CN112522235A

CN112522235A - 一种新型卡拉胶硫酸酯酶

Info

Publication number: CN112522235A
Application number: CN202011531068.4A
Authority: CN
Inventors: 张德超; 许静媛; 张德进; 宋永科; 许福土
Original assignee: Rongcheng Hongpai Marine Biotechnology Co ltd
Current assignee: Rongcheng Hongpai Marine Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112522235B

Abstract

本发明提供一种新型卡拉胶硫酸酯酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。并应用该酶降解κ‑卡拉胶，通过脱去硫酸基团，降低κ‑卡拉胶中硫酸基含量，脱硫率高，提高κ‑卡拉胶的凝胶强度，并能通过该酶来控制κ‑卡拉胶的流变性能。本发明利用从麒麟菜分离筛选高效降解卡拉胶的菌株基因组DNA，体外重组表达卡拉胶硫酸酯酶，脱硫率高，脱硫效果明显，与现有的化学法脱硫相对，克服了破坏性大、反应条件剧烈、对卡拉胶多糖结构影响大和效率低的缺点，与现有的硫酸酯酶脱硫效果相比，本发明的卡拉胶硫酸酯酶脱硫率远优于现有的硫酸酯酶。

Description

一种新型卡拉胶硫酸酯酶

技术领域

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种新型卡拉胶硫酸酯酶 (Cel-κ-CgsA300)。

背景技术

卡拉胶是一种广泛存在于海洋红藻细胞壁中的多糖硫酸酯，在食品和制药工业被广泛用于胶凝剂、稳定剂和增粘剂。根据其单糖种类以及硫酸酯基取代位置的不同,卡拉胶有十几种,主要有κ-卡拉胶、λ-卡拉胶和ι-卡拉胶。其中κ-卡拉胶在食品中应用最多，由硫酸基化的或非硫酸基化的半乳糖和3,6-脱水半乳糖通过α-1,3糖苷键和β-1,4键交替连接而成，在1,3连接的D半乳糖单位 C4上带有1个硫酸基。

κ-卡拉胶的理化性质主要由分子量、脱水半乳糖的出现频率和硫酸基含量。多糖经过分子修饰可改变其结构，从而提高多糖的生物活性或降低其毒副作用。

多糖分子修饰已成为发现和研制多糖药物的有效途径，实验已经证明，高含量的硫酸基会导致κ-卡拉胶的凝胶强度降低。鉴于κ-卡拉胶在食品和制药工业的广泛应用，以脱硫为主的分子修饰具有非常好的应用价值。

目前，常用的多糖脱硫方法，主要有酸碱法、二甲基亚砜-甲醇法、三甲基氯硅烷法以及苯并四甲酸-Sb₂O₃法。其中酸碱法反应条件比较剧烈，极易引起糖苷健的断裂；二甲基亚砜-甲醇法操作简单,但脱硫酸基效率不高；三甲基氯硅烷法是一种非选择性的脱硫方法,由于所用试剂容易爆炸，具有一定危险性；苯并四甲酸-Sb₂O₃法操作比较复杂。而相比之下，生物酶法多糖脱硫条件温和、易于控制，对多糖的结构影响比较小，并且绿色环保，因此开发高效、稳定性高且易于制备的卡拉胶硫酸酯酶是十分必要的。

发明内容

本发明提供一种新型卡拉胶硫酸酯酶(Cel-κ-CgsA300)，并应用该酶降解κ- 卡拉胶，通过脱去硫酸基团，降低κ-卡拉胶中硫酸基含量，脱硫率高，提高κ- 卡拉胶的凝胶强度，并能通过该酶来控制κ-卡拉胶的流变性能。

本发明首先提供一种新型卡拉胶硫酸酯酶，包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

MKRNFFFILLLTVAINLNAQEKPNIIFLFSDDAGYADFGFQGSEMMKTPNLDKLAKSGAKFTQG YVTDATCGPSRAGLITGKYQQRFGYEEINVPGYMSANSKFLADDMGLPLDQLTIADYLKKLGYKTAMY GKWHLGDADRYHPTKRGFDEFYGFRGGARNYFGYNDVSKATKDNRMERGFGNYQEPTEYVTDALAKEA VSFIEKNKGNPFFIYLAFNAVHTPMQATKEDLDKFPNLTGKRKELAAMTLALDRACGTVLNKLKELGL DKNTIVVFSNDNGGPTDKNASLNLPLSGTKSNHLEGGIRVPFLISWPKQIKSKTVYNFPVSTLDLLPT FYAAGGGNVADLKDIDGVDLLPYINGQNNSRPHNTLFEKKEVRLAYREGDYKLIRFADRPAELYNLST DIAEQNNIAYKHPEMVKSMFKKMFEWESSLQRPLWMLKRSFENYDIDRMDRYRTPEMVKKEIEQYAIP LKESNGYKKIEN；

