CN108913641B

CN108913641B - 一种重组大肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN108913641B
Application number: CN201810696239.5A
Authority: CN
Inventors: 陈小龙; 朱林江; 陆跃乐; 范永仙; 周瑶瑶; 张辉; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Shenzhen Shanhai Innovation Technology Co ltd
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN108913641A

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌及其应用，所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示的来源于长双歧杆菌IEF101的L‑抗坏血酸糖基化酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的。本发明采用生物法一步催化转化高效生产单一糖基化产品AA‑2G；本发明重组大肠杆菌E.coli IEF‑blsp101能够在胞内高效合成蔗糖磷酸化酶，并以L‑抗坏血酸和蔗糖为底物，高效催化L‑抗坏血酸的糖基化反应，45‑72h内催化得到90‑100g/L的AA‑2G，平均生产强度大于1.3g·L^‑1·h^‑1。

Description

一种重组大肠杆菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种含L-抗坏血酸糖基化酶基因的重组大肠杆菌及其生产2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的应用。

(二)技术背景

L-抗坏血酸(VC)是一种常见的水溶性维生素和人体所必须的营养元素，其结构如图1所示。缺乏VC会引起坏血病，心脏病，癌症等疾病，由于人体无法合成VC，因此必须从食物中获取。此外，也可作为调味剂，还原剂，抗氧化剂，漂白剂等，广泛应用于食品，化妆品和医药等领域。但是VC本身不稳定，其分子中2位和3位碳原子上的烯醇式羟基极易被氧化解离，使VC丧失还原活性，从而限制了其应用。

L-抗坏血酸衍生物主要有金属盐，酯类衍生物，葡萄糖衍生物，其中2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)因其具有强稳定性，高安全性而备受关注。AA-2G进入体内后能被α-葡萄糖苷酶分解为VC和D-葡萄糖，使VC可以在体内保持有活性的烯醇式结构，是VC的最佳替代品，目前广泛应用于化妆品、食品、医疗保健及畜牧业个水产养殖等行业。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种含有L-抗坏血酸糖基化酶基因的大肠杆菌及制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的应用，实现生物法一步催化转化，高效生产AA-2G。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)IEF101的L-抗坏血酸糖基化酶基因(GenBank登入号：MH473732)转入大肠杆菌宿主细胞获得的。

进一步，所述L-抗坏血酸糖基化酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

进一步，所述重组大肠杆菌按如下方法构建：将SEQ ID NO.1所示的L-抗坏血酸糖基化酶基因克隆到pET28a质粒上，构建pET28a-blsp重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-blsp)。

第二方面，本发明提供一种所述重组大肠杆菌在制备AA-2G中的应用，具体所述的应用以重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液、发酵液离心后的湿菌体与缓冲液或去离子水的菌悬液或菌悬液破碎液为催化剂，以L-抗坏血酸为底物，以蔗糖为辅助底物构成反应体系，在30-45℃(优选35-40℃)、pH为4.8-5.5的条件下进行反应，获得含AA-2G的反应液，分离纯化获得AA-2G。所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计，所述湿菌体含量为5-100g/L(优选5-10g/L)，底物终浓度为50-250g/L(优选100-250g/L)，所述蔗糖终浓度为200-400g/L(优选250-300g/L)。

进一步，所述催化剂为发酵液离心后的湿菌体用缓冲液或去离子水的菌悬液破碎后的破碎液，所述催化剂用量以破碎前湿菌体用量计，所述底物以一次投料法加入反应液中。

进一步，所述缓冲液为pH5.2，50mM柠檬酸钠缓冲液。

进一步，反应液的温度控制30-45℃(优选35-40℃)，反应过程控制pH4.8-5.5之间，反应48-72h。

进一步，本发明所述湿菌体按如下方法制备：(1)将重组大肠杆菌接种在含50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，30-37℃，100-250rpm培养至对数生长中期，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；

2)发酵培养：将种子液以体积5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的发酵培养基中，在30-37℃培养3-6h(优选35℃，5h)；加入终浓度为5-22g/L(优选10g/L)的α-乳糖，在22-25℃继续发酵12-18h(优选23℃、12h)，获得发酵液；所述发酵培养基质量终浓度组成：酵母粉12g/L、蛋白胨15g/L、甘油10g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

所述发酵培养还可以在发酵罐中进行：将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/L卡那霉素的发酵培养基中中，32℃培养4h；加入终浓度为5-22g/L(优选15g/L)的α-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，开始恒速补料甘油溶液，继续发酵15h，获得发酵液；所述甘油溶液终浓度组成：甘油250g/L，生物素4.5mg/L，MgSO4·7H₂O 10g/L，溶剂为去离子水。

