CN114350730A - 一种利用米曲霉糖化酶制备α-单葡萄糖基橙皮苷的方法 - Google Patents
一种利用米曲霉糖化酶制备α-单葡萄糖基橙皮苷的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用米曲霉糖化酶制备α‑单葡萄糖基橙皮苷的方法，所述方法为：以寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物为反应底物，以米曲霉来源的糖化酶为催化剂，在pH3.0~8.0、40~65℃条件下进行酶解反应2~16 h，于反应液中获得以α‑单葡萄糖基橙皮苷为主的橙皮苷糖苷产物。本发明创新性地将米曲霉所产的糖化酶用于酶切多种寡聚葡萄糖基橙皮苷上的多个糖基，产生单一糖基化产物α‑单葡萄糖基橙皮苷产物，不会发生过量切割葡萄糖基而造成橙皮苷个糖苷产物的损失。
Description
技术领域
本发明涉及α-单葡萄糖基橙皮苷的生产，尤其是一种利用米曲霉糖化酶制备α-单葡萄糖基橙皮苷的方法。
背景技术
橙皮苷（Hesperidin）又名橘皮苷、橘皮甙，是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，为二氢黄酮衍生物。广泛存在于豆科、唇花科、碟形花科、芸香科柑橘属植物中，具有维持血管正常渗透压、增强毛细血管韧性、缩短出血时间等作用。橙皮苷不仅具有降低人体内胆固醇作用，还有抗病毒、提高免疫力的功能。但橙皮苷的水溶性差，生物利用率低，这极大限制了其应用。因此，对橙皮苷进行改性成为当前一研究热点。橙皮苷改性主要有化学法和酶法，其中酶法制备具有糖基化路线简单，不涉及有毒有害物质，环境友好方式，且专一性强，适合工业化放大生产。
糖基化是酶法改性橙皮的一种重要手段，橙皮苷经过糖基化改性，其水溶性可由改性前的0.02 g/L 升至250 g/L，水溶性提高12500倍，这极大扩宽了橙皮苷的应用范围。目前糖基化改性橙皮苷所用的酶主要有葡萄糖基转移酶法、微生物糖基化法、β-呋喃果糖苷酶法和环糊精葡萄糖基转移法（CGTase）。虽有多种糖基转移酶可用于橙皮苷的糖基化修饰，然后CGTase 采用廉价易得的糖基供体，且具有较高催化活性，催化速率和转化率均较高，具有最好的工业化价值。不过，CGTase是一种多功能酶，可催化歧化反应、耦合反应、环化反应及水解反应 4 种反应，因此其催化产物不是单一的糖基化产物，而是多种糖基化产物，即寡聚糖基橙皮苷糖苷系列（1-5个葡萄糖基聚合度）的混合产物。这种混合产物需要进一步的糖化酶切割，用于生产α-单葡萄糖基-橙皮苷。然而，许多现有的糖化酶酶制剂并不能满足这种生产要求，容易造成所有α-葡萄糖基被切掉。
发明内容
本发明目的是提供一种利用米曲霉糖化酶制备α-单葡萄糖基橙皮苷的方法，本发明采用米曲霉来源的糖化酶，可将寡聚糖基橙皮苷糖苷混合产物进行有效酶切，生成α-单葡萄糖基橙皮苷的单一糖苷产物，实现α-单葡萄糖基橙皮苷的高效制备。
本发明采用的技术方案是：
一种利用米曲霉糖化酶制备α-单葡萄糖基橙皮苷的方法，所述方法为：以寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物为反应底物，以米曲霉来源的糖化酶为催化剂，在pH3.0~8.0、40~65℃条件下进行酶解反应2~16 h，于反应液中获得以α-单葡萄糖基橙皮苷为主的橙皮苷糖苷产物。
所述米曲霉为糖化发酵剂，优选米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2339（沪酿3.042），来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址是北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼。
所述反应体系中，NaOH水溶液体积用量为5~60%（v/v）（优选40%），所述橙皮苷终浓度为20g/L；所述橙皮苷与糊精重量比为1：3~10（优选1：6）；所述环糊精糖基转移酶加入量以橙皮苷重量计为8~100U/g（优选20U/g）。
所述寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物为环糊精糖基化转移酶催化橙皮苷合成寡聚葡萄糖基橙皮苷而得到的催化反应液，含有麦芽五糖基橙皮苷、麦芽四糖基橙皮苷、麦芽三糖基橙皮苷、麦芽糖基橙皮苷和α-单葡萄糖基橙皮苷中的两种或两种以上的混合物。