2)在1)的序列为SEQ ID NO:1的氨基酸上取代、缺失、添加一个或数个氨基，且具有1)中所述酶的酶学性质的硫酸酯酶；

本发明还提供编码上述卡拉胶硫酸酯酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2：

ATGAAAAGAAATTTTTTTTTTATTCTACTACTAACAGTAGCAATTAACC TAAATGCACAAGAAAAACCAAATATCATTTTCTTGTTTTCTGATGATGCTGG TTACGCAGATTTTGGTTTTCAAGGCAGTGAAATGATGAAGACTCCTAACTT AGATAAACTAGCTAAATCTGGAGCAAAGTTTACACAAGGCTATGTAACCGA CGCCACTTGCGGGCCGTCTAGAGCAGGCTTAATTACAGGAAAATATCAACA ACGCTTTGGGTATGAAGAAATAAACGTGCCAGGTTATATGAGTGCAAACTC TAAATTTTTGGCAGATGATATGGGCTTACCCTTAGACCAATTAACCATTGCA GATTATTTAAAAAAACTAGGGTATAAAACTGCTATGTACGGCAAATGGCATT TGGGTGACGCAGACCGTTACCACCCTACCAAAAGAGGTTTTGATGAGTTTT ACGGATTTAGAGGAGGTGCCCGTAATTACTTTGGTTACAATGATGTTTCTAA AGCAACCAAAGACAACAGAATGGAAAGAGGCTTTGGTAATTACCAAGAA CCAACAGAATACGTAACAGATGCATTAGCCAAAGAAGCAGTTTCATTTATT GAAAAAAATAAAGGCAATCCATTTTTTATTTATTTAGCCTTTAATGCAGTACACACACCAATGCAAGCCACAAAAGAAGACCTAGATAAATTTCCTAATTTAA CAGGAAAACGAAAAGAATTAGCCGCTATGACTTTAGCCTTAGATAGGGCTT GTGGCACTGTTTTAAACAAGTTAAAGGAACTTGGTTTAGACAAAAATACAA TTGTTGTTTTCTCTAACGACAATGGCGGACCTACAGATAAAAATGCATCATT AAACCTACCACTAAGCGGCACAAAATCTAACCATTTAGAAGGCGGCATTAG AGTTCCCTTTTTAATAAGTTGGCCAAAACAAATAAAGTCTAAAACTGTATA CAATTTTCCGGTAAGCACACTAGATTTACTCCCTACTTTTTATGCAGCAGGT GGTGGCAATGTTGCAGATTTAAAAGATATAGATGGTGTTGATTTACTGCCGT ACATTAACGGACAAAACAACAGCAGACCACACAATACTTTATTCGAGAAA AAAGAAGTACGCTTAGCTTATAGAGAAGGTGACTATAAATTAATAAGATTT GCAGATAGACCTGCAGAGTTGTATAATTTATCTACAGACATTGCAGAGCAA AACAATATAGCATATAAACATCCAGAAATGGTAAAGTCTATGTTTAAAAAAA TGTTTGAATGGGAATCTAGCCTTCAACGTCCATTATGGATGCTTAAAAGGTC TTTTGAAAATTATGACATAGACCGTATGGACCGTTACAGAACCCCAGAAAT GGTTAAAAAAGAAATAGAACAATACGCCATCCCTTTAAAAGAAAGTAATG GATATAAAAAAATAGAAAACTAA；

