CN110982865A - 一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用 - Google Patents

一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α‑‑葡萄糖基橙皮苷中的应用，所述碱性环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明碱性环糊精葡萄糖基转移酶能够在大肠杆菌中实现高水平的分泌表达，实现酶的高效制备；可实现对0.5‑15％的橙皮苷，在16小时内，橙皮苷的转化率在58‑88％，具有底物投料量高、催化速率快、底物转化率高的特点，适用于工业化生产α‑葡萄糖基橙皮苷。

Description

一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中 的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用。
(二)背景技术
橙皮苷(Hesperidin)又名橘皮苷、橘皮甙，是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，为二氢黄酮衍生物。广泛存在于豆科、唇花科、碟形花科、芸香科柑橘属植物中，具有维持血管正常渗透压、降低血管脆性、增强毛细血管韧性、缩短出血时间等作用。橙皮苷不仅具有降低人体内胆固醇作用，还有抗病毒、提高免疫力的功效，具有消炎、抗氧化、抗菌、抗癌、防辐射、保护心血管系统等药理活性。
橙皮苷水溶性较差，且具有苦味，极大限制了其应用。通过糖基化修饰，其水中溶解度可提高10000倍以上，极大改善其溶解性，从提高橙皮苷的应用范围和使用效果。目前关于橙皮苷的改性，主要分为化学改性和生物酶法改性。酶法专一性强，条件温和，无“三废”产生，已有一些环糊精葡萄糖基转移酶被报道用于改性橙皮苷，但存在底物转化率偏低的缺点。随着生物信息学、基因工程技术和基因人工合成技术的不断发展，通过基因数据库搜索、基因的人工合成、高效表达等方法相结合，可更有效地筛选高活性的橙皮苷糖苷转移酶。经过研究筛选并确定了一个嗜碱芽孢杆菌来源的碱性环糊精葡萄糖基转移酶，对橙皮苷糖基化具有较高的催化活性，将该基因在大肠杆菌中的过量表达，可用于橙皮苷的高效糖基化修饰。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)的碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用，所述碱性环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，其在基因组数据库NCBI的登录号为：AAV38118；所述酶编码基因经过密码子优化的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述的应用为：将含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液用缓冲液稀释(优选稀释至湿菌体含量5-30g/L)后破碎(优选高压匀浆破碎)，取破碎混合液作为催化菌剂，以橙皮苷和麦芽糊精为底物，以缓冲液为反应介质构成转化体系，在pH值8.0-12.0，温度30-55℃条件下进行转化反应(优选10-24h)，反应完全后，获得含α-葡萄糖基橙皮苷的催化反应液，将反应液分离纯化，获得α-葡萄糖基橙皮苷。所述橙皮苷质量加入量以反应介质体积计为5-150g/L(优选20-60g/L，最优选50g/L)，所述麦芽糊精质量加入量以反应介质体积计为100-2000g/L(优选200-400g/L，400g/L)，所述催化菌剂加入量以破碎前湿菌体含量计，所述湿菌体加入量以反应介质体积计为10-50g/L(优选20-30g/L)所述催化菌剂破碎前湿菌体含量为5-30g/L(优选10g/L)，所述催化菌剂与反应介质体积比为3:1。
进一步，所述反应优选在pH值9.0-10.0、40-45℃的条件下转化反应，最优选在pH值10.0、40℃的条件下转化反应16h。
进一步，所述缓冲液均优选为50mmol/L、pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
进一步，本发明所述菌剂按如下方法制备：将含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种到含氨苄青霉素50μg/mL发酵培养基中，30-37℃培养4-7h(优选35℃培养5h)，然后降低发酵温度至22℃，并以3-4.5g/h/L起始发酵培养基的速率(优选3g/h/L)补加甘油，再以5-6g/h/L起始发酵培养基的速率(优选5.4g/h/L)补加乳糖，其中甘油共补加15-18h(优选15h)，乳糖共补加5-7h(优选5h)，22℃条件下发酵16-20h后结束，取发酵液，加入缓冲液(优选为50mmol/L、pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)稀释(优选稀释发酵液至湿菌体用含量为5-30g/L后)，高压匀浆破碎，取破碎混合液，即得到生产α-葡萄糖基橙皮苷的催化菌剂；所述催化剂菌剂中湿菌体浓度优选为10g/L；所述发酵培养基组成：12g/L蛋白胨、10g/L酵母提取粉、Na2HPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO40.71g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8-7.0。
进一步，本发明所述含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌按如下方法构建：将SEQ ID NO.1所示嗜碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因alka-cgt克隆至质粒pET22b，构建重组表达质粒pET22b-alkacgt，导入E.coli RosettaTM(DE3)感受态细胞，筛选获得含重组质粒pET22b-alkacgt的阳性克隆子E.coli RosettaTM(DE3)(pET22b-alkacgt)，记为重组大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-AlkaCGT。