本发明所述的L-抗坏血酸糖基化酶基因来源于长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)IEF101，其GenBank登入号为MH473732。

与现有技术相比，本发明有益效果体现在：①采用生物法一步催化转化高效生产单一糖基化产品AA-2G；②本发明重组大肠杆菌E.coli IEF-blsp101能够在胞内高效合成蔗糖磷酸化酶，并以L-抗坏血酸和蔗糖为底物，高效催化L-抗坏血酸的糖基化反应，45-72h内催化得到90-100g/L的AA-2G，平均生产强度大于1.3g·L^-1·h^-1。

(四)附图说明

图1为AA-2G结构式。

图2为pET28a-blsp载体的结构示意图。

(五)具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

LB培养基：酵母粉5.0g/L，蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

种子培养基终浓度组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

发酵培养基质量终浓度组成：酵母粉12g/L、蛋白胨15g/L、甘油10g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

实施例1含L-抗坏血酸糖基化酶基因的重组大肠杆菌E.coli IEF-blsp101的构建

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取对数生长中期的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)IEF101的基因组DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增：

bloSP-F:

GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAAAACAAAGTGCAACTCATC；

bloSP-R:

GTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAGTCGATATCGGCAATCGG。

采用南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的高效保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，其PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃1.5min，30个循环；72℃5min。

将所得的PCR产物采用PCR产物回收试剂盒纯化，采用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒One Step Cloning Kit，克隆到pET28a+质粒的Nde I和BamHI之间。pET28a+质粒用TaKaRa公司的Nde I和BamHI进行双酶切，37℃静置4h后，用DNA胶回收试剂盒纯化酶切后的pET28a+质粒。将纯化的PCR产物和酶切纯化的pET28a+质粒进行连接反应(根据试剂盒说明书操作)，转化E.coli BL21(DE3)的高效感受态细胞中，在含终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR验证阳性克隆子，并提取质粒进行测序分析。阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pET28a-blsp(图2)，其中L-抗坏血酸糖基化酶基因blsp核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其基因序列与NCBI数据库中Bifidobacterium longumsubsp.longum JCM 1217的蔗糖磷酸化酶基因(AP010888.1)相似度为99％，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

含重组质粒pET28a-blsp的阳性克隆子E.coli BL21(DE3)(pET28a-blsp)记为大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-blsp101。

实施例2、制备生产AA-2G的发酵液菌剂

实施例1制备的E.coliIFE-blsp101在含有50μg/m L卡那霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的发酵培养基中，35℃培养5h，加入终浓度为10g/Lα-乳糖，控制发酵温度23℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，继续发酵12h，获得湿菌体的含量为30g/L的发酵液，作为催化剂。

将新鲜发酵液，用去离子水稀释3倍，使湿菌体的含量为10g/L，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

实施例3菌剂在生产AA-2G中的应用

1、发酵液催化活性的检测

将实施例2方法制备的发酵液离心，取湿菌体细胞0.5g重新悬浮于50mL的pH5.2，50mM柠檬酸钠缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入终浓度210g/L的VC和270g/L的蔗糖构成50ml反应体系，在40℃水浴锅中搅拌催化反应12h，反应液用于HPLC分析，测得残留的底物VC浓度为164g/L，形成的产物AA-2G的浓度为30g/L。

液相色谱检测条件：样品前处理，取50μL反应液，加入到950μL的0.01mol/L稀盐酸中，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：C18柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：K₂HPO₄·3H₂O：0.57g/L，磷酸调pH＝2.00；流速：1mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：240nm；进样量：10μL。底物L-抗坏血酸的出峰时间一般为5.07min。产物AA-2G的出峰时间为6.3min。

2、稀释发酵液直接作为催化剂制备AA-2G

湿菌体含量5g/L的稀释发酵液催化：取20ml实施例2方法制备的发酵液，加入已调pH5.2的VC水溶液，并加入蔗糖，定容至120mL；使VC终浓度210g/L和蔗糖终浓度为270g/L，湿菌体细胞含量为5g/L，再次校正pH5.2；将反应液加入到棕色烧瓶中，在40℃水浴锅中，磁力搅拌，催化反应72h。反应液用于HPLC分析，测得残留的底物VC浓度为134g/L，形成的产物AA-2G的浓度为75g/L。