其次，本发明提供一种重组表达载体，该重组表达载体携带有编码上述卡拉胶硫酸酯酶的基因；

本发明还提供重组宿主，用于重组表达上述卡拉胶硫酸酯酶；

本发明提供一种酶法水解制备高强度κ-卡拉胶的方法，包括如下的步骤：

1)底物配制：将κ-卡拉胶原料与水混合，配制成浓度为0.4％-0.5％的pH 值为6.0的酶解底物溶液；

2)酶解：使用上述的卡拉胶硫酸酯酶进行酶解，加酶量为0.8U，反应在 37℃，pH6.0的条件下反应7个小时；酶解结束后，酶解产物即为高凝胶强度κ- 卡拉胶。

本发明利用从麒麟菜分离筛选高效降解卡拉胶的菌株Cellulophaga lytica519-2-1，体外重组表达卡拉胶硫酸酯酶，脱硫率高，脱硫效果明显，与现有的化学法脱硫相对，克服了破坏性大、反应条件剧烈、对卡拉胶多糖结构影响大和效率低的缺点，与现有的硫酸酯酶脱硫效果相比，运用从麒麟菜分离筛选高效降解卡拉胶的菌株Cellulophagalytica 519-2-1中硫酸酯酶基因体外重组表达的卡拉胶硫酸酯酶，脱硫率远优于现有的硫酸酯酶。本发明过程简单、成本低且适用于工业化生产，能够在短时间内降低κ-卡拉胶硫酸基含量，脱硫率在75％以上。所制备的脱硫κ-卡拉胶强度增加，可用于食品及制药工业领域，具有广泛应用前景。

附图说明

图1：本发明中卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300纯化SDS-PAGE图，其中M 为广谱蛋白Marker(25-180kDa)；1为纯化后的Cel-κ-CgsA300。

图2：本发明中卡拉胶硫酸酯Cel-κ-CgsA300酶学性质图，其中图2A为最适反应温度图；图2B为最适反应pH图；图2C为最适底物浓度图；图2D为最适氯化钠浓度；图2E为金属离子的影响图；

图3：本发明中卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300降解卡拉胶的产物分析图，其中(A)未经酶解的κ-卡拉胶红外图谱；(B)经Cel-κ-CgsA300酶解后的κ- 卡拉胶红外图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：新型卡拉胶硫酸酯酶(Cel-κ-CgsA300)的异源表达及纯化

本发明通过对从麒麟菜分离的，具有高效降解卡拉胶功能的菌株Cellulophagalytica 519-2-1，利用细菌基因组DNA提取试剂盒，将Cellulophaga lytica 519-2-1菌株培养后提取基因组DNA，进行全基因组测序。对基因组进行分析，发现了编码硫酸酯蛋白家族基因该基因(命名为Cel-κ-CgsA300)核苷酸序列，长1455个碱基，编码含有484个氨基酸的蛋白质。其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

针对核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因设计引物，分别为519-2-1-300-F (5’-CGGGATCCATGAAAAGAAATTTTTTTTTTATTC-3’)和519-2-1-300-R (5’-ACGCGTCGACTTAGTTTTCTATTTTTTTATATCC-3’)，进行PCR扩增。扩增条件如下：94℃预变性3min，然后94℃ 30s，55℃30s，72℃ 50s，30次循环，最后在72℃下延伸8min，冷却至8℃。然后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与表达载体pET-28α用BamHI和SalI双酶切后纯化，用T4 DNA连接酶连接，转化到E.coli BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，获得可以产生卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300的工程菌株。

LB培养基液体(每升加入1000μl的100mg/ml卡那霉素)37℃培养12h 至OD₆₀₀达到0.4～0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂。在28℃、 160rpm/min条件下继续培养4h，离心收集细胞(8000rpm，10min)。菌体经20mM PBS悬浮后，超声破碎细胞，超声条件为：300W功率，超声破碎3s，暂停4s为一个循环，时间在15min。离心(4℃，10000rpm， 10min)收集上清液。采用His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)对酶进行纯化。纯化时使用不同浓度梯度的咪唑洗脱液进行洗脱，使用的咪唑洗脱液浓度梯度为0mM，10mM，20mM，40mM，80mM，100mM，120mM， 200mM和500mM，不同浓度咪唑洗脱液使用20mM pH 8.0PBS(500mM NaCl) 缓冲液稀释获得。结果发现100mM的咪唑可将目标蛋白洗脱下来，并获得单一条带。纯化后的Cel-κ-CgsA300经SDS-PAGE观察到一个表观分子量约为60kDa的单条带(图1)，与计算结果一致。

