CN114231545B

CN114231545B - 一种鼠李糖转移酶基因、制备方法及其表达和应用

Info

Publication number: CN114231545B
Application number: CN202010940331.9A
Authority: CN
Inventors: 王彩霞; 陈士林; 薛强; 苏新尭; 刘佳柔; 于宛彤
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2040-09-09
Also published as: CN114231545A

Abstract

本发明属于基因工程和生物技术领域，公开了一种鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T、制备方法及其表达和应用，将该基因构建于蛋白表达载体上，转化至宿主菌株中进行高效表达，获得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白，再利用重组蛋白，以橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷和UDP‑鼠李糖为底物，催化生成新橙皮苷。本发明丰富了糖基转移酶的基因库数据，且制备新橙皮苷的工艺方法简单、产量高、成本低，解决了新橙皮苷生产成本高的问题。本发明的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T表达制备重组蛋白；重组蛋白适用于制备新橙皮苷。

Description

一种鼠李糖转移酶基因、制备方法及其表达和应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，涉及一种鼠李糖转移酶基因，具体地说是一种鼠李糖转移酶基因、制备方法及其表达和应用。

背景技术

新橙皮苷属于黄酮类化合物中的二氢黄酮类化合物，它首先被发现于植物中，通常在酸橙、枳壳、枳实、未成熟的柚子中分布。新橙皮苷分子式为C₂₈H₃₄O₁₅，分子量为610.56，结构式为：

新橙皮苷对大鼠平滑肌的非生理性收缩具有抑制作用，并且可以对抗氯化钡、乙酰胆碱引起的痉挛性收缩，此外还具有抗菌消炎的作用。新橙皮苷具有较好的耐热、耐酸性，可作为食品添加剂使用。90年代中期，美国化学家在实验室中将新橙皮苷经高压氢化后生成一种全新甜味剂-新橙皮苷二氢查尔酮，其甜味相当于蔗糖的1500-1800倍。它不仅甜度高于糖精、甜蜜素、阿斯巴甜等常用的甜味剂，而且适口性好，口感近似于白糖。新橙皮苷二氢查尔酮也是苦味屏蔽剂，用于苦味药片(或液体制剂)中以矫正化学药的强烈苦味，提高片剂或液体药剂的适口性。随着近些年对新橙皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的深入研究，发现了更多的价值和用途，对新橙皮苷的需求量也随之增大。因为可供提取新橙皮苷的天然药用植物较少且新橙皮苷在植物中的含量较低，且新橙皮苷在植物中常常与橙皮苷、柚皮苷等许多结构非常相似的黄酮类化合物共存，分离比较困难，导致新橙皮苷的供应无法满足市场需求。

又因为新橙皮苷结构复杂，难以通过全合成的方式来合成。现在一般是通过从植物提取与它结构类似的柚皮苷后再经化学方法转化制得。而其中的化学转化法，一种是将柚皮苷直接与大大过量的异香兰素(过量12倍)在碱性水溶液或碱性醇溶液中反应后，再经酸化制得；另一种是将柚皮苷在碱性水溶液中水解后，所得根皮乙酰苯-4′-β-新橙皮糖苷再与大大过量异香兰素在碱性水溶液或碱性醇溶液中反应，然后经酸化制得。这两类方法都存在收率低、原料异香兰素消耗量大、成本高等问题。美国发明专利US3947405中公开了使用四氢吡咯和乙酸为催化剂，以摩尔比1∶1的根皮乙酰苯-4′-B-新橙皮糖苷与异香兰素于无水乙醇中，经氩气保护反应12小时，合成新橙皮苷。但该方法仍存在工艺严苛、操作复杂、生产周期较长、成本高等问题。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种鼠李糖转移酶基因，以获得具有优化效果的鼠李糖转移酶基因，进而解决新橙皮苷生产成本高的问题；

本发明的另一个目的，是要提供上述鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的表达和应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T，所述鼠李糖转移酶基因为鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述鼠李糖转移酶基因的一种制备方法，是取酸橙提取RNA，经反转录得其cDNA，再以该cDNA为模板，利用KOD高保真酶进行克隆，然后以CaRa1,2T-F和CaRa1,2T-R为扩增引物进行扩增后，制得所述鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T。