所述寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物由如下方法制备获得：往橙皮苷（于圆底烧瓶中，内含转子中）中加入NaOH水溶液，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入HCl水溶液，调节pH至7.0；再加入糊精，搅拌混合均匀；随后加入环糊精糖基转移酶（优选中国发明专利申请CN109652481A中使用的耐高温环糊精糖基化转移酶，实施例1），调节pH为6.0；最后加去离子水构成反应体系，在75℃油浴中催化24h，反应结束后，离心去除沉淀，取上清，得到所述寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物。
优选的，所述反应以米曲霉经发酵培养获得的上清液作为催化剂，所述上清液按如下方法制备：将米曲霉接种至发酵培养基中，在25~30℃、150~250 rpm条件下发酵4~5 d，发酵过程以25%氨水和1 mol/L 磷酸水溶液控制pH 5.0，发酵结束取发酵液离心，取上清，获得米曲霉糖化酶；所述发酵培养基组成如下：200~300 g/L玉米淀粉、30~50 g/L豆饼粉、1~5 g/L (NH4)2SO4、0.1~1.0 g/L CaCl2、30~50 g/L玉米浆，溶剂为去离子水，pH 5.0。
进一步，所述米曲霉在发酵前先进行种子扩大培养，再将种子液以体积浓度5%的接种量接种至发酵培养基，所述米曲霉种子液的制备方法：接种环取少量米曲霉菌丝体于PDA 固体培养基，28℃ 培养24 h，取少许PDA固体培养基上的菌丝体于PDA 液体培养基中，28℃培养24 h获得种子液；PDA液体培养基：土豆 200 g/L、葡萄糖 20 g/L，溶剂为水，pH自然；PDA固体培养基：土豆 200 g/L、葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，溶剂为水，pH自然。
与现有技术相比，本发明有效益主要体现在：（1）目前市售的糖化酶酶制剂，均会造成寡聚葡萄糖基橙皮苷被过度切割，造成α-单葡萄糖基橙皮苷收率低，相比之下，本发明提供的糖化酶表现出很好的专一性，可将寡聚葡萄糖基橙皮苷的多个α-葡萄糖基切割，最终积累α-单葡萄糖基橙皮苷，且对α-单葡萄糖基橙皮苷不具备切割能力。（2）关于不切割α-单葡萄糖基橙皮苷上α-葡萄糖基的糖化酶并未被报道，本发明创新性地公开了米曲霉来源的糖化酶的这一优良特性，并有效地解决了酶法生产α-单葡萄糖基橙皮苷的技术难题。
附图说明
图1为米曲霉发酵生产糖化酶的曲线图。
图2 为葡萄糖标准曲线。
图3为寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物的HPLC分析图谱。
图4 为经α-淀粉酶酶切后橙皮苷糖苷产物的HPLC分析图谱。
图5 为经β-淀粉酶酶切后橙皮苷糖苷产物的HPLC分析图谱。
图6 为经黑曲霉糖化酶酶切后的橙皮苷糖苷产物的HPLC分析图谱。
图7 为经米曲霉糖化酶酶切后的橙皮苷糖苷产物的HPLC分析图谱。
图8 为α-单葡萄糖基橙皮苷的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
PDA液体培养基：土豆 200 g/L、葡萄糖 20 g/L，溶剂为水，pH自然。
PDA固体培养基：土豆 200 g/L、葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，溶剂为水，pH自然。
发酵培养基：250 g/L玉米淀粉、40 g/L豆饼粉、2 g/L (NH4)2SO4、0.5 g/L CaCl2、40 g/L玉米浆，溶剂为去离子水，pH 5.0。
实施例1：制备米曲霉糖化酶
1、活化米曲霉
从米曲霉（Aspergillus oryzae）（代指米曲霉CICC2339、米曲霉CICC 2012、米曲霉CICC 2146等菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）的甘油菌种保藏管中挑取少量菌丝体于PDA 固体培养基上，28℃培养24 h备用。取 PDA 固体培养基上的少量菌丝体于PDA 液体培养基中，28℃培养24 h，得种子液。
2、糖化酶的制备
以5%（v/v）的接种量，将种子液接种于5L发酵罐中的3L发酵培养基中，发酵条件为转速 200 rpm，温度 28℃，用1 mol/L 磷酸水溶液和25%氨水自动调节pH5.0，发酵4 d，CICC2339（沪酿3.042）发酵过程的酶活曲线如图1所示。发酵结束后，离心取上清，得到糖化酶粗酶液2.5 L，作为米曲霉糖化酶。
3、米曲霉糖化酶酶活分析方法
1）葡萄糖标准曲线制作