进一步，所述工程菌在发酵前先进行种子活化培养，再将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，所述种子活化培养为：将含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌IFE-AlkaCGT)接种在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；所述LB液体培养基组成：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为去离子水，pH为6.8-7.0。
与现有报道的技术相比(包括Food Chemistry 229(2017)75-83，EuropeanJournal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 76(2010)238-244，CN 102051397A)，本发明有益效果主要体现在：
(1)比较其他环糊精葡萄糖基转移酶，该碱性环糊精葡萄糖基转移酶能够在大肠杆菌中实现高水平的分泌表达，实现酶的高效制备；(2)反应底物橙皮苷在水中的溶解能力极差(约0.02g/L)，但是在碱性条件下，橙皮苷水溶性得到了极大的提高，有利于橙皮苷在水溶液中的糖基化修饰，提高生产效率；(3)本发明提供的碱性环糊精葡萄糖基转移酶可实现对0.5-15％的橙皮苷，在16小时内，橙皮苷的转化率在58-88％(而CN 102051397A描述的转化率为52.5％)，具有底物投料量高、催化速率快、底物转化率高的特点，适用于工业化生产α-葡萄糖基橙皮苷。
(四)附图说明
图1α-葡萄糖基橙皮苷的结构示意图。
图2寡聚葡萄糖基橙皮苷的结构示意图。
图3pET22b-alkacgt载体的结构示意图。
图4α-环糊精浓度检测的标准曲线。
图5α-葡萄糖基橙皮苷HPLC分析谱图。
图6橙皮苷的HPLC分析谱图。
图7碱性环糊精葡萄糖基转移酶催化反应液的HPLC分析谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为去离子水，pH为6.8-7.0。
LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值6.8-7.0。
发酵培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH为6.8-7.0。
实施例1、制备生产α-葡萄糖基橙皮苷的菌剂
一、构建高效表达碱性环糊精葡萄糖基转移酶的大肠杆菌
参考NCBI数据库报道的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)来源的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列(NCBI登录号NO.AAV38118)，交由基因合成公司(华大基因青兰生物科技有限公司)，经过密码子优化，人工合成环糊精葡萄糖基转移酶编码基因alkacgt(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)，并克隆到表达载体pET22b的NcoI/BamHI之间，获得重组质粒pET22b-alkacgt。
将经基因合成公司合成目的基因构建而成的重组质粒pET22b-alkacgt转化到表达宿主E.coli RosettaTM(DE3)中，具体操作如下：取2μL重组质粒pET22b-alkacgt，加入到100μL的E.coli RosettaTM(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min使其抗性复苏。5000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μL，均匀涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
阳性克隆转化子的鉴定。在长有重组子的平板上，直接挑取6个单菌落至含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基里，在37℃培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司的SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到阳性克隆子含有的重组质粒的阳性克隆子。
将含重组质粒pET22b-alkacgt的阳性克隆子E.coli RosettaTM(DE3)(pET22b-alkacgt)命名为重组大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-AlkaCGT，即得到能够高效表达碱性环糊精葡萄糖基转移酶的重组大肠杆菌菌株。
二、制备生产α-葡萄糖基橙皮苷的催化菌剂
将重组大肠杆菌IFE-AlkaCGT接种在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上进行复苏，37℃，200rpm的摇床中过夜培养10h后，以体积浓度5％的接种量转接至新鲜的含有50μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm的摇床中培养3h；以体积浓度5％的接种量接种到含50mg/L氨苄青霉素的发酵培养基中，35℃培养5h，然后降低发酵温度至22℃，以3g/h/L起始发酵培养基的速率补加甘油，再以5.4g/h/L起始发酵培养基的速率补加乳糖，其中甘油共补加15小时，乳糖共补加5h，22℃继续发酵16h，取发酵液，其湿菌体含量为40g/L。将发酵液用50mmol/L、pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释后，采用高压匀浆破碎，取破碎混合液即为生产α-葡萄糖基橙皮苷的催化菌剂。