本发明还公开了鼠李糖转移酶基因的另一种制备方法，是利用基因序列合成，按照上述公开的序列进行基因化学全合成，制得所述鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T。

包含上述鼠李糖转移酶基因的重组载体。

包含上述鼠李糖转移酶基因的重组表达菌株；

所述包含鼠李糖转移酶基因的重组载体及将重组载体导入宿主菌后所得的重组表达菌株也属于本发明保护范围，所述重组载体是所有包含上述鼠李糖转移酶基因的重组载体(也可以称为重组质粒)，所述重组表达菌株是所有包含上述鼠李糖转移酶基因的重组表达菌株，宿主菌可选用大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌；所述重组载体可选用下述重组质粒，所述重组表达菌株可选用下述重组表达菌株，但不限于下述重组质粒和重组表达菌株，应理解为，本发明要求保护的技术方案中所涉及的重组载体为将所述鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到本领域技术人员能够购买到的任一表达载体(也可以称为表达质粒)；重组菌株为将上述表达载体导入宿主菌后所得的任一重组表达菌株；

所述重组载体可以是重组质粒pET-28a(+)-CaRa1,2T；所述重组质粒pET-28a(+)-CaRa1,2T的制作方法是将所述的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到pET-28a(+)质粒上的BamHI和EcoRI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控；

所述重组载体可以是重组质粒pPIC9K-CaRa1,2T-T；所述重组质粒pPIC9K-CaRa1,2T-T的制作方法是将所述的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到pPIC9K质粒上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控；

所述重组载体可以是重组质粒pYES3-CT-CaRa1,2T；所述重组质粒pYES3-CT-CaRa1,2T的制作方法是将所述的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到pYES3-CT质粒上的BamHI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于Gal1启动子的下游并受其调控；

所述重组载体可以是重组质粒PAX1-CaRa1,2T；所述重组质粒PAX1-CaRa1,2T的制作方法是将所述的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到PAX1质粒上的NotI和SamI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于依赖性σA启动子的下游并受其调控；

所述鼠李糖转移酶基因的重组菌株可以是鼠李糖转移酶的重组表达菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CaRa1,2T)；

所述鼠李糖转移酶的重组表达菌株大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(pET28a-CaRa1,2T)是重组质粒pET-28a(+)-CaRa1,2T导入大肠杆菌宿主菌E.coliBL21(DE3)的感受态细胞中制得；

所述鼠李糖转移酶基因的重组菌株可以是鼠李糖转移酶的重组表达菌株毕赤酵母Pichia pastoris(PAX1-CaRa1,2T)；

所述鼠李糖转移酶的重组表达菌株毕赤酵母Pichia pastoris(PAX1-CaRa1,2T)是重组质粒PAX1-CaRa1,2T导入毕赤酵母Pichia pastoris的感受态细胞中制得；

所述鼠李糖转移酶基因的重组菌株可以是鼠李糖转移酶的重组表达菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(pYES3-CT-CaRa1,2T)；

所述鼠李糖转移酶的重组表达菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(pYES3-CT-CaRa1,2T)是重组质粒pYES3-CT-CaRa1,2T导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的感受态细胞中制得；

所述鼠李糖转移酶基因的重组菌株可以是鼠李糖转移酶的重组表达菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis(PAX1-CaRa1,2T)；

所述鼠李糖转移酶的重组表达菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis(PAX1-CaRa1,2T)是重组质粒PAX1-CaRa1,2T导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis的感受态细胞中制得。

本发明还提供了表达上述鼠李糖转移酶基因的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

作为一种限定，所述重组蛋白是取包含鼠李糖转移酶基因的重组表达菌株进行培养，诱导蛋白表达后，然后经纯化处理制得。

本发明也提供了上述重组蛋白的一种应用，所述重组蛋白用于制备新橙皮苷。

作为一种限定，该应用是以橙皮素-7-O-葡萄糖苷和糖基供体UDP-鼠李糖为底物，在所述重组蛋白的催化作用下生成新橙皮苷。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

