CN103881995B - 一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶 - Google Patents

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Abstract

本发明的提供一种新的β-琼胶酶及其应用，即一种能够专一性降解琼脂糖产生新琼四糖的β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1；用于编码上述β-琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO:2。本发明的β-琼胶酶用于降解琼脂糖制备新琼四糖。本发明的β-琼胶酶能够专一性降解琼脂糖产生唯一产物—新琼四糖，因此可以用于高纯度新琼四糖的制备；该酶对于琼脂糖48小时的转化率大于90%，其中新琼四糖纯度高于95%，具有很好的工业应用前景。

Description

一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶
技术领域
本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶及其应用。
背景技术
琼胶主要是石花菜、江篱、鸡毛菜等红藻提取出来的一种多糖，由琼脂糖（agarose）和琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖能够被琼胶酶水解生成琼胶寡糖，具有良好的清除自由基、抑制诱导型NO合成酶和促进益生菌生长等功能，在食品和医药行业有广泛应用。而且，琼胶寡糖的功能活性与其聚合度有密切关系。聚合度在二至四的琼胶寡糖可以抑制肿瘤坏死因子、过量NO自由基以及前列腺素E2(PGE2)的产生；六至八糖是藻类防御体系中重要的激发子。可见，不同聚合度的琼胶寡糖功能活性和应用范围相差很大，因此获得特定聚合度的琼胶寡糖具有重要意义。
传统制备琼胶寡糖的方法采用化学法，反应条件比较剧烈，专一性差；而酶法制备具有反应条件温和、催化效率高、过程易于控制等优点。然而，利用酶法制备琼胶寡糖的研究大多处于实验室阶段，一方面由于酶活性和稳定性等指标未达到工业化要求；另一方面关键问题是难以获得高专一性的琼胶酶。至今为止大部分的β-琼胶酶都产生多种（2种以上）聚合度的新琼寡糖混合产物，不能产生单一聚合度的寡糖，因此，获得能够专一性降解琼脂糖生成特定聚合度琼胶寡糖的β-琼胶酶，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的β-琼胶酶及其应用，即一种能够专一性降解琼脂糖产生新琼四糖的β-琼胶酶，从而弥补现有技术的不足。
本发明的β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；
用于编码上述β-琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:2；
本发明还提供重组表达载体，用于在宿主细胞中重组表达上述β-琼胶酶；
本发明的β-琼胶酶用于降解琼脂糖制备新琼四糖。
本发明的β-琼胶酶能够专一性降解琼脂糖产生唯一产物——新琼四糖，因此可以用于高纯度新琼四糖的制备；该酶对于琼脂糖48小时的转化率大于90%，其中新琼四糖纯度高于95%，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1：AgWH50B不同温度下相对酶活图；
图2：AgWH50B不同pH下相对酶活图；
图3：不同AgWH50B水解产物的TLC分析；
图4：AgWH50B水解产物质谱图；
其中最高解离峰位669，为新琼四糖结合钾离子的离子峰（630Da+39Da）；解离峰位653为新琼四糖结合钠离子的离子峰（630Da+23Da）。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
对于本发明所涉及的术语解释如下：
1、β-琼胶酶：糖苷水解酶(E.C.3.2.1.81)，一类能够降解琼脂糖的β-1,4糖苷键的酶，其产物为以D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖。
2、新琼四糖：两种单糖L-3，6-脱水半乳糖（AHG）和D-半乳糖（D-Gal）α-1,3键和β-1,3键连接形成的聚合度为4的新琼寡糖。
实施例1β-琼胶酶基因agWH50B的克隆
用简并引物PCR以及巢式PCR克隆淡黄色噬琼胶菌WH0801（NRRLB-59247(T)或CGMCC1.10131(T)）中的β-琼胶酶基因agWH50B。具体操作：在2216E海水培养基中培养淡黄色噬琼胶菌WH0801直到对数末期，提取DNA基因组。利用简并引物（5′-HTRCCNAAYCAYHTRTAYHTRGGN-3’;5’-VACRAARCCVACRTTRTARTTTTC-3′），以基因组为模板,条件为：94℃5分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃3分钟3个步骤进行30个循环，进行PCR，得到了产物为β-琼胶酶基因的片段，再以片段末端序列设计引物，进行一次三轮的巢式PCR回收其中大小在500Kb-2000Kb的PCR产物片段(利用takara公司染色体步移试剂盒)。其中各步骤中的PCR产物均连接T-A克隆载体后转化DH5α挑去单克隆测序。最后拼接最初的片段和巢式PCR所得基因片段，得到β-琼胶酶基因的全长序列。测序表明基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1。全长序列以全长序列上游引物和下游引物5′-CCGGAATTCATGACATTTACTAAAAGC-3′;5′-CGAGCTCTTTTTTTTGTAACGCAG-3′）鉴定，结果表明获得的序列拼接正确。基因agWH50B和NCBI中已知基因相比对，同来源于Agarivoranssp.QM38全基因组测序的某琼胶酶基因有着最高的相似性为73%。说明在序列上agWH50B为一个全新的基因。