三、含碱性环糊精葡萄糖基转移酶的催化菌剂的活性检测
催化菌剂中碱性环糊精葡萄糖基转移酶的活性检测可以通过检测产α-环糊精的活力来实现，具体方法如下：
(1)绘制α-环糊精-△A505标准曲线
取1mL去离子水，分别加入1.0mL 1.0mol/L的HCl水溶液和1mL 0.1mmol/L的甲基橙水溶液，混匀后，20℃下显色20min，之后在505nm波长处检测吸光度，记为A0。
分别配置系列质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L的α-环糊精标准水溶液，分别取1.0mL不同浓度的α-环糊精标准水溶液，依次加入1.0mL 1.0mol/L的HCl水溶液和1mL0.1mmol/L的甲基橙水溶液，混匀后，20℃下显色20min，之后在505nm波长处检测吸光度，记为A505。令△A505＝A505-A0，作α-环糊精浓度-ΔA505标准曲线，如图4所示。
(2)活性检测
将步骤二中获得的发酵液，采用50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液稀释成菌体浓度为5g/L的湿菌体悬浊液，经高压匀浆破碎后，获得催化菌剂。
将0.1mL催化菌剂添加至0.9mL预先用50mmol/L，pH为10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液糊化的3％(v/v)的可溶性淀粉溶液中。40℃反应10min后，加入1.0mL 1.0mol/L的HCl水溶液终止反应，再加入1mL 0.1mmol/L的甲基橙水溶液，混匀后20℃下显色20min，之后在505nm波长处检测吸光度。计算ΔA505，根据步骤(1)标准曲线，从而计算得到生成α-环糊精浓度。
碱性环糊精葡萄糖基转移酶酶活定义：在40℃，pH为10的条件下，碱性环糊精葡萄糖基转移酶每分钟催化生成1μmolα-环糊精所需的酶量为1个酶活单位，记为1U。
实施例2、催化菌剂在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用
一、催化菌剂的活性检测
取0.2g橙皮苷于圆底烧瓶(内含转子)中，加入10ml预先配置好的50mmol/L pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为反应介质，加入0.08g氢氧化钠固体，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入11mol/L HCl水溶液调节体系的pH至10.0；往其中加入2g麦芽糊精，磁力搅拌使整个体系混合均匀；将实施例1中获得的发酵液以50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释成菌体含量为10g/L的菌悬液，经高压匀浆破碎后获得催化菌剂；向上述反应体系中加入30mL该催化菌剂，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，40℃恒温水浴磁力搅拌器中催化1h，取催化反应液用于HPLC分析底物橙皮苷和产物之一α-葡萄糖基橙皮苷的含量。
橙皮苷含量的分析：取100μL催化反应液于900μL碱醇溶液(1g/L NaOH，75％(v/v)乙醇水溶液)中，14000×g离心5min，采用0.22μm滤膜过滤后，上清液用于HPLC分析。
α-葡萄糖基橙皮苷含量的分析：α-葡萄糖基橙皮苷具有良好的水溶解性，直接取样于稀酸溶液中，终止反应，用于α-葡萄糖基橙皮苷的含量分析。即取催化反应液100μL于900μL 0.02mmol/L的HCl水溶液中混合均匀，14000×g离心2min，采用0.22μm滤膜过滤后，上清液用于HPLC分析。
液相色谱检测条件。色谱柱：Cl8柱，250×4.6mm；柱温：40℃；流动相：CH3CN(乙腈)：H2O：C2HF3O2(三氟乙酸)＝20:80:1(体积比)；流速：1mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：283nm；进样量：10μL。
α-葡萄糖基橙皮苷标准品和橙皮苷标准品的HPLC分析图谱如图5和图6所示，碱性环糊精葡萄糖转移酶催化橙皮苷糖基化的催化反应液的HPLC检测图谱如图7所示。底物橙皮苷的出峰时间为10.4min，产物α-葡萄糖基橙皮苷的出峰时间为9.5min。在碱性环糊精葡萄糖转移酶催化反应液中含有多种其他寡聚葡萄糖基橙皮苷的产物，如麦芽糖基橙皮苷(7.89min)、麦芽三糖基橙皮苷(6.35min)、麦芽四糖基橙皮苷(5.319min)、麦芽五糖基橙皮苷(4.78min)等。经过1h转化反应，测得底物橙皮苷的转化率为20％。
二、上述制备的菌剂催化转化α-葡萄糖基橙皮苷的应用条件优化
1、底物投料量0.5％，不同温度条件下的催化转化。
取0.2g橙皮苷于圆底烧瓶(内含转子)中，加入10ml预先配置好的50mmol/L pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为反应介质，加入0.08g氢氧化钠固体，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入11mol/L HCl水溶液调节体系的pH至10.0；往其中加入2g麦芽糊精，磁力搅拌使整个体系混合均匀；将实施例1中获得的发酵液以50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释成菌体含量为10g/L的菌悬液，经高压匀浆破碎后获得催化菌剂；向上述反应体系中加入30mL该催化菌剂，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16h。取催化反应液用于HPLC色谱分析底物橙皮苷和产物之一α-葡萄糖基橙皮苷的含量。结果表明底物橙皮苷在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃环境中的转化率分别为43％、56％、64％、73％、52％、41％。
