CN116731997A - 一种定点突变的蔗糖磷酸化酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，涉及一种定点突变的蔗糖磷酸化酶及其应用。本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶(BiSPase)中制造点突变获得，所述点突变的突变位点是选自：第141位和/或第197位。优选地，其所述第141位的点突变为苏氨酸突变为半胱氨酸；所述第197位的点突变为甘氨酸突变为半胱氨酸。本发明所提供的蔗糖磷酸化酶变体酶的催化效率明显提高，从而可以提高L‑抗坏血酸葡萄糖苷的产率，降低生产成本，解决了现有技术中蔗糖磷酸化酶部分受体特异性低、酶活低的问题，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种定点突变的蔗糖磷酸化酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，涉及一种定点突变的蔗糖磷酸化酶及其应用。

背景技术

L-抗坏血酸(L-ascorbic acid,LAA)又称维生素C，是人体必需的维生素和天然抗氧化剂，具有保护作用的抗氧化剂，在维持人体健康中承担重要的角色。但是，LAA的高抗氧化活性限制了其重要的应用，例如在化妆品和食品中，需要LAA的持久效果。2-O-alpha-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(2-O-alpha-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G)，在稳定性和人类的生物利用度之间提供了一个实际的妥协，因为它可以被上皮组织中广泛存在的α-葡萄糖苷酶缓慢水解，释放出LAA发挥生理作用。AA-2G已经是一种工业化生产的精细化学品，在皮肤护理化妆品中具有既定的用途，其另一个重要用途是作为药品、食品中的LAA补充剂。

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,SPase)是糖苷水解家族GH13(GH13_18)亚家族18的成员，可催化蔗糖可逆磷酸化为α-D-葡萄糖-1-磷酸和果糖。SPase也是一种公认的转糖苷酶，广泛用于合成多种糖苷，其中一个重要应用是该酶可以以蔗糖为糖基供体高效催化L AA糖基化一步法直接生成AA 2G。虽然SPase具有较好的工业应用前景，但其产率低。因此，需要进行天然SPase的基因修饰，实现其催化效率的提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定点突变的蔗糖磷酸化酶，所提供的变体酶催化效率明显提高，从而可以提高L-抗坏血酸葡萄糖苷的产率，降低生产成本，解决了现有技术中蔗糖磷酸化酶部分受体特异性低、酶活低的问题，具有广阔的工业应用前景。

本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶(BiSPase)中制造点突变获得，所述点突变的突变位点是选自：第141位和/或第197位。

优选地，其所述第141位的点突变为苏氨酸突变为半胱氨酸。

优选地，所述第197位的点突变为甘氨酸突变为半胱氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种DNA分子，其编码本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶。

根据本发明所述的DNA分子的进一步特征，所述DNA编码的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列是选自：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

具体来说，SEQ ID NO.2中，第141位的苏氨酸突变为半胱氨酸。SEQ ID NO.3中，第197位的甘氨酸突变为半胱氨酸。SEQ ID NO.4中，第141位的苏氨酸突变为半胱氨酸，同时第197位的甘氨酸突变为半胱氨酸。

本发明的第三个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者含有本发明所述的载体。

本发明的第五个目的是提供一种本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶的生产方法。

本发明所述的生产方法包括：在适于蔗糖磷酸化酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的蔗糖磷酸化酶。

本发明的第六个目的是提供本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶在制备L-抗坏血酸葡萄糖苷中的应用。

本申请所述的蔗糖磷酸化酶突变体是在长双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶的基础上进行定点突变而获得的，提高了蔗糖磷酸化酶的酶活，有利于扩大蔗糖磷酸化酶转糖苷作用于工业化的应用前景，实现大规模工业化应用。

附图说明

图1为蔗糖磷酸化酶BiSPase及其突变体诱导表达并分离纯化后的SDS PAGE图谱。

图2为BiSPase^T141C/G197C第24h的催化液的液质联用色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“wtBiSPase”表示野生型蔗糖磷酸化酶，其基因以斜体wtBiSPase表示。

