CN108715841B

CN108715841B - 一种产3,6-内醚-l-半乳糖的固定化酶

Info

Publication number: CN108715841B
Application number: CN201810572993.8A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 王其东; 孙建安; 刘振; 黄文灿; 张斌
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-06-06
Also published as: CN108715841A

Abstract

本发明提供一种产3,6‑内醚‑L‑半乳糖的固定化酶，是将α‑新琼二糖水解酶和能将琼脂糖降解为新琼四糖的蛋白酶固定于固定化酶载体上而制备的，所述的α‑新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。本发明所提供的固定化酶用于降解琼脂糖来制备3,6‑内醚‑L‑半乳糖或琼三糖。本发明解决了游离酶在工业化应用中存在的一些问题，制备了热稳定性更好、操作稳定性更高的固定化酶，提高了L‑AHG和琼三糖的产率，降低了琼胶寡糖的生产成本。实现了β‑琼胶酶和α‑新琼二糖水解酶两种不同琼胶酶的双酶共固定化，实现了在同一反应器中一步法快速、简便制备L‑AHG和琼三糖，为工业化制备L‑AHG和琼三糖奠定了基础。

Description

一种产3,6-内醚-L-半乳糖的固定化酶

技术领域

本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种产3,6-内醚-L-半乳糖的固定化酶。

背景技术

琼胶寡糖是通过降解琼胶得到的一类低分子量的生物活性物质，一般具有抗炎、抗氧化、美白等功能，在食品、药品、化妆品等领域有着广泛的潜在应用价值。3,6-内醚-L-半乳糖L-AHG对琼胶寡糖的生物活性起着至关重要的作用，但是，市面上并没有L-AHG纯品的售卖。目前，琼胶寡糖的制备方法主要有化学法、酶法、化学与酶结合法。生物酶法制备琼胶寡糖具有高度特异性、高效性，不会产生副产物，然而琼胶酶的成本昂贵，给琼胶寡糖的工业化制备带来了很大障碍。因此，如何通过固定化技术避免游离酶的缺陷，改善酶的热稳定性、操作稳定性，使用可以重复循环，并且利用共固定化手段实现L-AHG的一步法制备，这对琼胶寡糖及L-AHG的工业化制备及应用有着重大意义。

发明内容

本发明提供一种产3,6-内醚-L-半乳糖的固定化酶，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的固定化酶，是将α-新琼二糖水解酶和能将琼脂糖降解为新琼四糖的蛋白酶固定于固定化酶载体上而制备的.

所述的α-新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3；

所述的能将琼脂糖降解为新琼四糖的蛋白酶，为β-琼胶酶，其一种氨基酸序列为SEQ ID NO:5；

所述的固定化酶载体，为磁性纳米材料；

本发明所提供的固定化酶用于降解琼脂糖来制备3,6-内醚-L-半乳糖或琼三糖。

本发明解决了游离酶在工业化应用中存在的一些问题，制备了热稳定性更好、操作稳定性更高的固定化酶，提高了L-AHG和琼三糖的产率，降低了琼胶寡糖的生产成本。实现了β-琼胶酶和α-新琼二糖水解酶两种不同琼胶酶的双酶共固定化，实现了在同一反应器中一步法快速、简便制备L-AHG和琼三糖，为工业化制备L-AHG和琼三糖奠定了基础。

附图说明

图1：各待筛选突变体位点的热稳定性结果图；

图2：K134D和原始酶的热稳定性曲线图；

图3：K134D和原始酶不同温度下酶失活实验结果图；

图4：AgWH117原始酶A和突变体K134D最适温度曲线图；

图5：AgWH117原始酶A和突变体K134D最适pH曲线图；

图6：固定化材料及固定化酶的傅里叶红外变换光谱图，其中(a)K134D酶，(b)K134D-AgWH50B酶；

图7：共固定化酶K134D AgWH50B-CC-Fe3O4@SiO2反应产物的薄层层析图；

图8：共固定化酶的最适反应温度图；

图9：共固定化酶与游离酶反应产物对比图

图10：L-AHG和琼三糖纯化的薄层层析分析图；

图11：琼三糖的高效液相色谱分析图。

具体实施方式

游离的α-新琼二糖水解酶AgaWH117热稳定性差，固定化在一定程度上提高了其耐热性，但是，其在最适反应温度下，仍不能长时间保持酶活力的稳定，这阻碍了其工业化的应用。因此，本发明将α-新琼二糖水解酶AgaWH117进行改造，获得了一种热稳定性更高的α-新琼二糖水解酶K134D来取代AgaWH117，用于3，6-内醚-L-半乳糖的制备。而且，目前制备3，6-内醚-L-半乳糖所采用的化学法、化学法与酶结合法、酶法，这些方法均是通过多步骤反应产生3，6-内醚-L-半乳糖，反应步骤繁杂。再者，不管是AgWH50B还是AgaWH117，在固定化效果达到最佳时，固定化材料表面的TCT基团并没有达到饱和，酶蛋白可以继续结合上去。因此，我们考虑将α-新琼二糖水解酶K134D与β-琼胶酶AgWH50B共固定化在CC-Fe₃O₄@SiO₂上，实现在同一反应器中利用生物酶法一步制得3，6-内醚-L-半乳糖，且酶可重复利用，降低了生产成本，绿色环保。