实施例2：卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300的酶学性质研究

以0.5％(w/v)κ-卡拉胶为底物，采用硫酸钡比浊法测定产物中硫酸基含量来表征酶活。

在37℃和pH 6.0的条件下，重组卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300的酶活最高(图2A和B)。在pH 5.0和8.0之间稳定，该酶作用的最佳底物浓度为0.4％(图2C)，当浓度高于0.4％时其活性急剧下降。该酶的活性在NaCl浓度为1.5％时表现出最大值，在NaCl浓度为5.5％时仍能保持70％以上的活力(图2D)。除Mn²⁺(1mM)对该酶有强烈的促进作用外，其他金属离子都对卡拉胶硫酸酯酶的活力表现出不同程度的抑制 (图2E)。

实施例3：卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)的异源表达及纯化

根据NCBI数据库公布Cellulophaga lytica DSM 7489^T全基因组数据(CP002534)，进行信息学分析，注释基因功能，找到编码氨基酸序列与本发明相似性高的硫酸酯酶(WP_013621368)基因序列，合成编码该基因序列，此序列长1455个碱基，编码含有484个氨基酸的蛋白质(氨基酸序列为SEQ ID NO:4，编码基因的序列为SEQ ID NO:3)。

卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)和本发明的卡拉胶硫酸酯酶 Cel-κ-CgsA300一共有8位氨基酸差异，具体差异如下：

第5位和第6位氨基酸，卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)为亮氨酸和异亮氨酸(LI)，卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300为苯丙氨酸和苯丙氨酸(FF)。

第44位和第45位氨基酸，卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)为赖氨酸和异亮氨酸(KI)，卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300为谷氨酸和蛋氨酸(EM)。

第173位和第174位氨基酸，卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)为天冬酰胺和亮氨酸(NL)，卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300为苏氨酸和赖氨酸(TK)。

第233位氨基酸，卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)为天冬酰胺(N)，卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300为天冬氨酸(D)。

第374位氨基酸，卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)为色氨酸(W)，卡拉胶硫酸酯酶Cel-κ-CgsA300为谷氨酸(E)。

将卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)的编码基因片段前后两段分别加上 BamHI和SalI酶酶切位点序列，合成基因片段(1473个碱基)(SEQ ID NO:5)。将该合成基因片段与表达载体pET-28α用BamHI和SalI双酶切后纯化，用T4 DNA连接酶连接，转化到E.coli BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，获得可以产生氨基酸序列为的卡拉胶硫酸酯酶的工程菌株。

LB培养基液体(每升加入1000μl的100mg/ml卡那霉素)37℃培养12h 至OD₆₀₀达到0.4～0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂。在28℃、 160rpm/min条件下继续培养4h，离心收集细胞(8000rpm，10min)。菌体经20mM PBS悬浮后，超声破碎细胞，超声条件为：300W功率，超声破碎3s，暂停4s为一个循环，时间在15min。离心(4℃，10000rpm， 10min)收集上清液。采用His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)对酶进行纯化。纯化时使用不同浓度梯度的咪唑洗脱液进行洗脱，使用的咪唑洗脱液浓度梯度为0mM，10mM，20mM，40mM，80mM，100mM，120mM， 200mM和500mM，不同浓度咪唑洗脱液使用20mM pH 8.0PBS(500mM NaCl) 缓冲液稀释获得。结果发现80mM的咪唑可将目标蛋白洗脱下来，并获得单一条带。纯化后的卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368)经SDS-PAGE观察到一个表观分子量约为60kDa的单条带，与计算结果一致。

在37℃和pH 6.0的条件下，重组卡拉胶硫酸酯酶(WP_013621368) 的酶活最高。在pH 6.0和8.0之间稳定，该酶作用的最佳底物浓度为0.3％，当浓度高于0.3％时其活性下降。该酶的活性在NaCl浓度为1％时表现出最大值，在NaCl浓度为5.5％时仍能保持50％以上的活力。除 Mn²⁺(1mM)对该酶有强烈的促进作用外，其他金属离子都对卡拉胶硫酸酯酶的活力表现出不同程度的抑制。

实施例4：利用硫酸酯酶(WP_013621368)和新型卡拉胶硫酸酯酶 (Cel-κ-CgsA300)对κ-卡拉胶进行脱硫比较

以0.5％(w/v)的κ-卡拉胶为底物，分别加入0.8U卡拉胶硫酸酯 (WP_013621368)和新型卡拉胶硫酸酯酶(Cel-κ-CgsA300)，置于37℃，pH 6.0 的条件下反应7个小时，冷冻干燥样品。采用硫酸钡比浊法测定产物中硫酸基含量，计算脱硫率。