湿菌体含量10g/L的稀释发酵液催化：取40ml将实施例2方法制备的发酵液，加入已调pH5.2的VC水溶液，并加入蔗糖，定容至120L，湿菌体细胞含量为10g/L，VC终浓度210g/L，蔗糖终浓度为270g/L，调反应也pH5.2，将反应液加入到棕色烧瓶中，在40℃水浴锅中，磁力搅拌，催化反应72h，反应液用于HPLC分析，测得残留的底物VC浓度为102g/L，形成的产物AA-2G的浓度为105g/L。

3、2L发酵罐中催化剂制备及其在15L反应体系中转化的应用

(1)菌种活化

实施例1制备的大肠杆菌E.coliIFE-blsp101接种在含有50μg/mL卡那霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

(2)2L发酵罐中的催化剂制备

将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到1.5L的含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，32℃培养4h；加入终浓度为15g/L的α-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，开始恒速补料400ml的甘油溶液(甘油250g/L，生物素4.5mg/L，MgSO₄·7H₂O 10g/L)。继续发酵24h，得到用于生产AA-2G的大肠杆菌E.coliIFE-blsp101发酵液，湿菌体含量为100g/L。

(3)15L发酵液中的转化

取步骤(2)制备的2L大肠杆菌E.coliIFE-blsp101发酵液(湿菌体终浓度20g/L)，离心收集菌体后重新悬浮于8L去离子水中，用高压匀浆仪破碎细胞得到细胞破碎液，加入3.9kg蔗糖(终浓度260g/L)，并称取3.0kg(终浓度100g/L)L-抗坏血酸用7L去离子水溶解后用NaOH调节pH5.2，将底物混合后安装全自动机械搅拌，在40℃条件下进行催化反应，反应72h后得到AA-2G催化液。

(4)AA-2G产物浓度检测

样品前处理：取50μL反应液，加入950μL的0.01mol/L稀盐酸中，12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液稀释到1/10后加入液相样品瓶中；色谱柱：C18柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：K₂HPO₄·3H₂O：0.57g/L；磷酸调pH＝2.00；流速：1mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：240nm；进样量：10μL。底物L-抗坏血酸的出峰时间一般为5.07min。产物AA-2G的出峰时间为6.3min。经过72h的转化反应，测得残留的底物L-抗坏血酸浓度为159g/L，形成的产物AA-2G浓度为93g/L，其产量显著高于文献报道的环糊精糖基转移酶、α-糖苷酶、淀粉酶等催化转化AA-2G的水平(Han R etal.ApplMicrobiolBiotechnol,2012,95:313–320)。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组大肠杆菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1527

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)