2、底物投料量为0.5％，不同pH条件下的催化转化。
取0.2g橙皮苷于圆底烧瓶(内含转子)中，加入10ml预先配置好的50mmol/L pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为反应介质，加入0.08g氢氧化钠固体，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入11mol/L HCl水溶液，分别调节体系的pH至8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0；往其中加入2g麦芽糊精，磁力搅拌使整个体系混合均匀；将实施例1中获得的发酵液以50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释成菌体含量为10g/L的菌悬液，经高压匀浆破碎后获得催化菌剂；向上述反应体系中加入30mL该催化菌剂，用2mol/L NaOH或1mol/L HCl调节pH至相应值，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在相应pH值，40℃恒温水浴磁力搅拌器中催化16h，取催化反应液用于HPLC分析底物橙皮苷和产物之一α-葡萄糖基橙皮苷的含量。结果表明底物橙皮苷pH为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0环境中的转化率分别28％、42％、73％、66％、63％、40％、21％。
3、底物投料量为1.0％的催化转化。
取0.4g橙皮苷于圆底烧瓶(内含转子)中，加入10ml预先配置好的50mmol/L pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为反应介质，加入0.08g氢氧化钠固体，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入11mol/L HCl水溶液调节体系的pH至10.0；往其中加入4g麦芽糊精，磁力搅拌使整个体系混合均匀；将实施例1中获得的发酵液以50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释成菌体含量为10g/L的菌悬液，经高压匀浆破碎后获得催化菌剂；向上述反应体系中加入30mL该催化菌剂，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，在40℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16h。取催化反应液用于HPLC色谱分析底物橙皮苷和产物之一α-葡萄糖基橙皮苷的含量。结果表明底物橙皮苷的转化率为80％。
4、底物投料量为5.0％的催化转化。
取2.0g橙皮苷于圆底烧瓶(内含转子)中，加入10ml预先配置好的50mmol/L pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为反应介质，加入0.08g氢氧化钠固体，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入11mol/L HCl水溶液调节体系的pH至10.0；往其中加入4g麦芽糊精，磁力搅拌使整个体系混合均匀；将实施例1中获得的发酵液以50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释成菌体含量为10g/L的菌悬液，经高压匀浆破碎后获得催化菌剂；向上述反应体系中加入30mL该催化菌剂，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，在40℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16h。取催化反应液用于HPLC色谱分析底物橙皮苷和产物之一α-葡萄糖基橙皮苷的含量。结果表明底物橙皮苷的转化率为84％。
5、底物投料量为10.0％的催化转化。
取4g橙皮苷于圆底烧瓶(内含转子)中，加入10ml预先配置好的50mmol/L pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为反应介质，加入0.08g氢氧化钠固体，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入11mol/L HCl水溶液，调节体系的pH至10.0；往其中加入16g麦芽糊精，磁力搅拌使整个体系混合均匀；将实施例1中获得的发酵液以50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释成菌体含量为10g/L的菌悬液，经高压匀浆破碎后获得催化菌剂；向上述反应体系中加入30mL该催化菌剂，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，在40℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16h。取催化反应液用于HPLC色谱分析底物橙皮苷和产物之一α-葡萄糖基橙皮苷的含量。结果表明底物橙皮苷的转化率为67％。
6、底物投料量为15.0％的催化转化。
取6g橙皮苷于圆底烧瓶(内含转子)中，加入10ml预先配置好的50mmol/L pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为反应介质，加入0.08g氢氧化钠固体，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入11mol/L HCl水溶液调节体系的pH至10.0；往其中加入20g麦芽糊精，磁力搅拌使整个体系混合均匀；将实施例1中获得的发酵液以50mmol/L pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释成菌体含量为10g/L的菌悬液，经高压匀浆破碎后获得催化菌剂；向上述反应体系中加入30mL该催化菌剂，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，在40℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16h。催化反应液取样用于HPLC色谱分析底物橙皮苷和产物之一α-葡萄糖基橙皮苷的含量。结果表明底物橙皮苷的转化率为58％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2028