卡拉胶硫酸酯(WP_013621368)和新型卡拉胶硫酸酯酶(Cel-κ-CgsA300) 的脱硫率分别为43.3％和75.8％。表明新型卡拉胶硫酸酯酶的脱硫效果更优于卡拉胶硫酸酯(WP_013621368)。

实施例5：卡拉胶硫酸酯酶(Cel-κ-CgsA300)降解κ-卡拉胶的产物分析

以0.5％(w/v)的κ-卡拉胶为底物，加入0.8U卡拉胶硫酸酯酶 (Cel-κ-CgsA300)，置于37℃，pH 6.0的条件下反应7个小时，然后煮沸5min，10000rpm离心10min，收集上清。向上清中加入等体积的无水乙醇，4℃静置2h 后离心，再向上清中加入等体积的无水乙醇，4℃静置2h后离心。将上清进行旋转浓缩并重悬后，真空冷冻干燥样品，采用傅立叶变换红外光谱仪进行红外广谱检测(图3中A和B)，从这两张谱图对比看，κ-卡拉胶在1200-1260cm^-1有较强的S＝O伸缩振动吸收峰，而酶解产物中该峰强度显著降低，说明酶解后硫酸基含量有明显降低。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 荣成市泓派海洋生物科技有限公司

<120> 一种新型卡拉胶硫酸酯酶

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Arg Asn Phe Phe Phe Ile Leu Leu Leu Thr Val Ala Ile Asn

1 5 10 15

Leu Asn Ala Gln Glu Lys Pro Asn Ile Ile Phe Leu Phe Ser Asp Asp

20 25 30

Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Gly Phe Gln Gly Ser Glu Met Met Lys Thr

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Lys Leu Ala Lys Ser Gly Ala Lys Phe Thr Gln Gly

50 55 60

Tyr Val Thr Asp Ala Thr Cys Gly Pro Ser Arg Ala Gly Leu Ile Thr

65 70 75 80

Gly Lys Tyr Gln Gln Arg Phe Gly Tyr Glu Glu Ile Asn Val Pro Gly

85 90 95

Tyr Met Ser Ala Asn Ser Lys Phe Leu Ala Asp Asp Met Gly Leu Pro

100 105 110

Leu Asp Gln Leu Thr Ile Ala Asp Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Tyr Lys

115 120 125

Thr Ala Met Tyr Gly Lys Trp His Leu Gly Asp Ala Asp Arg Tyr His

130 135 140

Pro Thr Lys Arg Gly Phe Asp Glu Phe Tyr Gly Phe Arg Gly Gly Ala

145 150 155 160

Arg Asn Tyr Phe Gly Tyr Asn Asp Val Ser Lys Ala Thr Lys Asp Asn

165 170 175

Arg Met Glu Arg Gly Phe Gly Asn Tyr Gln Glu Pro Thr Glu Tyr Val

180 185 190

Thr Asp Ala Leu Ala Lys Glu Ala Val Ser Phe Ile Glu Lys Asn Lys

195 200 205

Gly Asn Pro Phe Phe Ile Tyr Leu Ala Phe Asn Ala Val His Thr Pro

210 215 220

Met Gln Ala Thr Lys Glu Asp Leu Asp Lys Phe Pro Asn Leu Thr Gly

225 230 235 240

Lys Arg Lys Glu Leu Ala Ala Met Thr Leu Ala Leu Asp Arg Ala Cys

245 250 255

Gly Thr Val Leu Asn Lys Leu Lys Glu Leu Gly Leu Asp Lys Asn Thr

260 265 270

Ile Val Val Phe Ser Asn Asp Asn Gly Gly Pro Thr Asp Lys Asn Ala

275 280 285

Ser Leu Asn Leu Pro Leu Ser Gly Thr Lys Ser Asn His Leu Glu Gly

290 295 300

Gly Ile Arg Val Pro Phe Leu Ile Ser Trp Pro Lys Gln Ile Lys Ser

305 310 315 320

Lys Thr Val Tyr Asn Phe Pro Val Ser Thr Leu Asp Leu Leu Pro Thr

325 330 335

Phe Tyr Ala Ala Gly Gly Gly Asn Val Ala Asp Leu Lys Asp Ile Asp

340 345 350

Gly Val Asp Leu Leu Pro Tyr Ile Asn Gly Gln Asn Asn Ser Arg Pro

355 360 365

His Asn Thr Leu Phe Glu Lys Lys Glu Val Arg Leu Ala Tyr Arg Glu

370 375 380

Gly Asp Tyr Lys Leu Ile Arg Phe Ala Asp Arg Pro Ala Glu Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Leu Ser Thr Asp Ile Ala Glu Gln Asn Asn Ile Ala Tyr Lys His

