CN115089620B - 一种巨藻结合态多酚的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巨藻结合态多酚的提取方法及其应用,涉及多酚的制备和应用领域。提取过程如下:首先将巨藻渣烘干,打粉、过筛后得到藻粉,然后将藻粉利用乙醇浸提,将滤渣与NaOH溶液混合水解,调节体系pH至中性;之后将溶液离心,收集上清液、萃取,得到巨藻结合态多酚提取液,除去巨藻结合态多酚提取液中的溶剂后冷冻干燥,即得巨藻结合态多酚。本发明从工业化生产海藻酸盐的副产物巨藻渣中提取得到了水溶性良好的巨藻结合态多酚,该多酚具有良好的抗氧化活性且对代谢综合征相关酶具有抑制作用,为巨藻渣赋予了新的开发和利用价值,同时也为代谢综合征药物、功能性食品的开发提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及多酚的制备和应用领域,特别是涉及一种巨藻结合态多酚的提取方法及其应用。
背景技术
巨藻(Macrocystis pyrifera (L.) Ag.)是最复杂且最大的褐藻类群,生活在潮下带,主要分布在北美洲太平洋沿岸和南美洲南部沿海等有上升冷水流的水域。其中,巨藻LN(Lessonia nigrescens)和巨藻LF(Lessonia trabrculate)大部分生长在南美太平洋沿岸等岩石海岸区域的大波浪环境中,常用于工业中生产海藻酸盐。其加工后的残渣主要制成饲料、肥料,但巨藻渣中仍含有丰富的多酚、岩藻黄质、膳食纤维等活性物质并未得到充分利用。基于此,针对工业加工副产物巨藻渣进行有效利用具有潜在的经济和社会价值。
褐藻多酚作为其中的主要生物活性物质,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性,分布于细胞质及细胞壁中,根据其存在形式可分为游离态多酚和结合态多酚。游离态多酚游离在细胞质中,具有良好的溶解性,易溶于有机溶剂和水。结合态多酚通过共价键与细胞壁中的纤维素连接,因此不能直接利用溶剂对其进行萃取,而要经过酶解、酸水解或碱水解之后再利用溶剂进行萃取。目前等褐藻多酚提取的研究较多集中在物理法结合有机相提取游离态多酚,但褐藻多酚的结构基本单元为间苯三酚(1,3,5-三羟基苯),含有大量酚羟基与水能形成氢键,与陆地植物多酚相比,水溶性更好。然而针对巨藻水溶性结合态多酚的提取及其对代谢综合征调节功能的相关研究较少,制约了巨藻渣的全面开发利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种巨藻结合态多酚的提取方法及其应用,以解决上述现有技术存在的问题,从而为巨藻渣赋予新的开发和利用价值,同时为代谢综合征药物的开发提供新思路。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种巨藻结合态多酚的提取方法,包括以下步骤:
(1)将巨藻渣烘干,打粉、过筛后得到藻粉;
(2)将所述藻粉与乙醇混合,浸提,收集滤渣;
(3)将所述滤渣与NaOH溶液混合,水解,调节溶液体系pH至中性;
(4)将步骤(3)得到的溶液离心,收集上清液并进行萃取,收集水相,得到巨藻结合态多酚提取液;
(5)除去所述巨藻结合态多酚提取液中的溶剂,冷冻干燥即得所述巨藻结合态多酚。
进一步地,步骤(2)所述浸提的温度为55 ℃,时间为6 h。
进一步地,所述NaOH溶液的浓度为4~8 mol/L。
进一步地,所述滤渣与NaOH溶液的重量体积比为1 g:30~50 mL。
进一步地,所述水解温度为50 ℃,时间为1~3 h。
进一步地,所述萃取采用的有机溶剂为乙酸乙酯。
进一步地,步骤(1)中所述的烘干温度为55 ℃。
本发明还提供上述提取方法提取得到的巨藻结合态多酚。
本发明还提供上述巨藻结合态多酚在代谢综合征药物领域中的应用。
本发明从工业化生产海藻酸盐的副产物巨藻渣中提取了水溶性良好的结合态褐藻多酚,并对其进行抗氧化及代谢综合征调节作用进行评价,发现本发明获得的结合态褐藻多酚具有与水溶性维生素E(Trolox)相近的抗氧化活性,并可显著抑制代谢综合征相关酶的活性,如α-淀粉酶,α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶等。