<212> DNA
<213> 嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)
<400> 1
gctgacgtta ccaacaaagt taactactct aaagacgtta tctaccaggt tgttaccgac 60
cgtttctctg acggtaaccc gggtaacaac ccgtctggtg ctatcttctc tcagaactgc 120
atcgacctgc acaaatactg cggtggtgac tggcagggta tcatcgacaa aatcaacgac 180
ggttacctga ccgacctggg tatcaccgct ctgtggatct ctcagccggt tgaaaacgtt 240
tacgctctgc acccgtctgg ttacacctct taccacggtt actgggctcg tgactacaaa 300
aaaaccaacc cgtactacgg taacttcgac gacttcgacc gtctgatgtc taccgctcac 360
tctaacggta tcaaagttat catggacttc accccgaacc actcttctcc ggctctggaa 420
accaacccga actacgttga aaacggtgct atctacgaca acggtaccct gctgggtaac 480
tactctaacg accagcagaa cctgttccac cacaacggtg gtaccgactt ctcttcttac 540
gaagactcta tctaccgtaa cctgtacgac ctggctgact acgacctgaa caacaccgtt 600
atggaccagt acctgaaaga atctatcaaa ttctggctgg acaaaggtat cgacggtatc 660
cgtgttgacg ctgttaaaca catgtctgaa ggttggcaga cctctctgat gtctgaaatc 720
tactctcaca aaccggtttt caccttcggt gaatggttcc tgggttctgg tgaagttgac 780
ccgcagaacc accacttcgc taacgaatct ggtatgtctc tgctggactt ccagttcggt 840
cagaccatcc gtaacgttct gaaagaccgt acctctaact ggtacgactt caacgaaatg 900
atcacctcta ccgaaaaaga atacaacgaa gttatcgacc aggttacctt catcgacaac 960
cacgacatgt ctcgtttctc tgttggttct tcttctaacc gtcagaccga catggctctg 1020
gctgttctgc tgacctctcg tggtgttccg accatctact acggtaccga acagtacgtt 1080
accggtggta acgacccgga aaaccgtaaa ccgctgaaaa ccttcgaccg ttctaccaac 1140
tcttaccaga tcatctctaa actggcttct ctgcgtcaga ccaactctgc tctgggttac 1200
ggtaccacca ccgaacgttg gctgaacgaa gacatctaca tctacgaacg taccttcggt 1260
aactctatcg ttctgaccgc tgttaactct tctaactcta accagaccat caccaacctg 1320
aacacctctc tgccgcaggg taactacacc gacgaactgc agcagcgtct ggacggtaac 1380
accatcaccg ttaacgctaa cggtgctgtt aactctttcc agctgcgtgc taactctgtt 1440
gctgtttggc aggtttctaa cccgtctacc tctccgctga tcggtcaggt tggtccgatg 1500
atgggtaaat ctggtaacac catcaccgtt tctggtgaag gtttcggtga cgaacgtggt 1560
tctgttctgt tcgactctac ctcttctgaa atcatctctt ggtctaacac cgaaatctct 1620
gttaaagttc cgaacgttgc tggtggttac tacgacctgt ctgttgttac cgctgctaac 1680
ctgaaatctc cgacctacaa agaattcgaa gttctgtctg gtaaccaggt ttctgttcgt 1740
ttcggtgtta acaacgctac cacctctccg ggtaccaacc tgtacatcgt tggtaacgtt 1800
tctgaactgg gtaactggga cgctgacaaa gctatcggtc cgatgttcaa ccaggttatg 1860
taccagtacc cgacctggta ctacgacatc tctgttccgg ctggtaaaaa cctggaatac 1920
aaatacatca aaaaagacca gaacggtaac gttgtttggc agtctggtaa caaccgtacc 1980
tacacctctc cgaccaccgg taccgacacc gttatgatca actggtaa 2028
<210> 2