405 410 415

Pro Glu Met Val Lys Ser Met Phe Lys Lys Met Phe Glu Trp Glu Ser

420 425 430

Ser Leu Gln Arg Pro Leu Trp Met Leu Lys Arg Ser Phe Glu Asn Tyr

435 440 445

Asp Ile Asp Arg Met Asp Arg Tyr Arg Thr Pro Glu Met Val Lys Lys

450 455 460

Glu Ile Glu Gln Tyr Ala Ile Pro Leu Lys Glu Ser Asn Gly Tyr Lys

465 470 475 480

Lys Ile Glu Asn

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaagaa attttttttt tattctacta ctaacagtag caattaacct aaatgcacaa 60

gaaaaaccaa atatcatttt cttgttttct gatgatgctg gttacgcaga ttttggtttt 120

caaggcagtg aaatgatgaa gactcctaac ttagataaac tagctaaatc tggagcaaag 180

tttacacaag gctatgtaac cgacgccact tgcgggccgt ctagagcagg cttaattaca 240

ggaaaatatc aacaacgctt tgggtatgaa gaaataaacg tgccaggtta tatgagtgca 300

aactctaaat ttttggcaga tgatatgggc ttacccttag accaattaac cattgcagat 360

tatttaaaaa aactagggta taaaactgct atgtacggca aatggcattt gggtgacgca 420

gaccgttacc accctaccaa aagaggtttt gatgagtttt acggatttag aggaggtgcc 480

cgtaattact ttggttacaa tgatgtttct aaagcaacca aagacaacag aatggaaaga 540

ggctttggta attaccaaga accaacagaa tacgtaacag atgcattagc caaagaagca 600

gtttcattta ttgaaaaaaa taaaggcaat ccatttttta tttatttagc ctttaatgca 660

gtacacacac caatgcaagc cacaaaagaa gacctagata aatttcctaa tttaacagga 720

aaacgaaaag aattagccgc tatgacttta gccttagata gggcttgtgg cactgtttta 780

aacaagttaa aggaacttgg tttagacaaa aatacaattg ttgttttctc taacgacaat 840

ggcggaccta cagataaaaa tgcatcatta aacctaccac taagcggcac aaaatctaac 900

catttagaag gcggcattag agttcccttt ttaataagtt ggccaaaaca aataaagtct 960

aaaactgtat acaattttcc ggtaagcaca ctagatttac tccctacttt ttatgcagca 1020

ggtggtggca atgttgcaga tttaaaagat atagatggtg ttgatttact gccgtacatt 1080

aacggacaaa acaacagcag accacacaat actttattcg agaaaaaaga agtacgctta 1140

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aatttatcta cagacattgc agagcaaaac aatatagcat ataaacatcc agaaatggta 1260

aagtctatgt ttaaaaaaat gtttgaatgg gaatctagcc ttcaacgtcc attatggatg 1320

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<210> 3

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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ggctttggta attaccaaga accaacagaa tacgtaacag atgcattagc caaagaagca 600