用去离子水依次配制梯度浓度为10 g/L、8 g/L、6 g/L、4 g/L、2 g/L及1 g/L的葡萄糖溶液2 mL，与3 mL DNS 溶液（酒石酸钾钠18.2 g、3,5-二硝基水杨酸0.03 g、NaOH2.1g，苯酚0.5g、去离子水 100 mL）混合均匀，沸水浴10 min，测540 nm的吸光值，并绘制标准曲线，如图2所示。
2）米曲霉糖化酶酶活分析
取步骤2制备的1 mL 米曲霉糖化酶于1 mL 事先用pH 4.0 BR缓冲液（0.04 mol/L磷酸、0.04 mol/L醋酸、0.04 mol/L硼酸、0.04mol/L NaOH）配制的质量浓度4% 可溶性淀粉中，混合均匀，60℃下反应10 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴 10 min，540nm下测吸光值，对照标准曲线计算酶活。
实施例2：比较多种来源的糖化酶在制备α-单糖基橙皮苷中的应用效果
1、寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物的制备
取2g橙皮苷于圆底烧瓶（内含转子）中，加入40 ml预先配置好1mol/L NaOH水溶液，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入2mol/L HCl水溶液调节pH至7.0，再加入10g糊精，搅拌混匀，随后加入40 U耐高温的环糊精糖基转移酶（中国申请CN109652481A，实施例1），调节pH为6.0；最后加去离子水补至100ml总体积的反应体系，在75℃油浴中催化24h。反应结束后，离心去除沉淀，取上清，得到寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物100 ml，包含α-单葡萄糖基橙皮苷、麦芽糖基橙皮苷、麦芽三糖基橙皮苷、麦芽四糖基橙皮苷、麦芽五糖基橙皮苷和橙皮苷（HPLC分析图谱如图3所示）。
2、寡聚葡萄糖基橙皮苷和橙皮苷的分析检测方法
取步骤1制备的寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物1mL，0.22 μm 处理，用于高效液相色谱分析，其寡聚糖基橙皮苷系列产物及橙皮苷高效液相色谱图，如图3所示。
高效液相色谱分析条件：色谱柱：Cl8柱，250×4 .6 mm；柱温：40℃；流动相：CH3CN(乙腈)：H2O：C2HF3O2(三氟乙酸)＝20:80:1(体积比)；流速：1 mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：283 nm；进样量：10μL。结果如图3所示，橙皮苷出峰时间为7.8 min，单糖基橙皮苷的出峰时间为7.3 min，麦芽糖基橙皮苷、麦芽三糖基橙皮苷、麦芽四糖基橙皮苷和麦芽五糖基橙皮苷的出峰时间依次为 6.4 min、5.4min、5.1 min和4.8 min。
3、不同糖基水解酶对寡聚葡萄糖基橙皮苷的酶切效果
为了生产单一糖基化产物α-单葡萄糖基橙皮苷，需要将寡聚葡萄糖基橙皮苷的多个糖基切割。所以，对市场上销售的多种糖基水解酶进行酶切比较分析，如表1所示。
取1mL步骤1制备的寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物于4支2ml的EP 管中，标记A、B、C、D，按照表1分别加入50U的α-淀粉酶（购自湖南新鸿鹰生物工程有限公司）、β-淀粉酶（诺维信）、黑曲霉（Aspergillus niger）来源的糖化酶（诺维信）、米曲霉糖化酶（实施例1制备，来自CICC2339（沪酿3.042））；放置于恒温振荡混匀仪中，设置不同的温度进行酶切反应，如表1所示。取0h和2h的反应液样品，于沸水浴放置10 min，离心取上清，HPLC分析比较酶切效果，结果如图 4、图 5、图 6、图7所示。
比较四种糖基水解酶酶的酶切产物，其中α-淀粉酶和β-淀粉酶的产物中均检测到α-单葡萄糖基橙皮苷和麦芽糖基橙皮苷这两种糖基化产物（图4和图5），此外橙皮苷的含量增加，结果表明α-淀粉酶和β-淀粉酶会过度切割寡聚葡萄糖基橙皮苷，且最终得到了两种葡萄糖基橙皮苷的混合糖苷产物；黑曲霉来源的糖化酶，会切割所有的α-葡萄糖基，最终几乎只剩下底物橙皮苷（图6）；米曲霉来源的糖化酶可以有效切割寡聚葡萄糖基橙皮苷生产单一糖苷产物α-单葡萄糖基橙皮苷（图7）。所以，米曲霉糖化酶可有效地应用于α-单葡萄糖基橙皮苷的生产。
表1：不同糖基水解酶酶切寡聚葡萄糖基橙皮苷的处理
| 实验组 | A | B | C | D |
| 酶种类 | α-淀粉酶 | β-淀粉酶 | 糖化酶 | 糖化酶 |
| 来源 | 芽孢杆菌 | 大麦 | 黑曲霉 | 米曲霉 |
| 酶加量 | 50U | 50U | 50U | 50U |