本发明所使用的试剂如下：

1、菌株

本实验室构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET21a-agWH50B。

2、培养基

Luria-Bertani培养基：10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0g NaCl，加900mL去离子水溶解，用5mol/L NaOH调至pH 7.0，用去离子水定容至1L。

20×P：Na₂HPO₄ 14.2g(1mol/L)，KH₂PO₄ 13.6g(1mol/L)，(NH₄)₂SO₄6.6g(0.5mol/L)，蒸馏水溶解定容至100mL。

50×5052：甘油25mL(25.0％)，葡萄糖2.5g(2.5％)，α-乳糖10.0g(10.0％)，蒸馏水溶解定容至100mL。

500×MgSO₄：MgSO₄ 12.0g加少量蒸馏水溶解后定容至100mL。

ZYP-5052培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，加适量蒸馏水溶解，然后加入50mL20×P，2mL 500×MgSO₄(以上配制好的培养基，在121℃条件下，灭菌20min)，20mL 50×5052(在115℃条件下，灭菌30min，在超净台中加入)，定容至1L。

3、溶液的配制

50.0mg/mL氨苄霉素钠溶液(10mL)：称取500.0mg氨苄霉素钠粉末，溶解并定溶于10mL超纯水中，在超净台中用0.22μm除菌滤头除菌分装，-20℃长期保存。

DNS溶液配制^[119]：称取3，5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯)，加水500mL去离子水，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL 0.2g/mL的NaOH溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意：在加入NaOH溶液过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水合酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.5g和无水亚硫酸钠2.5g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用去离子水定容至1L。用砂芯漏斗过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。

考马斯亮蓝G-250的配制：称取100.0mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL 95.0％(v/v)的乙醇中，再加入100mL 85.0％(v/v)的磷酸中混合均匀，然后再用蒸馏水定容至1L。贮存棕色瓶中，常温可保存1个月。

0.2mol/L磷酸二氢钠：NaH₂PO₄·H₂O 27.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。

0.2mol/L磷酸氢二钠：Na₂HPO₄·12H₂O 71.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。

缓冲液A：配制pH 7.6的磷酸盐缓冲液，再加入甘油和NaCl，配制成含有500mmol/LNaCl、10％甘油的20mmol/L pH 7.6磷酸盐缓冲液。

缓冲液B：含有500mmol/L NaCl、10％甘油、500mmol/L咪唑的20mmol/L pH 7.6的磷酸盐缓冲液。

1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)：称取18.2g Tris粉末溶于蒸馏水中，用盐酸溶液调pH至8.9，蒸馏水定容至100mL。

1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.7)：称取18.2g Tris粉末溶于蒸馏水中，用盐酸溶液调pH至6.7，蒸馏水定容至100mL。

30.0％丙烯酰胺溶液：称取29.0g丙烯酰胺和1.0g甲叉双丙烯酰胺，溶于蒸馏水，定容至100mL，4℃保存1个月。

10.0％过硫酸铵溶液：称取1.0g过硫酸铵溶于10mL蒸馏水中，-20℃保存。

10.0％SDS溶液：称取10.0g SDS粉末溶于蒸馏水中，定容至100mL。

10×SDS-PAGE电泳缓冲液配制：30.2g Tris+188.0g甘氨酸+10.0g SDS+800mL水溶解，定容至1L，常温保存。

SDS-PAGE电泳胶染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶在250mL脱色液中，将蛋白胶放入染色液中，加热至60℃，染色30min。

SDS-PAGE电泳胶脱色液：250mL 95.0％乙醇+80mL冰乙酸，用蒸馏水定容至1L。

反应底物的配制：称取0.3g低熔点琼脂糖，加热溶于100mL pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液中，待用。

4、所使用的固定化材料为NH₂和TCT修饰二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒四氧化三铁磁性纳米颗粒，其一种具体制备方法如下：

1、四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备

(1)12.5g FeCl₂·4H₂O+34.0g FeCl₃·6H₂O+1L超纯水，在60℃N₂氛围条件下，反应5min。

(2)再加60mL 25.0％NH₃·H₂O，剧烈搅拌反应40min。

(3)颜色大量变黑后，通过磁铁分离。

(4)超纯水洗3次，再用无水乙醇洗3次，室温、真空干燥。

2、二氧化硅包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒

(1)1.45g Fe₃O₄+400mL无水乙醇，恒定N₂流，超声40min悬浮分散。

(2)加60mL超纯水、30mL 25.0％NH₃·H₂O，搅拌10min后，再加4mL TEOS，室温，搅拌5h。

(3)无水乙醇洗3次，超纯水洗3次，室温、真空干燥。

3、NH₂和TCT修饰二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒(CC-Fe₃O₄@SiO₂)