gtttcattta ttgaaaaaaa taaaggcaat ccatttttta tttatttagc ctttaatgca 660

gtacacacac caatgcaagc cacaaaagaa gacctaaata aatttcctaa tttaacagga 720

aaacgaaaag aattagccgc tatgacttta gccttagata gggcttgtgg cactgtttta 780

aacaagttaa aggaacttgg tttagacaaa aatacaattg ttgttttctc taacgacaat 840

ggcggaccta cagataaaaa tgcatcatta aacctaccac taagcggcac aaaatctaac 900

catttagaag gcggcattag agttcccttt ttaataagtt ggccaaaaca aataaagtct 960

aaaactgtat acaattttcc ggtaagcaca ctagatttac tccctacttt ttatgcagca 1020

ggtggtggca atgttgcaga tttaaaagat atagatggtg ttgatttact tccgtacatt 1080

aacggacaaa acaacagcag accacacaat actttattct ggaaaaaaga agtacgctta 1140

gcttatagag aaggtgacta taaattaata agatttgcag atagacctgc agagttgtat 1200

aatttatcta cagacattgc agagcaaaac aatatagcat ataaacatcc agaaatggta 1260

aagtctatgt ttaaaaaaat gtttgaatgg gaatctagcc ttcaacgtcc attatggatg 1320

cttaaaaggt cttttgaaaa ttatgacata gaccgtatgg accgttacag aaccccagaa 1380

atggttaaaa aagaaataga acaatacgcc atccctttaa aagaaagtaa tggatataaa 1440

aaaatagaaa actaa 1455

<210> 4

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Arg Asn Leu Ile Phe Ile Leu Leu Leu Thr Val Ala Ile Asn

1 5 10 15

Leu Asn Ala Gln Glu Lys Pro Asn Ile Ile Phe Leu Phe Ser Asp Asp

20 25 30

Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Gly Phe Gln Gly Ser Lys Ile Met Lys Thr

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Lys Leu Ala Lys Ser Gly Ala Lys Phe Thr Gln Gly

50 55 60

Tyr Val Thr Asp Ala Thr Cys Gly Pro Ser Arg Ala Gly Leu Ile Thr

65 70 75 80

Gly Lys Tyr Gln Gln Arg Phe Gly Tyr Glu Glu Ile Asn Val Pro Gly

85 90 95

Tyr Met Ser Ala Asn Ser Lys Phe Leu Ala Asp Asp Met Gly Leu Pro

100 105 110

Leu Asp Gln Leu Thr Ile Ala Asp His Leu Lys Lys Leu Gly Tyr Lys

115 120 125

Thr Ala Met Tyr Gly Lys Trp His Leu Gly Asp Ala Asp Arg Tyr His

130 135 140

Pro Thr Lys Arg Gly Phe Asp Glu Phe Tyr Gly Phe Arg Gly Gly Ala

145 150 155 160

Arg Asn Tyr Phe Gly Tyr Asn Asp Val Ser Lys Ala Asn Leu Asp Asn

165 170 175

Arg Met Glu Arg Gly Phe Gly Asn Tyr Gln Glu Pro Thr Glu Tyr Val

180 185 190

Thr Asp Ala Leu Ala Lys Glu Ala Val Ser Phe Ile Glu Lys Asn Lys

195 200 205

Gly Asn Pro Phe Phe Ile Tyr Leu Ala Phe Asn Ala Val His Thr Pro

210 215 220

Met Gln Ala Thr Lys Glu Asp Leu Asn Lys Phe Pro Asn Leu Thr Gly

225 230 235 240

Lys Arg Lys Glu Leu Ala Ala Met Thr Leu Ala Leu Asp Arg Ala Cys

245 250 255

Gly Thr Val Leu Asn Lys Leu Lys Glu Leu Gly Leu Asp Lys Asn Thr

260 265 270

Ile Val Val Phe Ser Asn Asp Asn Gly Gly Pro Thr Asp Lys Asn Ala

275 280 285

Ser Leu Asn Leu Pro Leu Ser Gly Thr Lys Ser Asn His Leu Glu Gly

290 295 300

Gly Ile Arg Val Pro Phe Leu Ile Ser Trp Pro Lys Gln Ile Lys Ser

305 310 315 320

Lys Thr Val Tyr Asn Phe Pro Val Ser Thr Leu Asp Leu Leu Pro Thr

325 330 335

Phe Tyr Ala Ala Gly Gly Gly Asn Val Ala Asp Leu Lys Asp Ile Asp

340 345 350

Gly Val Asp Leu Leu Pro Tyr Ile Asn Gly Gln Asn Asn Ser Arg Pro

355 360 365

His Asn Thr Leu Phe Trp Lys Lys Glu Val Arg Leu Ala Tyr Arg Glu

370 375 380

Gly Asp Tyr Lys Leu Ile Arg Phe Ala Asp Arg Pro Ala Glu Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Leu Ser Thr Asp Ile Ala Glu Gln Asn Asn Ile Ala Tyr Lys His