“BiSPase^T141C/G197C”表示突变体蔗糖磷酸化酶BiSPase^T141C/G197C，其基因以BiSPase^T141C/G197C表示。

“BiSPase^T141C”表示突变体蔗糖磷酸化酶BiSPase^T141C，其基因以BiSPase^T141C表示。

“BiSPase^G197C”表示突变体蔗糖磷酸化酶BiSPase^G197C，其基因以BiSPase^G197C表示。

一种定点突变的蔗糖磷酸化酶，突变体为在BiSPase氨基酸序列SEQ ID NO.1基础上含有如下两个位点的单点突变或两点组合突变：第141位苏氨酸(T141)、第197位甘氨酸(G197)；这些位点的突变可以使得酶催化L抗坏血酸糖基化活性提升，提高反应速率和底物转化率，有效地提高产物AA-2G的含量。

本发明包括如下突变体：

突变体1：将如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第141位的苏氨酸替换为半胱氨酸，即突变体BiSPase^G197C；

突变体2：将如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第197位的甘氨酸替换为半胱氨酸，即突变体BiSPase^T141C；

突变体3：将如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第197位的甘氨酸替换为半胱氨酸，第141位的苏氨酸替换为半胱氨酸，即突变体BiSPase^T141C/G197C。

任何上述突变体氨基酸序列中氨基酸经过缺失，插入或者替换一个或几个氨基酸且具有L抗坏血酸转糖基活性的，仍属于本发明的保护范围。

本发明所述的一种重组蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，诱导获得重组蔗糖磷酸化酶突变体蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的蔗糖磷酸化酶突变体蛋白的培养基，LB培养基：酵母提取物5g·L^-1，细菌蛋白胨10g·L^-1，氯化钠10g·L^-1。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生蔗糖磷酸化酶突变体蛋白即可。

优选方法如下：将本发明涉及的重组大肠杆菌接种至含50 100mg/L卡那霉素的LB培养基中，当培养密度OD_600nm为0.5至0.8时，添加终浓度为0.25～0.5mM异丙基βD硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，可诱导高效表达本发明的重组蔗糖磷酸化酶突变体蛋白。

得到催化生产L-抗坏血酸葡糖苷的催化剂的制备方法如下：

种子活化：将含蔗糖磷酸化酶BiSPase突变体编码基因的重组大肠杆菌涂布于含50～100mg/L卡那霉素的LB固体培养基，在37℃静置培养12～20h后获得单菌落；所述的LB固体培养基是在LB培养基中加入1.5～2.0％的琼脂。

种子培养：挑取LB固体培养基上的单菌落接种至含有50～100mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃培养8～16h后，获得种子液。

诱导表达:将种子液以体积浓度1～2％的接种量接种至装有50mL含有终浓度为50～100mg/L卡那霉素的LB培养基的250mL摇瓶中，37℃摇床200rpm培养至OD600nm＝0.50.8，加入终浓度为0.25～0.5mM的IPTG，于24 26℃摇床200rpm诱导6 24h。

本发明的应用：蔗糖磷酸化酶突变体或其基因工程菌可以以游离酶、固定化酶以及重组有力细胞的形式催化合成AA-2G。

实施例1：表达wtBiSPase重组蛋白的大肠杆菌构建

来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的蔗糖磷酸化酶基因wtBiSPase，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明在基因的5′端和3′端分别添加BamHI和EcoRI限制性核酸内切酶的酶切位点，将目的基因序列进行密码子优化且选择pET28a(+)作为表达载体，得到重组载体pET28a(+)-BiSP。由上海捷瑞生物工程有限公司合成该重组载体。将重组载体pET28a(+)-BiSP转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，随机挑选单菌落进行测序验证，结果表明含有蔗糖磷酸化酶BiSPase基因的重组表达载体成功转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，最终获得wtBiSPase重组蛋白表达菌株。

实施例2：表达突变体蛋白的大肠杆菌构建

(1)以实施例1中含有目的基因的质粒pET28a(+)-BiSP为模板进行重叠PCR，分别以表1所示的引物BiSP-F-BamHI/G197C-R和BiSP-R-EcoRI/G197C-F为引物，PCR程序如表2，回收PCR产物以获得突变体BiSPase^G197C基因的上、下游同源臂G197C-up和G197C-dn。