新橙皮苷是中药枳实中有效成分，在特定枳实品种中新橙皮苷含量很高。本发明以NCBI数据库中枳实转录组测序数据为基础，进行拼接和组装，完成基因注释，通过对表达量高低进行测试，最终筛选出表达量最高的5条候选鼠李糖转移酶基因进行引物设计合成，再经基因扩增和后续的表达、催化反应物进行验证，成功获得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T。鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的表达、催化反应物是将其构建于蛋白表达载体上，转化至宿主菌株中进行高效表达，快速获得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白，实现重组蛋白的快速高效富集，再利用重组蛋白，以橙皮素-7-O-葡萄糖苷和UDP-鼠李糖为底物，催化生成新橙皮苷，成功的实现了新橙皮苷的体外合成。本发明制备新橙皮苷的工艺方法简单、绿色环保；本发明还丰富了糖基转移酶的基因库数据。

本发明的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T表达制备重组蛋白；重组蛋白适用于制备新橙皮苷。

附图说明

图1是本发明实施例1中5条候选基因对应引物进行扩增后的基因与Marker的凝胶电泳实验对比图；

图2是本发明实施例3中阳性菌株pET-28a(+)-CaRa1,2T/E.coli BL21(DE3)测序验证的结果；

图3是本发明实施例3中鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白和蛋白Marker的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验图；

图4是本发明实施例4中橙皮素-7-O-葡萄糖苷的标准曲线；

图5是本发明实施例4中新橙皮苷的标准曲线；

图6是本发明实施例4中橙皮素-7-O-葡萄糖苷标准液、新橙皮苷标准液、未添加重组蛋白的对照液N和反应液M的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

KOD高保真酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；

扩增引物CaRa1,2T-F、CaRa1,2T-R、BamHI-CaRa1,2T-F、EcorI-CaRa1,2T-R委托生工生物工程上海股份有限公司合成；

序列如下：

CaRa1,2T-F：ATGGAAAGCAAACTCCAAAACAAGA；

CaRa1,2T-R：CTAACTAGGTACCTTGACAAGCTGC；

BamHI-CaRa1,2T-F：

CCAGGATCCATGGAAAGCAAACTCCAAAACAAGA；

EcorI-CaRa1,2T-R：ACCGAATTCCTAACTAGGTACCTTGACAAGCTGC；

pEASY-Blunt载体、BamHI、EcorI，NotI等限制性内切酶、T4 DNA Ligase、蛋白Marker(DR201-01)、大肠杆菌E.coli DH5α,E.coli BL21(DE3)购自购自北京全式金生物科技有点公司；pET-28a(+)、pYES3、pPIC9K、酿酒酵母、毕赤酵母购自NTCC保藏中心；枯草芽孢杆菌购自TAKARA公司；橙皮素-7-O-葡萄糖苷、新橙皮苷购自Sigma公司。

实施例1催化生成新橙皮苷的鼠李糖转移酶CaRa1,2T的候选基因筛选

下载NCBI数据库中酸橙的转录组序列(Accession:ERX705489)，拼接和组装转录组数据并进行基因注释，通过对表达量高低进行测试，筛选鼠李糖转移酶序列碎片，再以公开报道的梁平柚中鼠李糖转移酶(Genbank NO.AY048882)序列作为参考，筛选得到与其蛋白相似度最高的20条序列，选取bit score分值最高的前5条序列为候选基因，进行候选基因功能鉴定，委托生工生物工程上海股份有限公司分别合成这5条候选基因对应的引物。

以新鲜酸橙(Citrus aurantium L.)为原材料(酸橙为市售的普通酸橙)，提取RNA，经反转录后得其cDNA，再以该cDNA为模板，分别使用5条候选基因对应的引物，利用KOD高保真酶按照其说明书进行PCR扩增，具体条件为95℃预变性5min，98℃预变性10s，58℃预变性30s，68℃预变性1min，进行35个循环后，68℃延伸10min，获得4条鼠李糖转移酶序列(1条未扩增成功)。4条鼠李糖转移酶序列中包括本发明的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T(剩余3条鼠李糖转移酶序列在进行后续表达、催化反应物中，未得到理想的产物，本发明中不对这3条鼠李糖转移酶序列进行保护，后续不再进行赘述)，对其和Marker(DL2000)进行凝胶电泳实验，实验结果参见图1，其中电泳图中泳道M为DL2000 PLUS Marker，泳道1～5依次为5条候选基因对应引物进行扩增所得的基因，泳道1为本发明的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T，由图可知，第5条候选基因对应引物进行扩增未获得对应基因，本发明的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的大小为1362bp。

鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的序列为SEQ ID NO：1，具体基因序列如下：

ATGGAAAGCAAACTCCAAAACAAGAAGCCAAGTATTCTGATGTTACCATGGCTAGCTCATGGCCACATAACTCCATATCTTGCGCTTGCCAAGAAGCTCTCGCAACAAAACTTTCACATATATTTCTGCTCTACTCCCATCAATCTACAATCCATGAGCCAAAATCTTCAAGAAAAATTTTCAACTTCAATACAGCTTATAGACCTCCAACTTCCTTGTACGTTTCCTGAACTTCATGATCCATATAATCACACCACCAAAAACATTCCCCGCCATCTGATCCCCACTCTCATAGCAGCATTTGATGCCGCAAAACCTGCATTTTGCAATGTTCTGGAGACCCTTAAACCAACCCTAGTAATATATGATCTATTCCAGCCATGGGCCGCTGAGGCAGCTTATCAGCATGACATTGCTGCTGTTGCGTTCGTAATCATTGCTGCAGCAGGCTTTTCTTTTTTTCTTCAGAATTCCAGCTTGAAATTCCCTTTCCCAGAATTTGATCTGCCTGAGTCAGAAATCCAGAAAATGACCCAGTTCAAGCATCGTATTGTGAACGGCACCGAAAATAGGGACAGGTTCTTAAAAGCTATTGATCTGTCTTGCAAACTAGTCTTGGTAAAAACCTCAAGAGAGATCGAATCCAAGTATTTGGATTACTTGTCGTATCTAACAAAAAAAGAAACTATCCCGGTTGGGCCTCTAGTTCAAGAACCTATATACACAGACAATAATAATGATACAAAGATCATGGACTGGCTGAGCAGAAAGGAGCCTTCTTCAGTTGTGTACGTATCATTTGGCAGTGAGTACTTTCTTTCCAAGGAAGAAATGAATGAGATAGCTAGTGGGTTATTGCTCAGCGAGGTTAGTTTTATATGGGTTGTGAGATTTCATTCTGAAGGAAACTTTACTATCGAGGAGGCACTGCCTCAAGGCTTTGCTGAGGAGATTCAAGGGAATAATAAGGGGATGGTAGTGCAAGGTTGGGCTCCACAGGCTAAAATTTTAGGGCATGGAAGCATAGGGGGATTTGTCAGTCACTGTGGTTGGGGTTCTACTGTTGAGGGAATAATGTATAGGGTACCAATCATAGCGGTGCCGATGGTGCTCGATCAGCTATTTAATGCCAAGATGGTTGCTGATATAGGTGTGGGCTTGGAAGTGCCAAGAGATGAAATCAATCAAAGGGTTAGAAAAGAGGAACTCGCAAGGGTTATTAAACAAGTGTTGGAGCAAGAAGAAGGGCAGCAAATAAAAAGAAAAGCTAAAGAATTGAGTGAGAGCATAAAGAAGAAAGGAGATGATGAAGAGATCAATGTGGTGGAGAAGCTGCTGCAGCTTGTCAAGGTACCTAGTTAG。

实施例2重组质粒的制备

一)重组质粒pET-28a(+)-CaRa1,2T的制备

将鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T与pEASY-Blunt进行连接，得质粒pEASY-Blunt-CaRa1,2T，具体连接条件为取4μL鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T、0.5μL的pEASY-Blunt线性载体、0.5μL的T4 DNA Ligase混合，25℃反应1h，后得质粒pEASY-Blunt-CaRa1,2T。

将质粒pEASY-Blunt-CaRa1,2T转入大肠杆菌E.coli DH5α后，涂板到带有氨苄抗性Amp+的LB培养基(含20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L的NaCl)的平板上，培养16h进行挑取克隆，CaRa1,2T-F、CaRa1,2T-R引物扩增验证为阳性克隆。