(1)1.0g MNPs+30mL APTES+20mL无水乙醇，室温反应2h。

(2)然后，加热至50℃，反应1.5h。

(3)通过外磁力分离，依次用无水乙醇和THF洗3次。

(4)获得的NPS+4.0g三氯三嗪+100mL THF，室温反应3h。

(5)依次用THF、无水乙醇、超纯水各清洗3次。

(6)室温、真空干燥。

5、酶活的检测条件

游离酶：取10μL酶液加入190μL 0.3％琼脂糖溶液混合，形成0.2mL反应体系，在分析条件下反应30min，沸水浴10min灭酶，再加入0.3mL DNS溶液，沸水浴5min，冷水浴停止反应，补加1mL蒸馏水；对照组：10μL灭活后的酶液+190μL 0.3％琼脂糖溶液，其它条件与实验组一样。每个实验组做3个平行，在540nm条件下，测定吸光值。

固定化酶：在每管固定化酶(10.0mg)中加入400μL 0.3％琼脂糖溶液混合，在分析条件下反应30min，磁分离取出反应液，取200μL反应液，再加入0.3mL DNS溶液，沸水浴5min，冷水浴停止反应，补加1mL蒸馏水；对照组：10.0mg固定化材料+400μL 0.3％琼脂糖溶液，其它条件与实验组一样。每个实验组做3个平行，在540nm条件下，测定吸光值。

酶活定义：在标准分析条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：热稳定性提高的新琼二糖水解酶的筛选

1、AgWH117A酶蛋白突变蛋白的筛选

通过分析AgWH117A酶蛋白中各个氨基酸的电荷分布引起的吉布斯自由能变化ΔGqq，从而衡量氨基酸的电荷分布对酶稳定性的影响。通过计算AgWH117A酶蛋白中各个氨基酸的ΔGqq，排除自由能较小的氨基酸位点。同时考虑到活性位点的氨基酸改变有极大可能性引起失活，因此也排除活性位点氨基酸。再者处于Loop环上的氨基酸对蛋白质折叠起关键作用，所以回避Loop环上的氨基酸。最终将剩下的氨基酸位点进行丙氨酸扫描以确定点定点饱和突变的氨基酸残基位点(表1)。

表1：部分选定的氨基酸突变位点

最后选取的氨基酸位点为56Lys、61Tyr、62His、94His、134Lys、136Tyr、139Tyr、201His、216Tyr、218Tyr、268His。对这些位点进行丙氨酸扫描实验，将其分别突变成为丙氨酸Ala并检测各个突变子在40℃下的热稳定性。

结果表明，AgWH117A原始酶和各突变子在40℃水浴中保温20min，通过比较原始酶和突变,的热稳定性可见，除Y261突变为丙氨酸后出现酶活消失的情况外，其余突变子都仍然保留有降解新琼二糖的能力。但是总体而言，突变子的酶活都有着不同程度的变化。除K134A突变子外，其他突变子的酶活都降低了，而且半数以上下降程度十分明显。突变子K134A初始酶活提高了约4％，并且保温20min后，仍保留有约24％的初始酶活，总体而言热稳定性也有着轻微幅度的提高。而这里值得注意的是突变子Y61A，虽然它的初始酶活只有原始酶的69％，但是在40℃保温20min后，其残余酶活是要明显高于原始酶和突变子K134A，这说明其热稳定性有所增强(图1)。

AgWH117A、Y61A和K134A在40℃下的半衰期分别为11min、9.5min和12min，其中K134A的半衰期比原始酶提高了9.1％。本实验初衷是筛选得到热稳定性提高并且酶活水平不受影响甚至有所提高的突变子，因此综上所述Y61和K134位点作为潜在的具有进一步研究意义的位点而成为接下来实验的研究对象。

2、定点突变

为了进一步考量这两个位点对新琼二糖水解酶AgWH117A(氨基酸序列为SEQ IDNO:1,编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2)的热稳定性及酶活的影响，分别对这两个突变位点进行了定点饱和突变实验。同样考量了各个突变子和原始酶在40℃下的酶活和热稳定性情况，结果表明Y61位氨基酸残基的改变对该酶活性的影响很大，除了Y61W酶活接近野生型的原始酶活以外，其余突变子的酶活均低于原始酶的80％，特别是Y61K、Y61R、Y61G、Y61Q、Y61M、Y61C酶活甚至低于原始酶的60％。而在热稳定性方面，该氨基酸残基的改变除了变成丙氨酸外，并没有筛选得到预想中的突变子能够明显提高该酶的热稳定性。而反观K134位点饱和突变结果，突变子酶活改变幅度均较小，有部分突变子的酶活要略高于原始酶的酶活，分别是K134D、K134N、K134M和K134A，其中突变子K134D的酶活最高，比原始酶酶活提高15％。而且让人欣喜的K134D表现出来的热稳定性也要明显优于原始酶AgWH117A。为了更为直观地比较突变子K134D和原始酶，分别检测了两者在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下的保持10min、20min、30min、40min后的酶活变化情况，结果如图2所示。