实施例2含β-琼胶酶基因agWH50B表达质粒pETB的构建
根据已经得到的β-琼胶酶基因的全长序列设计基因的上游引物和下游引物（见实施例1），以淡黄色噬琼胶菌WH0801的基因组为模板，利用PCR扩增得到β-琼胶酶基因的全长序列。条件为94℃2分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃3分钟，30个循环最后72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳显示在2.8Kb的位置有明显单一条带，将单一条带切胶回收，测序结果表明实施例1拼接获得的序列没有错误。将回收的条带用EcoRI和SacI双酶切，将表达载体pET21a也用EcoRI和SacI双酶切，然后PCR产物和酶切载体都利用试剂盒进行DNA纯化。然后进行DNA连接反应。连接结束后，按照标准的氯化钙法热激转化将重组质粒转入DH5α，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用EcoRI和SacI双酶切，凝胶电泳条带显示为2.9Kb和5.3Kb两条清晰条带和β-琼胶酶基因全长和质粒长度相对应。证明β-琼胶酶基因全长序列已经克隆到表达载体中，将此重组质粒命名为pETB。
实施例3高效表达β-琼胶酶基因agWH50B的工程菌pETB/BL21的构建
将表达载体质粒pETB按照标准氯化钙热激转化转入大肠杆菌BL21（DE3）中，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用EcoRI和SacI双酶切，凝胶电泳条带显示为2.9Kb和5.3Kb两条清晰条带和β-琼胶酶基因全长和质粒长度相对应。证明含有β-琼胶酶基因的表达载体质粒pETB已经转入大肠杆菌BL21（DE3）。
实施例4利用大肠杆菌工程菌pETB/BL21制备重组β-琼胶酶
挑取大肠杆菌重组株pETB/BL21单克隆接种在5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，230RPM培养12小时。按1:100转接入100ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基。37℃培养OD值600到0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养8小时，4℃，8000g离心10分钟，细胞重悬于20mMpH=8.0Tirs-盐酸缓冲液，将菌悬液置于冰上，超声破碎15分钟，12000g15分钟除去不可溶成分，上清过0.22μm滤膜，上亲和层析柱fastflowhis*6（GE），然后用冲洗缓冲液1ml+1ml和洗脱缓冲液0.5ml*4冲洗柱子6次，将得到的溶液分别SDS-PAGE检测，寻找目的蛋白洗脱液，合并含有单一目的条带的洗脱液。用Lowry法测定蛋白浓度。终浓度约为0.3mg/ml。
实施例5本发明的β-琼胶酶的酶学性质分析
在20℃-70℃温度下先将含有0.2%低溶点琼脂糖pH6.0的水溶液990μl温浴10min,加入同样温度温浴的10μlβ-琼胶酶AgWH50B溶液（0.3mg/ml）。反应1小时。结果如图1所示，AgWH50B的最适反应温度为40℃。在pH4-10之间用3种缓冲液体系测定pH对β-琼胶酶AgWH50A水解反应的影响，先将含有0.2%低溶点琼脂糖对应的水溶液990μl30℃温浴10min，加入同样温度温浴的10μlβ-琼胶酶AgWH50B溶液（0.3mg/ml）。反应1小时。结果如图2所示，AgWH50B的最适反应pH为7。
实施例6利用重组β-琼胶酶生产新琼四糖
利用实施例4制备的重组β-琼胶酶制备新琼寡糖，将琼脂糖溶于pH=7.0的磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液（0.05M/ml），配置成0.1-0.5%的溶液。按重量比0.1-1:100加入重组琼胶酶溶液。混合均匀后在40℃温浴12-48小时。浓缩至小于10ml加入3倍体积乙醇，除去未分解琼脂糖，溶液冻干，为新琼四糖。本发明的β-琼胶酶具有良好的生物催化活性，经过薄层层析TLC分析（图3）和基质辅助激光分析飞行时间质谱分析（图4）表明：相对其它已知的β-琼胶酶其特点为在反应过程中从始至终均只有单一的新琼四糖产生，这使得其产物中掺杂其他聚合度的新琼寡糖的量非常少，其产物新琼四糖纯度>95%，转化率约为90%。本发明的β-琼胶酶其最适反应温度为40℃，最适pH为7.0，反应条件温和，对环境污染少，这些特点使得本发明的β-琼胶酶具有生产新琼四糖的工业应用潜力。

Claims (6)

1.一种β-琼胶酶，其特征在于，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.一种基因，所述的基因用于编码权利要求1所述的β-琼胶酶，其核苷酸序列为SEQIDNO:2。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的β-琼胶酶。
4.一种转化体，其特征在于，所述的转化体携带有权利要求3所述的重组表达载体。
5.权利要求1所述的β-琼胶酶在降解琼脂糖制备新琼四糖中的应用。
6.一种制备新琼四糖的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的β-琼胶酶降解琼脂糖来制备新琼四糖，其中反应的温度为40℃，pH为7.0。
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