以质粒pEASY-Blunt-CaRa1,2T为模板，用引物BamHI-CaRa1,2T-F和EcorI-CaRa1,2T-R对其进行扩增得扩增片段，再用BamHI和EcoRI分别对扩增片段及pET-28a(+)质粒进行双酶切，按1:3的摩尔比取酶切后的pET-28a(+)质粒与酶切后的扩增片段混合，再加入T4DNA Ligase，按T4 DNA Ligase的使用说明书在16℃下酶连5h，得连接产物。连接产物再按照E.coli DH5α的使用说明书经E.coli DH5α转化，随后在卡纳板上进行卡纳抗性筛选出阳性克隆，得重组质粒pET-28a(+)-CaRa1,2T，使得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到pET-28a(+)质粒上的BamHI和EcoRI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控。

二)重组质粒pPIC9K-CaRa1,2T-T的制备

以质粒pEASY-Blunt-CaRa1,2T为模板，用引物EcorI-CaRa1,2T-F和NotI-CaRa1,2T-R对其进行扩增得扩增片段，再用EcoRI和NotI分别对扩增片段及pPIC9K质粒进行双酶切，按1:3的摩尔比取酶切后的pPIC9K质粒与酶切后的扩增片段混合，再加入T4 DNALigase，按T4 DNA Ligase的使用说明书在16℃下酶连5h，得连接产物。连接产物再按照E.coli DH5α的使用说明书经E.coli DH5α转化，随后在卡纳板上进行卡纳抗性筛选出阳性克隆，得重组质粒pPIC9K-CaRa1,2T-T，使得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到pPIC9K质粒上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控。

三)重组质粒pYES3-CT-CaRa1,2T的制备

以质粒pEASY-Blunt-CaRa1,2T为模板，用引物BamHI-CaRa1,2T-F和EcoRI-CaRa1,2T-R对其进行扩增得扩增片段，再用BamHI和EcoRI分别对扩增片段及pYES3质粒进行双酶切，按1:3的摩尔比取酶切后的pYES3质粒与酶切后的扩增片段混合，再加入T4 DNALigase，按T4 DNA Ligase的使用说明书在16℃下酶连5h，得连接产物。连接产物再按照E.coli DH5α的使用说明书经E.coli DH5α转化，随后在卡纳板上进行卡纳抗性筛选出阳性克隆，得重组质粒pYES3-CT-CaRa1,2T，使得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到pYES3质粒上的BamHI和EcoRI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于Gal1启动子的下游并受其调控。

四)重组质粒PAX1-CaRa1,2T的制备

以质粒pEASY-Blunt-CaRa1,2T为模板，用引物NotI-CaRa1,2T-F和SamI-CaRa1,2T-R对其进行扩增得扩增片段，再用NotI和SamI分别对扩增片段及PAX1质粒进行双酶切，按1:3的摩尔比取酶切后的PAX1质粒与酶切后的扩增片段混合，再加入T4 DNA Ligase，按T4 DNA Ligase的使用说明书在16℃下酶连5h，得连接产物。连接产物再按照E.coli DH5α的使用说明书经E.coli DH5α转化，随后在卡纳板上进行卡纳抗性筛选出阳性克隆，得重组质粒PAX1-CaRa1,2T，使得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T插入到pYES3质粒上的NotI和SamI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于σA启动子的下游并受其调控。

实施例3宿主菌表达载体的构建及蛋白纯化

本实施例仅对实施例2中的一个重组质粒进行宿主菌表达载体的构建和蛋白纯化进行详细描述，表达载体及其宿主菌的构建和蛋白纯化不限于本实施例。

一)大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CaRa1,2T)表达载体构建及蛋白纯化

取重组质粒pET-28a(+)-CaRa1,2T导入大肠杆菌宿主菌E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，得鼠李糖转移酶的重组表达菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CaRa1,2T)。PCR鉴定阳性克隆，进一步测序验证得到正确的阳性菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CaRa1,2T)。对阳性菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CaRa1,2T)进行测序验证，结果参见图2可知CaRa1,2T已准确地连接到载体的多克隆位点区域，且序列不存在突变。