从图2中可见无论是原始酶AgWH117A还是突变子K134D(氨基酸序列为SEQ ID NO:3,编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4)在各个温度下孵育，酶活均随着时间延长而明显降低，并且孵育温度越高，酶失活越迅速。而比较原始酶和突变子的酶活变化情况可知，K134D在各温度下的稳定性均明显优于原始酶。以40℃为例，当原始酶在该温度孵育30min后，该酶的酶活将基本丧失，也就是呈失活状态，但是突变子K134D仍然可以保留约25％的酶活水平，并且将保温时间延长到40min，K134D依然可以检测到其水解新琼二糖的能力。如图3所示，原始酶AgWH117A的半衰温度T50为42.5℃，突变子K134D的T50值则提高了2.5℃。以50℃为例，孵育10min后，原始酶的活性大幅度下降仅剩10％左右，而突变子K134D残留活性仍大于原始酶活的25％，耐高温能力显著高于来自菌株Vibrio sp.Strain JT0107的α-新琼寡糖水解酶。AgWH117A和K134D在45℃和50℃下的半衰期t1/2分别为8.5min、10min和6.5min、7.5min，分别提高了17.6％、15.4％。可见K134D的确在热稳定性和酶活水平上相比较原始酶有了较大的提高。

在筛选得到突变子K134D的基础上，对其进行了最适反应温度和最适反应pH的测定，如图4和5所示；突变子K134D的最适反应温度较原始酶提高了3℃左右，由最初的27℃上升到30℃。温度在35℃以下时酶活变化缓慢，曲线趋势平缓。K134D和原始酶的最适pH在6.0左右，pH的适应范围比较广，在pH5.0到8.0之间酶活均可保持在80％以上。

在确定了酶的最适反应条件之后，检测了K134D的部分动力学参数。通过固定酶量，持续提高底物新琼二糖的浓度，直到再继续增加底物浓度而酶活不能进一步提高。然后通过经典的双倒数作图法，拟合得到了动力学参数，结果见表2。

表2：原始酶AgWH117A和K134D的动力学参数表

相比较而言，突变子K134D的K_m和k_cat值均要大于原始酶AgWH117A，那么可以推测突变子酶活的提高是因为kcat值的升高，而K134D的Km值说明了活性中心与底物之间亲和力的减弱，从而导致新琼二糖水解产物从酶中的释放速度加快。

实施例2：α-新琼二糖水解酶K134D与β-琼胶酶的共固定化

称取10.0mg磁性纳米颗粒于2mL离心管中，依次将重组表达、纯化的β-琼胶酶AgWH50B(氨基酸序列为SEQ ID NO:5，一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6)和α-新琼二糖水解酶K134D固定到固定化材料上获得共固定化酶K134D AgWH50B-CC-Fe₃O₄@SiO₂。

首先，将AgWH50B(0.05-283.64μg)的800μL pH 8.0的磷酸盐缓冲液加入到装有固定化材料的2mL离心管中，混匀，置于30℃的恒温摇床中180rpm固定化30min，取出，磁分离，缓冲液清洗后，再加入含200.0μg K134D的800μL pH 8.0的磷酸盐缓冲液，混匀，置于10℃摇床中180rpm固定化60min，取出，磁分离，缓冲液清洗后，待测酶活。

取1.0～2.0mg的Fe₃O₄粉末、Fe₃O₄@SiO₂粉末、CC-Fe₃O₄@SiO₂粉末、AgWH50B-CC-Fe₃O₄@SiO₂粉末、K134D-CC-Fe₃O₄@SiO₂粉末、K134D AgWH50B-CC-Fe₃O₄@SiO₂粉末，分别加入100.0mg KBr，于玛瑙研钵中研磨，压片至透明后，置于红外光谱仪在4000～400cm^-1进行扫描，分析固定化酶固定情况。结果表明α-新琼二糖水解酶K134D和β-琼胶酶AgWH50B被成功地固定在了固定化材料CC-Fe3O4@SiO2上(图6)。

共固定化酶K134D AgWH50B-CC-Fe₃O₄@SiO₂与0.3％琼脂糖在30℃条件下水浴反应60min，磁分离，用反应液点TLC板，以D-AHG、琼三糖、新琼四糖标准品作为对照。从图7中可以看出，共固定化酶与琼脂糖反应产生了L-AHG，这表明，K134D、AgWH50B不仅被成功固定到了固定化材料上，还有酶活，为实现一步法制备L-AHG奠定了基础。

图8表明，K134D AgWH50B-CC-Fe3O4@SiO2固定化酶的最适反应温度是27.5℃，反应温度在30℃时，其相对酶活达到99.0％。并且，固定化酶K134D在相同反应温度下的酶活比固定化酶AgaWH117至少要高10.0％。

通过共固定化酶的重复利用次数，分析共固定化酶K134D AgWH50B-CC-Fe3O4@SiO2的操作稳定性。结果表面，共固定化酶被循环利用8次后，其酶活力仍保持起初46.4％的活力。在使用6次之后，共固定化酶残留活力下降趋于平缓。与昂贵的纯游离酶相比，共固定化酶操作稳定性更好，在工业化制备L-AHG中更实用。

由表3可知，共固定化酶在其最适反应温度27.5℃与琼脂糖反应，产量是145964.85μg，对应的产率是40.55％。然而，等量的游离酶在27.5℃和35.0℃条件下与琼脂糖反应的产量分别是102141.99μg和100642.87μg，对应的产率分别是34.05％和33.55％。显然，与游离酶相比，共固定化酶具有更高的催化效率。