以回收得到的G197C-up和G197C-dn为模板，BiSP-F-BamHI/BiSP-R-EcoRI为引物，通过重叠PCR扩增得到BiSPase^G197C目的基因。用EcoRI和BamHI双酶切处理BiSPase^G197C，纯化回收后与同样双酶切获得的pET-28a(+)载体用T4连接酶连接，所得酶连产物转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆抽提质粒后用EcoRI和BamHI双酶切鉴定，重组表达质粒进行测序，获得质粒pET28a(+)-BiSPase^G197C。

(2)以实施例1中含有目的基因的质粒pET28a(+)-BiSP为模板进行重叠PCR，分别以表1所示的引物BiSP-F-BamHI/T141C-R和BiSP-R-EcoRI/T141C-F为引物，PCR程序如表2，回收PCR产物以获得突变体BiSPase^T141C基因的上、下游同源臂T141C-up和T141C-dn。

以回收得到的T141C-up和T141C-dn为模板，BiSP-F-BamHI/BiSP-R-EcoRI为引物，通过重叠PCR扩增得到BiSPase^T141C目的基因。用EcoRI和BamHI双酶切处理BiSPase^T141C，纯化回收后与同样双酶切获得的pET-28a(+)载体用T4连接酶连接，所得酶连产物转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆抽提质粒后用EcoRI和BamHI双酶切鉴定，重组表达质粒进行测序，获得质粒pET28a(+)-BiSPase^T141C。

(3)以得到的质粒pET28a(+)-BiSPase^G197C为模板进行重叠PCR，分别以表1所示的引物BiSP-F-BamHI/T141C-R和BiSP-R-EcoRI/T141C-F为引物，PCR程序如表2，回收PCR产物以获得突变体BiSPase^T141C/G197C基因的上、下游同源臂T141C/G197C-up和T141C/G197C-dn。

以回收得到的T141C/G197C-up和T141C/G197C-dn为模板，BiSP-F-BamHI/BiSP-R-EcoRI为引物，通过重叠PCR扩增得到BiSPase^T141C/G197C目的基因。用EcoRI和BamHI双酶切处理BiSPase^T141C/G197C，纯化回收后与同样双酶切获得的pET-28a(+)载体用T4连接酶连接，所得酶连产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆抽提质粒后用EcoRI和BamHI双酶切鉴定，重组表达质粒进行测序，获得质粒pET28a(+)-BiSPase^T141C/G197C。

(4)将获得的质粒pET28a(+)-BiSPase^T141C、pET28a(+)-BiSPase^G197C和pET28a(+)-BiSPase^T141C/G197C直接转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，随机挑选单菌落进行测序验证，结果表明含有蔗糖磷酸化酶BiSPase突变体基因的重组表达载体成功转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，最终分别获得突变株T141C，G197C，T141C/G197C。

表1：突变体构建引物

引物	序列(5’-3’)
		BiSP-F-BamHI	CGCGGATCCATGAAGAACAAGGTTCAATTGA
BiSP-R-EcoRI	CCGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGATCAATA
		G197C-R	GGAAGTTCCAGCTTCCTTAGCGCAGTATCCAACAGCATCCAAT
G197C-F	TTAGATTGGATGCTGTTGGATACTGCGCTAAGGAAGCTGG
		T141C-R	AGTCTTACCAGCAAACTTGTAATGGCAAAATGGCAATCCTGG
T141C-F	GACCTAGACCAGGATTGCCATTTTGCCATTACAAGTTTGC

表2：重叠延伸PCR程序

预变性	PCR体系	反应循环数
			94℃，5min	94℃10s，55℃5s，72℃30s	35
98℃，min	98℃10s，55℃30s，72℃10min	35