| 温度/℃ | 95 | 40 | 60 | 60 |
| pH | 6 | 6 | 4 | 4 |
| 反应时间/h | 2 | 2 | 2 | 2 |
实施例3 ：米曲霉糖化酶用于制备α-单葡萄糖基橙皮苷
（1）取25g橙皮苷于圆底烧瓶（内含转子）中，加入200 ml预先配置好1mol/L NaOH水溶液，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入2mol/L HCl水溶液调节pH至7.0；往其中加入150g糊精，搅拌混匀；加入200 U耐高温环糊精糖基转移酶（中国专利申请公布号：CN109652481A，实施例1），调节pH为6.0；最后加去离子水补至500ml总体积构成反应体系，在75℃油浴中催化24h。反应结束后，离心去除沉淀，取上清，得到寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物500 ml。
（2）取步骤（1）制备的200 mL寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物于500 mL 圆底烧瓶中，加入终浓度为50 U/mL 的实施例1制备的米曲霉糖化酶，采用机械搅拌混合均匀，滴加1mol/L HCl水溶液调节pH 为 4.0，将圆底烧瓶置于60℃反应5 h。按照实施例2方法进行高效液相色谱分析，经过5 h转化反应，反应液中的α-单葡萄糖基橙皮苷的含量为8.5g/L。
α-单葡萄糖基橙皮苷的标准曲线的制备：精确称取α-单葡萄糖基橙皮苷0.03 g，用0.1% NaOH水溶液溶解并定容至 10 mL，得3.0 g/L α-单葡萄糖基橙皮苷溶液，再稀释至分析浓度，包括1.5 g/L、0.75 g/L、0.375 g/L、0.188 g/L、0.094 g/L、0.0387g/L。分析前均用0.22 μm水膜过滤。样品用于高效液相色谱分析，标准曲线如图8所示。
高效液相色谱分析条件：色谱柱：Cl8柱，250×4 .6 mm；柱温：40℃；流动相：CH3CN(乙腈)：H2O：C2HF3O2(三氟乙酸)＝20:80:1(体积比)；流速：1 mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：283 nm；进样量：10μL。
Claims (5)
1.一种利用米曲霉糖化酶制备α-单葡萄糖基橙皮苷的方法，所述方法为：以寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物为反应底物，以米曲霉来源的糖化酶为催化剂，在pH3.0~8.0、40~65℃条件下进行酶解反应2~16 h，于反应液中获得以α-单葡萄糖基橙皮苷为主的橙皮苷糖苷产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述米曲霉为（Aspergillus oryzae）为下列之一：CICC2339（沪酿3.042）。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物为环糊精糖基化转移酶催化橙皮苷合成寡聚葡萄糖基橙皮苷而得到的催化反应液，含有麦芽五糖基橙皮苷、麦芽四糖基橙皮苷、麦芽三糖基橙皮苷、麦芽糖基橙皮苷和α-单葡萄糖基橙皮苷中的两种或两种以上的混合物。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物由如下方法制备获得：往橙皮苷中加入NaOH水溶液，摇匀，使橙皮苷固体颗粒完全溶解，逐步滴加入HCl水溶液，调节pH至7.0；再加入糊精，搅拌混合均匀；随后加入环糊精糖基转移酶，调节pH为6.0；最后加去离子水构成反应体系，在75℃油浴中催化24h，反应结束后，离心去除沉淀，取上清，得到所述寡聚葡萄糖基橙皮苷混合物。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：以米曲霉经发酵培养获得的上清液作为催化剂，所述上清液按如下方法制备：将米曲霉接种至发酵培养基中，在25~30℃、150~250rpm条件下发酵4~5 d，发酵过程以25%氨水和1 mol/L 磷酸水溶液控制pH 5.0，发酵结束取发酵液离心，取上清，获得米曲霉糖化酶；所述发酵培养基组成如下：200~300 g/L玉米淀粉、30~50 g/L豆饼粉、1~5 g/L (NH4)2SO4、0.1~1.0 g/L CaCl2、30~50 g/L玉米浆，溶剂为去离子水，pH 5.0。
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