<400> 1

atgaaaaaca aagtgcaact catcacatac gccgatcgtc tcggcgatgg cactcttagc 60

tcgatgaccg acatcctgcg cacccgcttc gacggcgtgt atgacggcgt gcatatcctg 120

ccgttcttca ctccgttcga tggtgcggat gcaggcttcg acccgatcga ccataccaaa 180

gtcgacgaac gtctcggcag ctgggacgac gtcgccgaac tctccaagac ccacaacatc 240

atggtcgacg ccatcgtcaa ccacatgagt tgggaatcca agcagttcca agacgtgctt 300

gaaaaaggtg aggaatccga gtattacccg atgttcctga ccatgagctc cgtcttcccg 360

aacggcgcca ccgaagaaga cctggccggc atctaccgcc cgcgcccggg cctgccgttc 420

acccactaca agttcgccgg caagacgcgc ttggtctggg tgagcttcac cccgcagcag 480

gtggacatcg acactgattc cgccaagggt tgggaatacc tgatgtcgat cttcgatcag 540

atggccgcca gccacgtgcg ctacatccgt ctcgacgccg tgggctacgg cgccaaggaa 600

gccggcacca gctgcttcat gacccccaag acgttcaagc tcatctcccg cctacgcgag 660

gaaggcgtca agcgaggcct tgaaatcctc atcgaggttc acagctacta caagaagcag 720

gtggaaatcg cctccaaggt ggaccgcgtc tacgatttcg ccctgccgcc gctgcttctg 780

cactcgctgt tcaccggtca cgtcgaaccc gtggcccact ggaccgagat ccgcccgaac 840

aacgccgtca ccgtactcga tacgcacgac ggcatcggcg tgatcgacat cggctccgat 900

cagctcgacc gcagcctcaa gggcctcgtg cccgacgagg acgtcgataa tctggtcaac 960

accatccatg ccaacaccca cggcgaatcc caggccgcca ccggtgccgc cgcgtccaac 1020

ctcgacctct accaggtcaa ctccacgtac tactcggccc tcggctgcaa cgaccagcac 1080

tacttggccg cccgcgccgt gcagttcttc ctgccgggcg tgccgcaggt ctactacgtg 1140

ggcgcgctcg ccggccgcaa cgacatggaa ctgctgcgcc gcaccaacaa cggccgcgac 1200

atcaaccgcc actactactc caccgccgaa atcgatgaaa acctcgaacg cccggtggtc 1260

aaggccctga acgccctggc caagttccgc aacgagctgt ctgcattcga tggcgagttc 1320

agctacgagg tcgatggcga cacgtccatc accttccgct ggaccgccgc cgacggcacg 1380

tccacggccg ccctcacctt cgagcccgga cgcggcctcg gcacagacaa caccaccccg 1440

gttgccagcc ttgcctggag cgatgccgcc ggcgaccacg aaacccgcga tctgctcgcc 1500

aacccgccga ttgccgatat cgactaa 1527

<210> 2

<211> 508

<212> PRT

<213> 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)

<400> 2

Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp

1 5 10 15

Gly Thr Leu Ser Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly

20 25 30

Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly

35 40 45

Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg

50 55 60

Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile

65 70 75 80

Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe

85 90 95

Gln Asp Val Leu Glu Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe

100 105 110

Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu

115 120 125

Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys

130 135 140

Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln

145 150 155 160

Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Ala Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser

165 170 175

Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Arg Tyr Ile Arg Leu Asp

180 185 190

Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr

195 200 205

Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys

210 215 220

Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln

225 230 235 240

Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro

245 250 255

Pro Leu Leu Leu His Ser Leu Phe Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala

260 265 270

His Trp Thr Glu Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr

275 280 285

His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg

290 295 300

Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn

305 310 315 320

Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Gln Ala Ala Thr Gly Ala

325 330 335

Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser

340 345 350

Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Val Gln

355 360 365

Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala

370 375 380

Gly Arg Asn Asp Met Glu Leu Leu Arg Arg Thr Asn Asn Gly Arg Asp

385 390 395 400

Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Glu

405 410 415

Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu

420 425 430

Leu Ser Ala Phe Asp Gly Glu Phe Ser Tyr Glu Val Asp Gly Asp Thr

435 440 445

Ser Ile Thr Phe Arg Trp Thr Ala Ala Asp Gly Thr Ser Thr Ala Ala

450 455 460

Leu Thr Phe Glu Pro Gly Arg Gly Leu Gly Thr Asp Asn Thr Thr Pro

465 470 475 480

Val Ala Ser Leu Ala Trp Ser Asp Ala Ala Gly Asp His Glu Thr Arg

485 490 495

Asp Leu Leu Ala Asn Pro Pro Ile Ala Asp Ile Asp

500 505

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示的来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)IEF101的L-抗坏血酸糖基化酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的。

2.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述L-抗坏血酸糖基化酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌按如下方法构建：将SEQ ID NO.1所示的L-抗坏血酸糖基化酶基因克隆到pET28a质粒上，构建pET28a-blsp重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-blsp)。

4.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用是将重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液、发酵液离心后的湿菌体与缓冲液或去离子水的菌悬液或菌悬液破碎液为催化剂，以L-抗坏血酸为底物，以蔗糖为辅助底物构成反应体系，在30-45℃、pH为4.8-5.5的条件下进行反应，获得含2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的反应液，分离纯化，获得2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计，所述湿菌体含量为5-100g/L，L-抗坏血酸终浓度为50-250g/L，所述蔗糖终浓度为200-400g/L。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述催化剂为发酵液离心后的湿菌体用缓冲液或去离子水的菌悬液破碎后的破碎液，所述催化剂用量以破碎前湿菌体用量计。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH5.2，50mM柠檬酸钠缓冲液。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：(1)将重组大肠杆菌接种在含50mg/L卡那霉素的种子培养基中，30-37℃、180-250rpm培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO₄·12H₂O8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0；

(2)发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的发酵培养基中，在30-37℃培养4-6h；加入终浓度为5-22g/L的α-乳糖，在22-25℃继续发酵12-18h，得到发酵液；所述发酵培养基质量终浓度组成：酵母粉12g/L、蛋白胨15g/L、甘油10g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于步骤(2)发酵培养方法为：将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，32℃培养4h；加入终浓度为5-22g/L的α-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧DO大于20％，pH6.8，恒速补料甘油溶液；继续发酵15h，获得发酵液；所述甘油溶液终浓度组成：甘油250g/L，生物素4.5mg/L，MgSO₄·7H₂O 10g/L，溶剂为去离子水；所述甘油溶液与发酵培养基体积比为1:3.75。