本发明公开了以下技术效果:
本发明以提取海藻酸盐后的巨藻渣为原料,通过优化碱法水解的工艺条件获得一种巨藻结合态多酚,该多酚具有良好的抗氧化活性且对代谢综合征相关酶具有抑制作用。本发明为巨藻渣赋予了新的开发和利用价值,同时也为代谢综合征药物的开发提供新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3制备的巨藻结合态多酚粉末样品的实物图;
图2为FRAP法评价实施例3巨藻结合态多酚和Trolox的总抗氧化能力;
图3为阿卡波糖(图A)及实施例3巨藻结合态多酚(图B)对α-淀粉酶活性的抑制作用对比;
图4为阿卡波糖(图A)及实施例3巨藻结合态多酚(图B)对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用对比;
图5为奥利司他与实施例3巨藻结合态多酚对胰脂肪酶活性的抑制作用对比。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
一种巨藻水溶性结合态多酚的制备方法,步骤如下:
S1、取工业上制备海藻酸盐后的巨藻渣进行55 ℃烘干,打粉后过60目筛,得到藻粉备用。
S2、取100 g藻粉按1 g:10 mL的比例加入1 L的85%乙醇,55 ℃搅拌浸提6 h,过滤后收集滤渣,重复2次。
S3、取滤渣按1 g:40 mL比例加入4 mol/L的NaOH溶液,于50 ℃温度下搅拌水解1h,结束后用盐酸调节pH至中性。
S4、将S3中的溶液在10000 rpm室温离心15 min,收集上清液后加入等体积的乙酸乙酯萃取2次,然后取下层水相,得到巨藻结合态多酚提取液;
S5、将上述获得的结合态多酚提取液在45 ℃条件下旋转蒸发,除去残留的有机试剂,经真空冷冻干燥后即得到巨藻结合态多酚样品,密封后于4 ℃保存。
测定巨藻结合态多酚的得率:
采用双蒸水溶解冻干后的巨藻结合态多酚粉末,通过Folin-Ciocalteu比色法,以没食子酸为标准品,测定其多酚含量,并计算得到多酚得率(mg GAE/g DW)。标准曲线的建立如下:精确称量0.01 g没食子酸标准品,加入乙醇,待其溶解后,用100 mL容量瓶将其定容,配制成浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液。分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL0.1 mg/mL的没食子酸溶液,用乙醇定容到5 mL,制成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液。取上述所配制的不同浓度没食子酸溶液各0.15 mL于2 mL离心管中,依次向2 mL离心管中加入0.375 mL 0.1 mol/L Folin酚试剂,摇匀常温反应5 min后,加入0.3 mL的7.5% Na2CO3溶液,混匀后加入0.675 mL去离子水,避光放置2 h。2 h反应结束后吸取各浓度溶液200 μL于96孔板中,用酶标仪在760 nm 处测定其吸光度,每个做3个平行。横坐标用标准品的浓度mg GAE表示,吸光度值做纵坐标,得到标准曲线:y = 6.5934x +0.0165。
结果表明:巨藻渣粉末中提取到的水溶性结合态多酚为5.27 mg GAE/ g DW。
实施例2
一种巨藻水溶性结合态多酚的制备方法,步骤如下:
S1、取工业上制备海藻酸盐后的巨藻渣进行55 ℃烘干,打粉后过60目筛,得到藻粉备用。
S2、取100g藻粉按1g:10 mL的比例加入1 L的85%乙醇,55 ℃搅拌浸提6 h,过滤后收集滤渣,重复2次。
S3、取滤渣按1 g:30 mL比例加入6 mol/L的NaOH溶液,于50 ℃温度下搅拌水解3h,结束后用盐酸调节pH至中性。
S4、将S3中的溶液在10000 rpm室温离心15 min,收集上清液后加入等体积的乙酸乙酯萃取2次,然后取下层水相,得到巨藻结合态多酚提取液;