表3：L-AHG产量比较

图9是两种不同形态的琼胶酶与琼脂糖反应产物的分析结果，游离琼胶酶与琼脂糖的反应产物是复杂的，除了产生了新琼四糖和琼三糖外，保留时间7.091min处的小峰，此处是什么物质并没有被准确表征，它可能是新琼四糖或者琼三糖在高温条件下的衍生物。通过高分辨液质联用分析游离酶产物，色谱图中保留时间8.0～10.0min之间有一连串波浪形的小峰，质谱结果显示，它们是一些含氮元素的化合物，推测应该是酶蛋白污染了反应产物造成的这样结果。保留时间10.606min与D-AHG保留时间11.095min不吻合，且高分辨质谱分析显示的分子式表明，化合物应该是L-AHG或D-GAL的衍生物，这也应该是长时间较高温度下反应致使产物结构发生了变化。然而，从共固定化酶与琼脂糖反应产物色谱图中可以看出，8.0～10.0min之间几乎没有杂峰出现，反应产物没有被污染，且11.08min峰被鉴定是L-AHG的峰。这清晰地展现出了用共固定化酶制备纯L-AHG的优越性。

共固定化酶与琼脂糖反应36h后，将其反应产物经过处理后，上Bio-Gel P2凝胶柱纯化。从图10的TLC结果看，琼胶三糖与L-AHG这两种物质可以被完全分离开。

从图11对琼三糖的高效液相分析结果可以看出，其保留时间与琼三糖标准品保留时间完全吻合，并且初步计算(峰面积/总峰面积)出其纯度高于96.0％,表明纯化后的琼三糖没有发生结构变化，以及其高纯度、单一性。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种产3,6-内醚-L-半乳糖的固定化酶

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 361

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Arg Ala Leu

1 5 10 15

Glu Arg Gly Tyr Asp Asn Lys Gly Pro Glu Trp Phe Ile Glu Phe Glu

20 25 30

Glu Gln Glu Leu Leu Gly Asp Phe Ala Tyr Gln Glu Gly Val Ile Arg

35 40 45

Arg Asp Pro Thr Ala Val Ile Lys Val Asn Gly Ile Tyr His Cys Trp

50 55 60

Tyr Thr Lys Gly Glu Gly Glu Thr Val Gly Phe Gly Ser Asp Asn Pro

65 70 75 80

Glu Asp Lys Val Phe Pro Trp Asp Lys Thr Glu Val Trp His Ala Thr

85 90 95

Ser Asp Asp Gly Met Thr Trp Lys Glu Gln Gly Ser Ala Ile Thr Ala

100 105 110

Gly Glu Pro Gly Arg Tyr Asp Asp Arg Ala Val Phe Thr Pro Glu Val

115 120 125

Leu Val His Glu Gly Lys Phe Tyr Leu Val Tyr Gln Thr Val Lys Ala

130 135 140

Pro Tyr Thr Asn Arg Gln Ile Glu Glu Ile Ala Ile Ala Trp Ala Asp

145 150 155 160

Ser Pro Tyr Gly Pro Trp Thr Lys Ser Asp Ala Pro Ile Leu Ser Pro

165 170 175

Glu Gln Asp Gly Glu Trp Asp Gly Glu Glu Asp Asn Arg Phe Asn Val

180 185 190

Lys Ser Lys Gly Ser Phe Asp Ser His Lys Val His Asp Pro Cys Leu

195 200 205

Met Phe Phe Lys Gly Gln Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Glu Thr Met

210 215 220

Gly Glu Gly Met Asn Leu Gly Gly Arg Glu Ile Lys His Gly Val Ala

225 230 235 240

Ile Ala Asp Asn Ile Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Ser Glu Tyr Asn Pro

245 250 255

Ile Ser Asn Ser Gly His Glu Val Ala Val Trp His Gln Asn Gly Gly

260 265 270

Ile Ala Ser Leu Ile Thr Thr Asp Gly Pro Glu Lys Asn Thr Val Gln

275 280 285

Trp Ala Ala Asp Gly Ile Asn Phe Glu Ile Met Ser His Ile Lys Gly

290 295 300

Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ile Tyr Arg Pro Glu Ala Asp Glu Pro Leu

305 310 315 320

Glu Asp Pro Gly Leu His Trp Gly Leu Cys His Arg Tyr Asp Pro Ser

325 330 335

Trp Asn Trp Asn Tyr Ile Cys Arg Tyr Arg Val Lys Arg Gln Ile Met

340 345 350

Asp Ala Gly Thr Phe Gln Asn Thr Asn

355 360

<210> 2

<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctaaaat cagcacgaaa gctcagctta gcgagtaaac gcgcgcttga gcgtggctat 60