将鼠李糖转移酶的重组表达菌株大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(pET28a-CaRa1,2T)的菌落经多次活化后，接种于新鲜LB培养基(含20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L的NaCl)中培养。鼠李糖转移酶的重组表达菌株CaRa1,2T-BL21(DE3)培养至OD值为0.6～0.8时，添加0.2mmol/L的IPTG，再在16℃诱导蛋白表达20h，然后在4℃转速为5500rpm离心，收集得到蛋白表达后的细胞，经超声破碎仪对细胞破碎，释放蛋白，高速9000×g离心30min后，利用Ni-NTA His-结合树脂(蛋白纯化树脂)进行纯化，目标蛋白(鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白)的洗脱条件为：利用10mM咪唑(8倍柱体积)活化亲和Ni-NTA His-结合树脂(流速为1mL/min)，移取高速9000×g离心30min后的上清液进行5倍稀释后，所得样品液上样于活化亲和后的Ni-NTA His-结合树脂柱，待样品液全部流过活化亲和后的Ni-NTA His-结合树脂柱后，用12倍柱体积的40mM咪唑冲洗杂蛋白，最后利用5倍柱体积柱的缓冲液(70mM咪唑)洗脱目标蛋白，再利用Millpore(30KDa)浓缩并置换成酶活反应缓冲液，获得鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白，即鼠李糖转移酶CaRa1,2T，对重组蛋白和蛋白Marker进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，实验结果参见图3，可知蛋白大小与计算值一致，为49.9KDa。

本实施例所得的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体氨基酸序列如下：

MESKLQNKKPSILMLPWLAHGHITPYLALAKKLSQQNFHIYFCSTPINLQSMSQNLQEKFSTSIQLIDLQLPCTFPELHDPYNHTTKNIPRHLIPTLIAAFDAAKPAFCNVLETLKPTLVIYDLFQPWAAEAAYQHDIAAVAFVIIAAAGFSFFLQNSSLKFPFPEFDLPESEIQKMTQFKHRIVNGTENRDRFLKAIDLSCKLVLVKTSREIESKYLDYLSYLTKKETIPVGPLVQEPIYTDNNNDTKIMDWLSRKEPSSVVYVSFGSEYFLSKEEMNEIASGLLLSEVSFIWVVRFHSEGNFTIEEALPQGFAEEIQGNNKGMVVQGWAPQAKILGHGSIGGFVSHCGWGSTVEGIMYRVPIIAVPMVLDQLFNAKMVADIGVGLEVPRDEINQRVRKEELARVIKQVLEQEEGQQIKRKAKELSESIKKKGDDEEINVVEKLLQLVKVPS。

二)毕赤酵母Pichia pastoris(PAX1-CaRa1,2T)表达载体构建及蛋白纯化

取重组质粒PAX1-CaRa1,2T导入毕赤酵母Pichia pastoris的感受态细胞中，得鼠李糖转移酶的重组表达菌株毕赤酵母Pichia pastoris(PAX1-CaRa1,2T)。PCR鉴定阳性克隆，进一步测序验证得到正确的阳性菌株毕赤酵母Pichia pastoris(PAX1-CaRa1,2T)。对阳性菌株毕赤酵母Pichia pastoris(PAX1-CaRa1,2T)进行测序验证，可知CaRa1,2T已准确地连接到载体的多克隆位点区域，且序列不存在突变。

三)酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(pYES3-CT-CaRa1,2T)表达载体构建及蛋白纯化

取重组质粒pYES3-CT-CaRa1,2T导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的感受态细胞中，得鼠李糖转移酶的重组表达菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(pYES3-CT-CaRa1,2T)。PCR鉴定阳性克隆，进一步测序验证得到正确的阳性菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(pYES3-CT-CaRa1,2T)。对阳性菌株酿酒酵母Saccharomycescerevisiae(pYES3-CT-CaRa1,2T)进行测序验证，可知CaRa1,2T已准确地连接到载体的多克隆位点区域，且序列不存在突变。

四)枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis(PAX1-CaRa1,2T)表达载体构建及蛋白纯化