<211> 675
<212> PRT
<213> 嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)
<400> 2
Ala Asp Val Thr Asn Lys Val Asn Tyr Ser Lys Asp Val Ile Tyr Gln
1 5 10 15
Val Val Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asn Pro Ser
20 25 30
Gly Ala Ile Phe Ser Gln Asn Cys Ile Asp Leu His Lys Tyr Cys Gly
35 40 45
Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr
50 55 60
Asp Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val
65 70 75 80
Tyr Ala Leu His Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Lys Lys Thr Asn Pro Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Asp Phe
100 105 110
Asp Arg Leu Met Ser Thr Ala His Ser Asn Gly Ile Lys Val Ile Met
115 120 125
Asp Phe Thr Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu Thr Asn Pro Asn
130 135 140
Tyr Val Glu Asn Gly Ala Ile Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu Gly Asn
145 150 155 160
Tyr Ser Asn Asp Gln Gln Asn Leu Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp
165 170 175
Phe Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala
180 185 190
Asp Tyr Asp Leu Asn Asn Thr Val Met Asp Gln Tyr Leu Lys Glu Ser
195 200 205
Ile Lys Phe Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala
210 215 220
Val Lys His Met Ser Glu Gly Trp Gln Thr Ser Leu Met Ser Glu Ile
225 230 235 240
Tyr Ser His Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Ser
245 250 255
Gly Glu Val Asp Pro Gln Asn His His Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met
260 265 270
Ser Leu Leu Asp Phe Gln Phe Gly Gln Thr Ile Arg Asn Val Leu Lys
275 280 285
Asp Arg Thr Ser Asn Trp Tyr Asp Phe Asn Glu Met Ile Thr Ser Thr
290 295 300
Glu Lys Glu Tyr Asn Glu Val Ile Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn
305 310 315 320
His Asp Met Ser Arg Phe Ser Val Gly Ser Ser Ser Asn Arg Gln Thr
325 330 335
Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Thr Ile
340 345 350
Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Val Thr Gly Gly Asn Asp Pro Glu Asn
355 360 365
Arg Lys Pro Leu Lys Thr Phe Asp Arg Ser Thr Asn Ser Tyr Gln Ile
370 375 380
Ile Ser Lys Leu Ala Ser Leu Arg Gln Thr Asn Ser Ala Leu Gly Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Leu Asn Glu Asp Ile Tyr Ile Tyr Glu
405 410 415
Arg Thr Phe Gly Asn Ser Ile Val Leu Thr Ala Val Asn Ser Ser Asn
420 425 430
Ser Asn Gln Thr Ile Thr Asn Leu Asn Thr Ser Leu Pro Gln Gly Asn
435 440 445
Tyr Thr Asp Glu Leu Gln Gln Arg Leu Asp Gly Asn Thr Ile Thr Val
450 455 460
Asn Ala Asn Gly Ala Val Asn Ser Phe Gln Leu Arg Ala Asn Ser Val
465 470 475 480
Ala Val Trp Gln Val Ser Asn Pro Ser Thr Ser Pro Leu Ile Gly Gln
485 490 495
Val Gly Pro Met Met Gly Lys Ser Gly Asn Thr Ile Thr Val Ser Gly