S5、将上述获得的结合态多酚提取液在45 ℃条件下旋转蒸发,除去残留的有机试剂,经真空冷冻干燥后即得到巨藻结合态多酚样品,密封后于4 ℃保存。
同实施例1采用福林酚法测定巨藻结合态多酚的得率为7.20 mg GAE/ g DW。
实施例3
一种巨藻水溶性结合态多酚的制备方法,步骤如下:
S1、取工业上制备海藻酸盐后的巨藻渣进行55 ℃烘干,打粉后过60目筛,得到藻粉备用。
S2、取100g藻粉按1g:10 mL的比例加入1 L的85%乙醇,55 ℃搅拌浸提6 h,过滤后收集滤渣,重复2次。
S3、取滤渣按1 g:50 mL比例加入8 mol/L的NaOH溶液,于50 ℃温度下搅拌水解2h,结束后用盐酸调节pH至中性。
S4、将S3中的溶液在10000 rpm室温离心15 min,收集上清液后加入等体积的乙酸乙酯萃取2次,然后取下层水相,得到巨藻结合态多酚提取液;
S5、将上述获得的结合态多酚提取液在45 ℃条件下旋转蒸发,除去残留的有机试剂,经真空冷冻干燥后即得到巨藻结合态多酚样品,密封后于4 ℃保存。
同实施例1采用福林酚法测定巨藻结合态多酚的得率为9.38 mg GAE/ g DW。实施例3制备的巨藻结合态多酚粉末样品如图1所示。
实施例4
实施例3制备的巨藻结合态多酚的抗氧化活性评价:
将300 mmol/L,pH=3.6的醋酸缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液(含40 mmol/L盐酸)、20 mmol/L三氯化铁溶液以10:1:1的体积比配制成FRAP工作液。取0.05 mL浓度分别为10,20,30,40和50 μg/mL的巨藻结合态多酚溶液(利用实施例1制备的巨藻结合态多酚配制得到)或阳性对照Trolox溶液于2 mL离心管中,加入1.45 mL FRAP工作液,37 ℃水浴10 min,取200 μL于96孔板中,在593 nm处测吸光度,记录吸光度值。通过Excel软件求得平均值后作图并进行线性拟合。
结果表明:Trolox或多酚的浓度与OD593之间存在线性关系,趋势线的斜率之比为2.29(如图2),即多酚的抗氧化活性当量为2.29 μg TE/μg。结果说明制备得到的巨藻结合态多酚对Fe3+有一定的还原能力,且其能力比Trolox更强。
实施例5
实施例3制备的巨藻结合态多酚对α-淀粉酶活性的抑制作用:
以阿卡波糖溶液与巨藻结合态多酚按照表1进行实验,以探究不同浓度巨藻结合态多酚与阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制作用。设置4组实验同时进行,空白组不含α-淀粉酶和抑制剂(阿卡波糖或多酚);对照组不含抑制剂但含有α-淀粉酶;实验空白组不含α-淀粉酶但含有抑制剂;实验组同时含有α-淀粉酶和抑制剂。
按下列公式(1)计算抑制率,并通过Origin软件作图并拟合求得半抑制率IC50:
(1)
其中:ODA为实验组吸光值,ODa为实验空白组吸光值,ODB为对照组吸光值,ODb为空白组吸光值。
表1 α-淀粉酶抑制活性测定
结果表明,阿卡波糖与多酚的IC50分别为0.38 mg/mL、0.68 mg/mL(如图3),二者相比得到多酚相对于阿卡波糖的抑制作用当量为0.56 mg AE/mg。结果表明巨藻结合态多酚对α-淀粉酶有良好的抑制作用。
实施例6
实施例3制备的巨藻结合态多酚对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用:
以阿卡波糖溶液与巨藻结合态多酚溶液按照表2进行实验,以探究不同浓度巨藻结合态多酚与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。设置4组实验同时进行,空白组不含α-葡萄糖苷酶和抑制剂(阿卡波糖或多酚);对照组不含抑制剂但含有α-葡萄糖苷酶;实验空白组不含α-葡萄糖苷酶但含有抑制剂;实验组同时含有α-葡萄糖苷酶和抑制剂。
同样按公式(1)计算抑制率,并通过Origin软件作图并拟合求得半抑制率IC50。