gataacaaag gaccagaatg gtttattgag tttgaagaac aagaattgtt aggtgacttt 120

gcatatcaag agggagtcat tcgtcgcgac cctacagcag tcatcaaagt caatggtata 180

tatcactgct ggtataccaa aggcgaaggt gaaaccgtgg gctttggttc tgacaatcca 240

gaagataagg tgtttccttg ggacaagact gaagtctggc atgccacctc tgatgatgga 300

atgacgtgga aagaacaagg aagcgcaatc accgctggag aacccggccg ctatgatgat 360

cgggcagtgt tcaccccaga ggtgctagtt catgaaggca agttttacct agtctatcaa 420

acggtcaaag ccccttacac taaccgacaa attgaagaaa ttgctattgc ttgggcagat 480

tcgccctacg gtccttggac taaaagcgat gctcctattc ttagcccaga acaagacggc 540

gagtgggacg gagaagaaga caatcgcttc aatgtaaaaa gtaagggcag ctttgatagc 600

cataaggtgc acgatccttg cctgatgttc ttcaaaggac agttctacct ttactacaaa 660

ggagaaacca tgggcgaggg aatgaaccta ggaggccgtg agatcaaaca tggtgtagcc 720

atcgccgaca atattcttgg cccttaccgc aagtcagaat acaacccgat tagtaatagc 780

ggccatgaag tggcggtatg gcaccaaaat ggcggtatcg catcactgat caccaccgat 840

ggccctgaga aaaataccgt gcagtgggcc gctgatggta tcaactttga aatcatgtcg 900

catatcaagg gagctcctga agcacttggt atttaccgtc ccgaagcaga tgaacctctt 960

gaagatccgg ggctgcactg ggggctttgc caccgctacg atccctcttg gaactggaac 1020

tacatttgcc gttaccgggt gaagcgacaa atcatggacg ctggtacctt ccagaatacc 1080

aactaa 1086

<210> 3

<211> 361

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Leu Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Arg Ala Leu

1 5 10 15

Glu Arg Gly Tyr Asp Asn Lys Gly Pro Glu Trp Phe Ile Glu Phe Glu

20 25 30

Glu Gln Glu Leu Leu Gly Asp Phe Ala Tyr Gln Glu Gly Val Ile Arg

35 40 45

Arg Asp Pro Thr Ala Val Ile Lys Val Asn Gly Ile Tyr His Cys Trp

50 55 60

Tyr Thr Lys Gly Glu Gly Glu Thr Val Gly Phe Gly Ser Asp Asn Pro

65 70 75 80

Glu Asp Lys Val Phe Pro Trp Asp Lys Thr Glu Val Trp His Ala Thr

85 90 95

Ser Asp Asp Gly Met Thr Trp Lys Glu Gln Gly Ser Ala Ile Thr Ala

100 105 110

Gly Glu Pro Gly Arg Tyr Asp Asp Arg Ala Val Phe Thr Pro Glu Val

115 120 125

Leu Val His Glu Gly Asp Phe Tyr Leu Val Tyr Gln Thr Val Lys Ala

130 135 140

Pro Tyr Thr Asn Arg Gln Ile Glu Glu Ile Ala Ile Ala Trp Ala Asp

145 150 155 160

Ser Pro Tyr Gly Pro Trp Thr Lys Ser Asp Ala Pro Ile Leu Ser Pro

165 170 175

Glu Gln Asp Gly Glu Trp Asp Gly Glu Glu Asp Asn Arg Phe Asn Val

180 185 190

Lys Ser Lys Gly Ser Phe Asp Ser His Lys Val His Asp Pro Cys Leu

195 200 205

Met Phe Phe Lys Gly Gln Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Glu Thr Met

210 215 220

Gly Glu Gly Met Asn Leu Gly Gly Arg Glu Ile Lys His Gly Val Ala

225 230 235 240

Ile Ala Asp Asn Ile Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Ser Glu Tyr Asn Pro

245 250 255

Ile Ser Asn Ser Gly His Glu Val Ala Val Trp His Gln Asn Gly Gly

260 265 270

Ile Ala Ser Leu Ile Thr Thr Asp Gly Pro Glu Lys Asn Thr Val Gln

275 280 285

Trp Ala Ala Asp Gly Ile Asn Phe Glu Ile Met Ser His Ile Lys Gly

290 295 300

Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ile Tyr Arg Pro Glu Ala Asp Glu Pro Leu

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Glu Asp Pro Gly Leu His Trp Gly Leu Cys His Arg Tyr Asp Pro Ser

325 330 335

Trp Asn Trp Asn Tyr Ile Cys Arg Tyr Arg Val Lys Arg Gln Ile Met

340 345 350

Asp Ala Gly Thr Phe Gln Asn Thr Asn

355 360

<210> 4

<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgctaaaat cagcacgaaa gctcagctta gcgagtaaac gcgcgcttga gcgtggctat 60

