CN104278063A - 一种生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，本方法以新鲜红藻为原料提取植物内源性硫酸酯酶，通过(NH4)2SO4沉淀、疏水层析和离子交换层析分离纯化后应用于制备高凝胶强度κ-卡拉胶。本发明产品凝胶强度≥1000g/cm2，得率≥30％，采用生物酶催化技术取代传统碱改性工艺，消除了对环境的污染，适应目前低碳、环保的发展趋势。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，属于海洋资源利用及食品添加剂生物制造技术领域。
背景技术
卡拉胶(Carrageenan)又称角叉菜胶、鹿角菜胶，是从海洋红藻中提取的一种水溶性硫酸酯多糖，是世界三大海藻胶工业产品(琼胶、卡拉胶、褐藻胶)之一。卡拉胶是几种多糖的复杂混合物，由1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-a-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的线性多糖。根据半酯式硫酸基在半乳糖上所连接的位置不同，可分为七种类型，用希腊字母分别命名为κ-、μ-、l-、v-、λ-、θ-和ζ-卡拉胶。κ-卡拉胶能形成硬的脆性胶，其凝固性最好，粘度较低，适合做果冻、固定化酶载体等，工业上应用最广泛，尤其是利用高凝胶强度κ-卡拉胶生产制造药用硬胶囊成为近年来的研究热点。
μ-卡拉胶和κ-卡拉胶结构类似，只是在1，4-a-D-半乳糖残基中带有C6硫酸酯基团，该基团在卡拉胶高分子长链中形成一个扭结，妨碍双螺旋体的形成，因此μ-卡拉胶不能形成凝胶。碱改性或酶催化可以脱除μ-卡拉胶中C6硫酸酯基团形成3，6-内醚-半乳糖，从而将μ-卡拉胶转化成κ-卡拉胶，提高产品凝胶强度。目前，国内外普遍采用碱改性生产κ-卡拉胶，中国专利文献CN03114130.7(公开号CN1450088A)用5～25％氢氧化钾制备卡拉胶，耗碱量大，能耗高、环境污染严重。因此，寻找一种节能、环保、资源可再生和循环利用的方法制备高凝胶强度κ-卡拉胶有十分重大的意义和应用价值。
赵谋明等应用复合纤维素酶处理沙菜藻体，提高沙菜卡拉胶的产率，但卡拉胶凝胶强度下降。Barbeyron等研究发现A.fortisκ-卡拉胶酶通过水解卡拉胶的β-1，4糖苷键降解κ-卡拉胶，生成卡拉胶低聚糖，但卡拉胶凝胶强度大幅度下降。Lawson和Rees从新收获的星芒衫藻(Gigartina stellata)中提取分离到一种酶，能脱除μ-卡拉胶中硫酸酯基团并形成等量3，6-内醚环，Wong采用(NH4)2SO4沉淀和离子交换色谱从皱波角叉菜(Chondrus crispus)中分离纯化得到磺基氢化酶，能将μ-卡拉胶转化成κ-卡拉胶，但这两种来源的酶活性都较低，不能应用于制备高凝胶强度κ-卡拉胶。中国海南岛拥有丰富的红藻资源，已在国内被用作制造κ-卡拉胶的重要原料，但提取红藻中内源性D-半乳糖-6-硫酸化酶，制备高凝胶强度κ-卡拉胶的工艺未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，解决了传统碱改性工艺技术存在的碱处理浓度大，环境污染严重的缺陷。
本发明具有以下优势：(1)本发明采用生物酶催化技术，取代传统碱改性工艺，消除环境污染，实现卡拉胶清洁生产，该方法未见报道；(2)与其他酶法制备κ-卡拉胶相比，本发明方法制备得到的κ-卡拉胶产品凝胶强度提高了3～6倍，达到1000g/cm2，并且κ-卡拉胶多糖得率≥30％，在卡拉胶生产方面形成新的技术和工艺。
本发明方法首先从新鲜红藻中提取D-半乳糖-6-硫酸化酶，然后以D-半乳糖-6-硫酸化酶活性为指标，通过(NH4)2SO4沉淀，疏水层析、离子交换层析分离纯化D-半乳糖-6-硫酸化酶，并以一定活力红藻D-半乳糖-6-硫酸化酶催化制备高凝胶强度κ-卡拉胶，替代传统碱改性工艺，实现卡拉胶清洁生产，促进卡拉胶生产企业节能减排，实现产业结构转型升级，提高产品档次和市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所述的琼脂糖基质的苯基疏水层析介质可采用北京瑞达恒辉科技发展有限公司生产的苯基-琼脂糖凝胶6FF，弱碱性阴离子交换层析介质可采用北京瑞达恒辉科技发展有限公司生产的DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B。
实施例1
称取新鲜原料红藻麒麟菜700g，用液氮冷冻并在陶瓷研钵中研磨成细粉状，粉末中加入1500ml冷的Tris-HCl缓冲溶液解冻，0℃搅拌提取24小时，冷冻离心，沉淀为原料回收备用；上清液中缓慢的加入(NH4)2SO4使其溶解，沉淀过夜，冷冻离心，弃上清，沉淀物复溶于Tris-HCl缓冲液中，透析后D-半乳糖-6-硫酸化酶粗酶液经疏水层析和离子交换层析分离纯化后，冷冻干燥备用。称取相同批次红藻麒麟菜200g，加入1500ml Tris-HCl缓冲溶液提取卡拉胶，得到的卡拉胶凝胶强度为228.4g/cm2。胶液中加入10mg红藻D-半乳糖-6-硫酸化酶，45℃搅拌反应10小时；将上述卡拉胶溶液真空浓缩，胶液中加入絮凝剂氯化钾，过滤，所得白色物质于60℃真空干燥4小时，产品粉碎至100目，包装。经测定，所得κ-卡拉胶产品的得率为32.7％，凝胶强度为1138.5g/cm2，