405 410 415

Pro Glu Met Val Lys Ser Met Phe Lys Lys Met Phe Glu Trp Glu Ser

420 425 430

Ser Leu Gln Arg Pro Leu Trp Met Leu Lys Arg Ser Phe Glu Asn Tyr

435 440 445

Asp Ile Asp Arg Met Asp Arg Tyr Arg Thr Pro Glu Met Val Lys Lys

450 455 460

Glu Ile Glu Gln Tyr Ala Ile Pro Leu Lys Glu Ser Asn Gly Tyr Lys

465 470 475 480

Lys Ile Glu Asn

<210> 5

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccat gaaaagaaat ttaattttta ttctactact aacagtagca attaacctta 60

atgcacaaga aaaaccaaat atcattttct tgttttctga tgatgctggt tacgcagatt 120

ttggttttca aggcagtaaa ataatgaaga ctcctaactt agataaacta gctaaatctg 180

gagcaaagtt tacacaaggc tatgtaaccg acgccacttg cgggccgtct agagcaggct 240

taattacagg aaaataccaa caacgctttg ggtatgaaga aataaacgtg ccaggttata 300

tgagtgcaaa ctctaaattt ttggcagatg atatgggctt acccttagac caattaacca 360

ttgcagatca tttaaaaaaa ctagggtata aaactgctat gtacggcaaa tggcatttgg 420

gtgacgcaga ccgttaccac cctaccaaaa gaggttttga tgagttttac ggatttagag 480

gaggtgcccg taattacttt ggttacaatg atgtttctaa agcaaactta gacaacagaa 540

tggaaagagg ctttggtaat taccaagaac caacagaata cgtaacagat gcattagcca 600

aagaagcagt ttcatttatt gaaaaaaata aaggcaatcc attttttatt tatttagcct 660

ttaatgcagt acacacacca atgcaagcca caaaagaaga cctaaataaa tttcctaatt 720

taacaggaaa acgaaaagaa ttagccgcta tgactttagc cttagatagg gcttgtggca 780

ctgttttaaa caagttaaag gaacttggtt tagacaaaaa tacaattgtt gttttctcta 840

acgacaatgg cggacctaca gataaaaatg catcattaaa cctaccacta agcggcacaa 900

aatctaacca tttagaaggc ggcattagag ttcccttttt aataagttgg ccaaaacaaa 960

taaagtctaa aactgtatac aattttccgg taagcacact agatttactc cctacttttt 1020

atgcagcagg tggtggcaat gttgcagatt taaaagatat agatggtgtt gatttacttc 1080

cgtacattaa cggacaaaac aacagcagac cacacaatac tttattctgg aaaaaagaag 1140

tacgcttagc ttatagagaa ggtgactata aattaataag atttgcagat agacctgcag 1200

agttgtataa tttatctaca gacattgcag agcaaaacaa tatagcatat aaacatccag 1260

aaatggtaaa gtctatgttt aaaaaaatgt ttgaatggga atctagcctt caacgtccat 1320

tatggatgct taaaaggtct tttgaaaatt atgacataga ccgtatggac cgttacagaa 1380

ccccagaaat ggttaaaaaa gaaatagaac aatacgccat ccctttaaaa gaaagtaatg 1440

gatataaaaa aatagaaaac taagtcgacg cgt 1473

Claims

1.一种卡拉胶硫酸酯酶，其特征在于，所述的卡拉胶硫酸酯酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)在1)的序列为SEQ ID NO:1的氨基酸上取代、缺失、添加一个或数个氨基，且具有1)中所述酶的酶学性质的硫酸酯酶。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的卡拉胶硫酸酯酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有编码权利要求1所述的卡拉胶硫酸酯酶的基因。

5.一种重组宿主，其特征在于，所述的重组宿主用于重组表达权利要求1所述的卡拉胶硫酸酯酶。

6.权利要求1所述的卡拉胶硫酸酯酶在制备高凝胶强度κ-卡拉胶中的应用。

7.一种制备高凝胶强度κ-卡拉胶的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求1所述的卡拉胶硫酸酯酶来酶解κ-卡拉胶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)底物配制：将κ-卡拉胶原料与水混合，配制成浓度为0.4％-0.5％的pH值为6.0的酶解底物溶液；

2)酶解：使用权利要求1所述的卡拉胶硫酸酯酶进行酶解，加酶量为0.8U，反应在37℃，pH 6.0的条件下反应7个小时；酶解结束后，酶解产物即为高凝胶强度κ-卡拉胶。