500 505 510
Glu Gly Phe Gly Asp Glu Arg Gly Ser Val Leu Phe Asp Ser Thr Ser
515 520 525
Ser Glu Ile Ile Ser Trp Ser Asn Thr Glu Ile Ser Val Lys Val Pro
530 535 540
Asn Val Ala Gly Gly Tyr Tyr Asp Leu Ser Val Val Thr Ala Ala Asn
545 550 555 560
Leu Lys Ser Pro Thr Tyr Lys Glu Phe Glu Val Leu Ser Gly Asn Gln
565 570 575
Val Ser Val Arg Phe Gly Val Asn Asn Ala Thr Thr Ser Pro Gly Thr
580 585 590
Asn Leu Tyr Ile Val Gly Asn Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Ala
595 600 605
Asp Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Met Tyr Gln Tyr Pro
610 615 620
Thr Trp Tyr Tyr Asp Ile Ser Val Pro Ala Gly Lys Asn Leu Glu Tyr
625 630 635 640
Lys Tyr Ile Lys Lys Asp Gln Asn Gly Asn Val Val Trp Gln Ser Gly
645 650 655
Asn Asn Arg Thr Tyr Thr Ser Pro Thr Thr Gly Thr Asp Thr Val Met
660 665 670
Ile Asn Trp
675

Claims (10)

1.一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用，其特征在于所述碱性环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液用缓冲液稀释后，破碎，取破碎混合液作为催化菌剂，以橙皮苷和麦芽糊精为底物，以缓冲液为反应介质构成转化体系，在pH值8.0-12.0，温度30-55℃条件下进行转化反应，反应完全后，获得含α-葡萄糖基橙皮苷的催化反应液，将反应液分离纯化，获得α-葡萄糖基橙皮苷。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述橙皮苷质量加入量以反应介质体积计为5-150g/L，所述麦芽糊精质量加入量以反应介质体积计为100-2000g/L，所述催化菌剂加入量以破碎前湿菌体含量计，所述湿菌体加入量以反应介质体积计为10-50g/L。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述橙皮苷质量加入量以反应介质体积计为20-60g/L，所述麦芽糊精质量加入量以反应介质体积计为200-400g/L，所述湿菌体加入量以反应介质体积计为20-30g/L。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反应在pH值9.0-10.0、40-45℃的条件下转化反应10-24h。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述缓冲液均为50mmol/L、pH为10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述催化菌剂按如下方法制备：将含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种到含氨苄青霉素50μg/mL发酵培养基中，30-37℃培养4-7h，然后降低发酵温度至22℃，并以3.0-4.5g/h/L起始发酵培养基的速率开始补加甘油，再以5-6g/h/L起始发酵培养基的速率补加乳糖，其中甘油共补加15-18小时，乳糖共补加5-7h，22℃条件下发酵16-20h后结束，取发酵液，加缓冲液稀释至湿菌体含量5-30g/L，采用高压匀浆破碎，取破碎混合液，即得所述的催化菌剂；所述发酵培养基组成：12g/L蛋白胨、10g/L酵母提取粉、Na2HPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO40.71g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8-7.0。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌按如下方法构建：将SEQ ID NO.1所示碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因alka-cgt克隆至质粒pET22b，构建重组表达质粒pET22b-alkacgt，导入E.coli RosettaTM(DE3)感受态细胞，筛选获得含重组质粒pET22b-alkacgt的阳性克隆子E.coli RosettaTM(DE3)，记为重组大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-AlkaCGT。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述工程菌在发酵前先进行种子活化培养，再将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，所述种子活化培养为：将含碱性环糊精葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；所述LB液体培养基组成：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为去离子水，pH为6.8-7.0。
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