gataacaaag gaccagaatg gtttattgag tttgaagaac aagaattgtt aggtgacttt 120

gcatatcaag agggagtcat tcgtcgcgac cctacagcag tcatcaaagt caatggtata 180

tatcactgct ggtataccaa aggcgaaggt gaaaccgtgg gctttggttc tgacaatcca 240

gaagataagg tgtttccttg ggacaagact gaagtctggc atgccacctc tgatgatgga 300

atgacgtgga aagaacaagg aagcgcaatc accgctggag aacccggccg ctatgatgat 360

cgggcagtgt tcaccccaga ggtgctagtt catgaaggcg atttttacct agtctatcaa 420

acggtcaaag ccccttacac taaccgacaa attgaagaaa ttgctattgc ttgggcagat 480

tcgccctacg gtccttggac taaaagcgat gctcctattc ttagcccaga acaagacggc 540

gagtgggacg gagaagaaga caatcgcttc aatgtaaaaa gtaagggcag ctttgatagc 600

cataaggtgc acgatccttg cctgatgttc ttcaaaggac agttctacct ttactacaaa 660

ggagaaacca tgggcgaggg aatgaaccta ggaggccgtg agatcaaaca tggtgtagcc 720

atcgccgaca atattcttgg cccttaccgc aagtcagaat acaacccgat tagtaatagc 780

ggccatgaag tggcggtatg gcaccaaaat ggcggtatcg catcactgat caccaccgat 840

ggccctgaga aaaataccgt gcagtgggcc gctgatggta tcaactttga aatcatgtcg 900

catatcaagg gagctcctga agcacttggt atttaccgtc ccgaagcaga tgaacctctt 960

gaagatccgg ggctgcactg ggggctttgc caccgctacg atccctcttg gaactggaac 1020

tacatttgcc gttaccgggt gaagcgacaa atcatggacg ctggtacctt ccagaatacc 1080

aactaa 1086

<210> 5

<211> 955

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Thr Phe Thr Lys Ser Lys Ile Ala Thr Val Leu Ser Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Gly Ile Tyr Gly Cys Ala Ser Thr Thr Pro Gln Asn Glu Gln Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Glu Gln Val Val Glu Asp Met Gly Gly Ala Leu Pro Asp

35 40 45

Phe Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ser Lys Leu Lys Ala Glu His Ala Lys

50 55 60

Ala Ser Ala Val Thr Asp Thr Gly Val Thr Ala Gly Ser Gln Ala Leu

65 70 75 80

Lys Ile Asp Phe Asp Ser Val Asn Glu Ala Asn Lys Phe Lys Phe Trp

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145 150 155 160

Pro Val Glu Met Ile Phe Asn Gly Ser Lys Arg Lys Leu Asp Gly Tyr

165 170 175

Trp Gly Gly Glu Lys Ile Asn Leu Arg Lys Leu Val Glu Phe Gln Ile

180 185 190

Phe Val Gln Gly Pro Ile Asp Gln Gln Ser Val Ile Val Asp Asn Phe

195 200 205

Ala Leu Val Asp Ala Thr Gly Asp Phe Val Glu Ala Ser Gly Ala Glu

210 215 220

Glu Val Val Thr Gly Pro Val Pro Thr Val Leu Ala Ile Thr Asp Phe

225 230 235 240

Glu Lys Gly Gln Asp Ser Phe Ile Ser Ala Glu Arg Ser Val Ala Thr

245 250 255

Thr Ile Ser Pro Val Lys Thr Asp Asp Gly Ala Ala Ile Asp Val Leu

260 265 270

Phe Ser Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Asn Ile Thr Phe Arg Pro Asp Val

275 280 285

Pro Trp Asp Trp Ser Gly Gln Gly Asp Phe Asn Val Ala Phe Asp Met

290 295 300

Val Asn Lys Ser Asp Glu Pro Leu Gln Leu Phe Val Arg Val Asp Asp

305 310 315 320

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Trp Ser Gly Tyr Val Thr Ile Ala Pro Asn Asp Glu Gly Thr Tyr Tyr

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Leu Ser Leu Met Pro Ala Gly Asp Gln Met Val Ser Gly Met Arg Gly

355 360 365

Glu Pro Pro Lys Lys Ser Tyr Lys Ala Gln Ala Ile Ser Tyr Gly Trp

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Gly Asp Asn Asn Leu Asp Leu Ser Asn Ile Tyr Ser Met Gln Leu Tyr

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Asp Gly Lys Trp Ala Leu Val Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Phe Phe Val

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Thr Gly Leu Asp Asn Ile Arg Met Asp Asp Thr Val Thr Ile Thr Gly

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Val Asp Phe Ser Asn Lys Glu Thr Arg Glu Gly Arg Glu Val Ala Ser

530 535 540

Glu Leu Arg Asn Ser Met Phe Thr Trp Leu Pro Glu Tyr Asp Asp Val

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Leu Ala Glu Ser Tyr Asp Tyr Ala Asp Trp Ile His Thr Gly Ala Leu

565 570 575

Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Phe Tyr Ser Ala Asn Leu Gln Arg Lys

580 585 590

Tyr Gln Thr Ser Arg Glu Glu Ala Leu Lys Ile Trp Lys Asp Val Thr

595 600 605

Leu Asn Arg Met Gln Asp Trp Gly Phe Thr Thr Leu Gly Asn Trp Ala

610 615 620

Asp Pro Lys Phe Tyr Asp Asn Gln Gln Ile Ala Tyr Ala Ala Asn Gly

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Trp Ile Phe Gly Asp His Ala Arg Ile Ser Thr Gly Asn Asp Tyr Trp

645 650 655

Gly Pro Ile His Asp Pro Phe Asp Pro Glu Phe Ala Val Ser Thr Arg

660 665 670

Lys Met Ala Glu Lys Val Ala Ser Glu Val Ser Lys Asp Asp Pro Trp

675 680 685

Leu Met Gly Ile Phe Val Asp Asn Glu Ile Ser Trp Gly Asn Thr Lys

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Ile Lys Glu Ser Pro Ala Lys Ala Ala Phe Thr Lys His Leu Gln Asp