表2. α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
结果表明,阿卡波糖与多酚的半抑制浓度分别为0.0113、2.107 μg/mL(如图4),二者相比得到多酚对与阿卡波糖的相对当量为5.3 ng AE/μg。结果表明巨藻结合态多酚对α-葡萄糖苷酶有一定抑制作用。
实施例
实施例3制备的巨藻结合态多酚对胰脂肪酶活性的抑制作用:
以奥利司他溶液与巨藻结合态多酚溶液按照表3进行实验,以探究不同浓度巨藻结合态多酚与奥利司他对胰脂肪酶的抑制作用。设置4组实验同时进行,空白组不含胰脂肪酶和抑制剂(奥利司他或多酚);对照组不含抑制剂但含有胰脂肪酶;实验空白组不含胰脂肪酶但含有抑制剂;实验组同时含有胰脂肪酶和抑制剂。按照公式(1)计算二者的抑制率,并通过Excel软件求得平均值后作图并进行线性拟合。
表3. 胰脂肪酶抑制活性测定
结果显示,奥利司他或多酚的浓度与胰脂肪酶抑制率之间存在线性关系,趋势线的斜率之比为1.29(如图5),即多酚对胰脂肪酶抑制作用当量为1.29 μg OE/μg。结果说明巨藻结合态多酚对胰脂肪酶有一定抑制作用。
对比例1
同实施例1,区别仅在于,在S3步骤中NaOH的水解温度为 30 ℃。
采用福林酚法(同实施例1)测定巨藻结合态多酚的得率,结果显示得率为3.25 mgGAE/ g DW。
对比例2
同实施例1,区别仅在于,在S3步骤中NaOH的水解温度为 40 ℃。
采用福林酚法(同实施例1)测定制备得到的巨藻结合态多酚的得率,结果显示得率为4.11 mg GAE/ g DW。
对比例3
同实施例1,区别仅在于,在S3步骤中NaOH溶液的浓度为 2 mol/L。
采用福林酚法(同实施例1)测定制备得到的巨藻结合态多酚的得率,结果显示得率为3.75 mg GAE/ g DW。
对比例4
同实施例1,区别仅在于,在S3步骤中滤渣与NaOH溶液的比例为1 g:20 mL。
采用福林酚法(同实施例1)测定制备得到的巨藻结合态多酚的得率,结果显示得率为2.06 mg GAE/ g DW。
对比例5
同实施例3,区别仅在于,在S3步骤中NaOH的水解温度为 60 ℃。
采用福林酚法(同实施例1)测定制备得到的巨藻结合态多酚的得率,结果显示得率为9.37 mg GAE/ g DW,略高于实施例3的巨藻结合态多酚得率。但按实施例4方法测定巨藻结合态多酚抗氧化活性当量为1.52 μg TE/μg,按实施例5方法测定巨藻结合态多酚相对于阿卡波糖对α-淀粉酶抑制作用当量为0.21 mg AE/mg,按实施例6方法测定巨藻结合态多酚相对于阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用当量为3.5 ng AE/μg,按实施例7方法测定巨藻结合态多酚相对于奥利司他对胰脂肪酶抑制作用当量为0.5 μg OE/μg。可见,碱水解温度的提高造成了对巨藻结合态多酚的破坏,导致巨藻结合态多酚抗氧化活性及对代谢综合征相关酶的抑制作用均减弱。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种巨藻结合态多酚,其特征在于,采用以下步骤制备得到:
(1)将巨藻渣烘干,打粉、过筛后得到藻粉;
(2)将所述藻粉与乙醇混合,浸提,收集滤渣;
(3)将所述滤渣与NaOH溶液混合,水解,调节溶液体系pH至中性;
(4)将步骤(3)得到的溶液离心,收集上清液并进行萃取,收集水相,得到巨藻结合态多酚提取液;
(5)除去所述巨藻结合态多酚提取液中的溶剂,冷冻干燥即得所述巨藻结合态多酚;
步骤(2)所述浸提的温度为55℃,时间为6h;
所述NaOH溶液的浓度为4~8mol/L;
所述滤渣与NaOH溶液的重量体积比为1g:30~50mL;
所述水解温度为50℃,时间为1~3h;
所述萃取采用的有机溶剂为乙酸乙酯。
2.根据权利要求1所述的巨藻结合态多酚,其特征在于,步骤(1)中所述的烘干温度为55℃。
3.如权利要求1所述的巨藻结合态多酚在制备代谢综合征药物领域中的应用。
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