静置24h后滤取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，减压干燥，得黄蜀葵花粗多糖；

(3)粗多糖脱蛋白质

取步骤(2)制备得到的黄蜀葵花粗多糖，完全溶解于蒸馏水中，然后加入浓度30%的三氯乙酸溶液至三氯乙酸终浓度为3%，在4℃静置5~8h，然后3000~3500rpm 离心 10~15min，除去沉淀，得上清液用NaOH溶液调pH至中性，减压浓缩，浓缩液透析，截取分子量8000Da以上成分，得除蛋白的粗制多糖溶液；

    (4)DEAE-52纤维柱层析

取步骤(3)脱蛋白后的粗多糖溶液，上样于DEAE-52纤维层析柱中，然后分别用：蒸馏水、0.05 mol/L NaCl、0.1 mol/L NaCl、0.25 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl进行分段洗脱，控制流速0.5mL/min，分别收集洗脱液，采用硫酸-苯酚法跟踪检测多糖部位，合并多糖洗脱部位；

    (5)SephadexG-100 凝胶柱层析

 取步骤(4)经DEAE-52纤维柱纯化后的黄蜀葵花多糖上SephadexG-100 凝胶柱，用蒸馏水洗脱，控制流速0.3mL/min，收集洗脱液，采用硫酸-苯酚跟踪检测，得精制的黄蜀葵花多糖。

3.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖在制备防治肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖在制备防治肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为人胃癌或人肝癌。

5.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的黄蜀葵花多糖在制备防治肿瘤药物中的应用，其特征在于，把黄蜀葵花多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或微囊剂剂型的药物。

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