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Lys Tyr Ser Ser Ile Asp Ala Leu Asn Gln Ser Trp Gly Thr Lys Val

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Asn His Met Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ala Asp Trp Gly Val Thr Pro

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Glu Ile Ala Arg Gly Ala Ala Pro Tyr Val Asp Val Met Ser Tyr Asn

820 825 830

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850 855 860

Asp Thr Gly Leu Phe His Gly Gly Ile Val Ser Ala Ser Asn Gln Ala

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Asp Arg Ala Lys Lys Tyr Thr His Tyr Met Gln Ser Ile Val Asp Asn

885 890 895

Pro Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Leu Asp Ser Pro Thr

900 905 910

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915 920 925

Ile Thr Asp Thr Pro Tyr Gln Glu Leu Ile Asp Ala Ala Lys Gln Phe

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<210> 6

<211> 2868

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacattta ctaaaagcaa aatcgcaacc gttcttagcc tgagtttatt aggcatttat 60

ggttgtgctt ctacgacccc acagaatgag caagctgccg ccggtgaaca agtagttgaa 120

gacatgggtg gtgcgcttcc tgattttgag agcgataagt tttttagcaa gctgaaggcc 180

gaacatgcca aggcgagcgc cgttactgat actggtgtta ctgctggcag tcaagcgctg 240

aaaatagatt tcgattcagt gaatgaggcc aacaagttca agttttggcc aaacgtgaag 300

cttcatccag acactggtaa ttggaattgg aacgccaaag gcagtttaac tttagatgta 360

accaacccta ccgacagtac cgctaacatt attttgaaaa ttgctgacaa tgttggtgtg 420

atgggtgccg gagacaatca gcttaactat gcgcttagtg tgcctgctgg agaaactgta 480

ccagttgaaa tgatctttaa cggttctaag cggaagttag acggttattg gggcggagag 540

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caaagtgtca tcgtagataa ctttgcccta gtggatgcta ctggtgactt tgttgaagca 660

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gagaagggac aagatagctt tatttctgca gagcgaagtg tggcaacgac aatctcgccg 780

gtgaaaaccg atgatggtgc agcaattgac gttttgttct ctgccagcaa ctcctacccg 840

aatattacgt tccgtcctga cgttccttgg gactggtctg gtcagggaga tttcaacgtt 900

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gatggtccca aactagaagc aacaggtttt ttccgagctg aaaaagtcga cggtaaatgg 1500

gcattagtcg atcctgaagg ttatctgttc tttgtgacag gcctagataa catccggatg 1560

gatgacaccg taactattac cggtgttgat ttcagcaaca aagaaactcg agaaggccgt 1620

gaagttgcgt ctgagttgcg taatagcatg ttcacgtggc taccagagta tgatgatgtg 1680

ctcgcggaga gctatgatta tgctgattgg atacacactg gtgcattgaa aaaaggcgag 1740

gtgtttagtt tttacagtgc caacctacaa cgtaagtacc aaacctctcg tgaagaagct 1800

ctgaagattt ggaaggatgt cacgctaaat cgtatgcaag attggggctt taccacctta 1860

ggtaattggg cggatcctaa gttctatgat aatcagcaaa ttgcttatgc ggccaatggt 1920

tggattttcg gtgatcacgc tcgcatcagt actggtaacg attactgggg accgatccat 1980

gacccattcg atcctgagtt tgccgttagc acccgcaaga tggcggagaa agtggcttcc 2040

gaagttagca aggacgaccc atggctaatg ggtatctttg tcgacaatga aattagttgg 2100

ggtaatacca agaacgaagc caaccactac ggcctcgtag tgaatgcgct gagttatgac 2160

atcaaagaga gccctgctaa ggccgctttc actaagcatt tgcaagacaa gtactcaagc 2220

attgatgcac ttaaccaaag ctggggaact aaggttacgt catgggctga ttttgaagtc 2280

tcttttgatc atcgttctcg cttaagcagt agtatgaaga aagattactc cgagatgctg 2340

caaatgctct cagagaagta tttctctact gtacaggctg aactaaaaaa agtgttgcct 2400

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aactacaatg tgggcttcgt ttcaattacc gacacaccat atcaagagtt gattgatgcc 2820

gctaagcagt tcaaccgtga tctatataat ctgcgttaca aaaaataa 2868

Claims

1.一种固定化酶，其特征在于，所述的固定化酶是将α-新琼二糖水解酶和能将琼脂糖降解为新琼四糖的蛋白酶固定于固定化酶载体上而制备的；所述的α-新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述的能将琼脂糖降解为新琼四糖的蛋白酶为β-琼胶酶。

2.如权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ IDNO:5。

3.如权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述的固定化酶载体为磁性纳米材料。

4.权利要求1-3任一项所述的固定化酶在降解琼脂糖来制备3,6-内醚-L-半乳糖中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的固定化酶在降解琼脂糖来制备琼三糖中的应用。