实施例3：wtBiSPase及突变体的表达与纯化

将质粒pET28a(+)-BiSP导入BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性克隆于50mL含有50μg/mL Kan抗生素的LB培养基中，37℃，225rpm摇床孵育10h，取1mL菌液于50mL含有Kan抗生素的LB培养基中37℃，225rpm培养至OD达到0.5左右，加入0.5M的IPTG 50μL，转至20℃，225rpm发酵培养6-24h后，分别收集培养液于4℃12000g离心10min。将收集的菌体用50mMTris-HCl(pH＝7.5)洗涤两次，加入适量的20mM磷酸缓冲液(pH＝7.4)，置于冰水上超声破碎30min。破碎完毕后，4℃，12000g离心10min收集上清液，用于蛋白胶鉴定。上清液使用0.45μm的滤膜过滤，使用镍柱(His TrapTM HP 1mL)纯化。上样缓冲液为：500mM NaCl，50mMNaH₂PO₄，50mM Na₂HPO₄，pH 7.4，洗脱缓冲液为：250mM咪唑，500mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，50mMNa₂HPO₄，pH 7.4。纯化后得到的目的蛋白用SDS PAGE进行分析。

图1为蔗糖磷酸化酶wtBiSPase及其突变体诱导表达并分离纯化后的SDS PAGE图。其中Lane M，Marker；Lane 1，BiSPase细胞破碎上清液；Lane2：BiSPase细胞破碎液沉淀；Lane 3：纯化的蛋白质wtBiSPase；Lane 4：G197C；Lane 5：T141C；Lane 6：T141C/G197C。结果表明，经Ni NTA亲和层析，得到电泳纯的重组蔗糖磷酸化酶及其突变体。

实施例4：蔗糖磷酸化酶突变体催化效率和合成AA-2G的分析

将经过实施例3纯化的重组蔗糖磷酸化酶wtBiSPase、BiSPase^T141C、BiSPase^G197C和BiSPase^T141C/G197C进行转糖苷反应合成AA-2G。

反应体系1mL：

1.2M L抗坏血酸终浓度，0.8M蔗糖终浓度，调节底物pH5.2，加入终浓度为0.4mg/mL的纯酶，于40℃，1000rpm金属震荡仪中反应12-36h。

酶活定义：在上述条件下，每分钟生成1μmol AA 2G所需的酶量定义为一个酶活单位，计1U。其中，wtBiSPase的相对活性为100。wtBiSPase及其突变体催化相应底物效率和AA-2G产量，其结果如表3所示。

表3wtBiSPase及其突变体相对酶活力及其AA-2G产量

突变体	与野生型相比相对酶活力提高	AA-2G产量(g/L)
			wtBiSPase	-	123
BiSPaseT141C	119％	151
			BiSPaseG197C	151％	193
BiSPaseT141C/G197C	166％	215

AA-2G的高效液相色谱(HPLC)检测：色谱柱为Acclaim 120 C18(5μm，4.6×250mm)。紫外检测波长为238/243nm。流动相为100mM的KH₂PO₄，用磷酸调pH至2.0，流速0.8mL/min，时间为20min，进样量0.5μL，柱温为25℃。HPLC图谱中AA-2G的峰面积和浓度成正比，以此绘制AA-2G标准曲线。利用标准曲线及样品中的AA-2G的峰面积，得出样品中AA-2G的浓度。

图2为BiSPase^T141C/G197C第24h的催化液的液质联用色谱图。

实验结果分析：本发明所提供的蔗糖磷酸化酶BiSPase突变体与野生型相比较，有更优良的催化活性，蔗糖磷酸化酶突变体催化合成AA-2G的浓度在154～215g/L，蔗糖磷酸化酶突变体可以更好地应用于生物催化领域，对AA-2G的工业化生产及应用有重要意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种定点突变的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶(BiSPase)中制造点突变获得，所述点突变的突变位点是选自：第141位和/或第197位。

2.根据权利要求1所述定点突变的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述第141位的点突变为苏氨酸突变为半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述定点突变的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述第197位的点突变为甘氨酸突变为半胱氨酸。

4.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求1所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于：其编码的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列是选自：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

6.一种载体，其特征在于：其含有权利要求4或5所述的DNA分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求4或5所述的DNA分子，或者含有权利要求6所述的载体。

8.一种如权利要求1所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于蔗糖磷酸化酶表达的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的蔗糖磷酸化酶。

9.如权利要求1所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶在制备L-抗坏血酸葡萄糖苷中的应用。