实施例2
称取新鲜原料红藻角叉菜500g，用液氮冷冻并在陶瓷研钵中研磨成细粉状，粉末中加入1200ml冷的Tris-HCl缓冲溶液解冻，0℃搅拌提取16小时，冷冻离心，沉淀为原料回收备用；上清液中缓慢的加入(NH4)2SO4使其溶解，沉淀过夜，冷冻离心，弃上清，沉淀物复溶于Tris-HCl缓冲液中，透析后D-半乳糖-6-硫酸化酶粗酶液经疏水层析和离子交换层析分离纯化后，冷冻干燥备用。称取红藻角叉菜1000g，加入5000ml Tris-HCl缓冲溶液提取卡拉胶，得到的卡拉胶凝胶强度为189.7g/cm2。胶液中加入上述红藻D-半乳糖-6-硫酸化酶15mg，40℃搅拌反应12小时；将上述卡拉胶溶液真空浓缩，胶液中加入絮凝剂氯化钾，过滤，所得白色物质于60℃真空干燥4小时，产品粉碎至100目，包装。经测定，所得κ-卡拉胶产品的得率为33.5％，凝胶强度为1404.9g/cm2。
实施例3
称取新鲜原料红藻沙菜1000g，用液氮冷冻并在陶瓷研钵中研磨成细粉状，粉末中加入2000ml冷的Tris-HCl缓冲溶液解冻，0℃搅拌提取20小时，冷冻离心，沉淀为原料回收备用；上清液中缓慢的加入(NH4)2SO4使其溶解，沉淀过夜，冷冻离心，弃上清，沉淀物复溶于Tris-HCl缓冲液中，透析后D-半乳糖-6-硫酸化酶粗酶液经疏水层析和离子交换层析分离纯化后，冷冻干燥备用。称取红藻沙菜2000g，加入6000ml Tris-HCl缓冲溶液提取卡拉胶，得到的卡拉胶凝胶强度为94.9g/cm2。胶液中加入上述红藻D-半乳糖-6-硫酸化酶50mg，50℃搅拌反应16小时；将上述卡拉胶溶液真空浓缩，胶液中加入絮凝剂氯化钾，过滤，所得白色物质于60℃真空干燥4小时，产品粉碎至100目，包装。经测定，所得κ-卡拉胶产品的得率为30.9％，凝胶强度为1052.1g/cm2。
Claims (5)
1.一种生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，其特征是，包括以下工艺步骤：
(1)将新鲜的红藻液氮条件下研磨至60～100目细粉状，加入pH8～10的Tris-HCl缓冲溶液，红藻与Tris-HCl缓冲溶液的料液比为1g∶2～5ml，在0～4℃搅拌12～24小时，提取植物内源性D-半乳糖-6-硫酸化酶；0～4℃条件下冷冻离心，向离心后的上清液中加入(NH4)2SO4形成60～80％硫酸铵饱和溶液；饱和溶液，放置6～12小时自然沉淀；
(2)将步骤(1)得到的沉淀复溶于pH6～8的Tris-HCl缓冲溶液中，料液比为1mg∶1～5ml，酶液加入到琼脂糖基质的苯基疏水柱中，用盐水溶液进行线性洗脱，流速为0.5～1.5mL/min；收集活性部分加入到弱碱性阴离子交换柱中，用盐水溶液进行线性洗脱，流速为0.5～1.0mL/min，收集活性部分-10～-60℃条件下冷冻干燥12～24小时，得到D-半乳糖-6-硫酸化酶，备用；
(3)向卡拉胶溶液中加入D-半乳糖-6-硫酸化酶，卡拉胶溶液的浓度为0.1wt％～1.4wt％，D-半乳糖-6-硫酸化酶的加入量为1～100mg/kg(以卡拉胶质量计)，于25～60℃催化反应8～12小时，得到酶处理的卡拉胶溶液；将上述卡拉胶溶液浓缩、干燥、粉碎后即得到所述的高凝胶强度κ-卡拉胶。
2.如权利要求1所述的生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，其特征是：所述红藻为叉菜(Chondrus)、麒麟菜(Eucheuma)、杉藻(Gigartina)或沙菜(Hypena)。
3.如权利要求1所述的生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，其特征是：所述琼脂糖基质的苯基疏水介质为苯基-琼脂糖凝胶(Phenyl-Sepharose)、苯基-琼脂糖CL-4B凝胶(Phenyl-Sepharose CL-4B)或苯基-琼脂糖6FF凝胶(Phenyl-Sepharose6Fast Flow)，所用的盐为(NH4)2SO4，其浓度为0.1～2M(NH4)2SO4。
4.如权利要求1所述的生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，其特征是：所述弱碱性阴离子交换介质为二乙氨基乙基-葡聚糖A-50凝胶(DEAE-SephadexA-50)、二乙氨基乙基-琼脂糖CL-6B凝胶(DEAE-SepharoseCL-6B)或二乙氨基乙基生物A凝胶(DEAE Bio-Gel A)，所用盐为NaCl，其浓度为0.1～1.0MNaCl。
5.如权利要求1所述的生物酶法制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，其特征是：步骤(3)中，所述浓缩的条件为45～60℃条件下真空浓缩0.5～2小时，真空度为-0.06～-0.09MP；干燥条件是45～60℃条件下真空干燥3～6小时，真空度为-0.06～-0.09MPa；粉碎至80-120目得到产品。
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