取重组质粒PAX1-CaRa1,2T导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis的感受态细胞中，得鼠李糖转移酶的重组表达菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis(PAX1-CaRa1,2T)。PCR鉴定阳性克隆，进一步测序验证得到正确的阳性菌株枯草芽孢杆菌Bacillussubtillis(PAX1-CaRa1,2T)。对阳性菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis(PAX1-CaRa1,2T)进行测序验证，可知CaRa1,2T已准确地连接到载体的多克隆位点区域，且序列不存在突变。

实施例4鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白的应用

一)新橙皮苷的制备

在500μL的反应体系中：在反应体系中加入tris-HCl(pH＝7.5)试剂、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、UDP-鼠李糖和纯化后的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T重组蛋白，所得反应体系含250μL浓度为80mmol/L的tris-HCl(pH＝7.5)试剂、0.1mM橙皮素-7-O-葡萄糖苷(加入后橙皮素-7-O-葡萄糖苷的浓度为0.1mmol/L)、0.25mM的UDP-鼠李糖、100ng纯化后的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T重组蛋白，所得反应体系于37℃反应30min，再经煮沸5min终止反应，得反应液M，再经12000rpm离心5min、0.22μm的滤膜过滤，得新橙皮苷。

该制备过程的化学反应式如下：

对照反应体系除了不加纯化蛋白之外，其余与上述反应体系一致。37℃反应30min，再经煮沸5min终止反应，得未添加重组白的对照液N。

二)对反应物橙皮素-7-O-葡萄糖苷和产物新橙皮苷的检测

1)取橙皮素-7-O-葡萄糖苷、新橙皮苷标准品，分别配制成0.0125mM、0.025mM、0.05mM、0.125mM、0.25mM、0.50mM浓度梯度的橙皮素-7-O葡萄糖苷标准液和0.0125mM、0.025mM、0.05mM、0.125mM、0.25mM、0.50mM浓度梯度的新橙皮苷标准液。

3)分别对不同浓度梯度橙皮素-7-O葡萄糖苷标准液及新橙皮苷标准液、未添加重组蛋白的对照液N和反应液M依次进样高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测。

高效液相色谱仪的型号为Agilent Eclipse XDB-C18 column(5μm4.6mm×250mm)，检测条件为：

流动相：A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；

等梯度洗脱：0-8min时，使用75％的A相和25％的B相；

8-10min时，使用69％的A相和31％的B相；

10min时，使用40％的A相和60％的B相；

15-20min时，使用75％的A相和25％的B相进行平衡；

流速均为1mL/min；

DAD检测波长为284nm。

检测结果如下，图4和图5分别为底物橙皮素-7-O-葡萄糖苷以及产物新橙皮苷的标准曲线。图6中I为橙皮素-7-O-葡萄糖苷标准液的高效液相色谱图中的保留时间(16.9min)、Ⅱ为新橙皮苷标准液的高效液相色谱图中的保留时间(16.1min)、Ⅲ为未添加重组蛋白的对照液N的高效液相色谱图中的保留时间(16.9min)、Ⅳ为反应液M的高效液相色谱图中的保留时间(16.1min)，由图6可知新橙皮苷标准液在16.1min左右出峰，橙皮素-7-O葡萄糖苷标准液在16.9min左右出峰，未添加重组蛋白的对照液N在16.9min左右未出现新城皮苷峰，反应液M在16.1min有新橙皮苷峰且峰值较高。因此，可以证明纯化后的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T重组蛋白能够很好的将橙皮素-7-O-葡萄糖苷转化为新橙皮苷。根据回归标线计算，对照液N中橙皮素-7-O-葡萄糖苷为0.1mM，反应液M中橙皮素-7-O-葡萄糖苷为0.01mM，新橙皮苷浓度为0.045Mm，按照下述转化率公式计算底物浓度消耗百分比计算得出CaRa1,2转化率为90％。

三)进一步检测鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白的催化活性

在500μL的反应体系中：在反应体系1～5中分别加入tris-HCl(pH＝7.5)试剂、不同量的橙皮素-7-O-葡萄糖苷、UDP-鼠李糖和纯化后的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T重组蛋白，所得反应体系1～5分别含250μL浓度为80mmol/L的tris-HCl(pH＝7.5)试剂、0.25mM的UDP-鼠李糖、100ng纯化后的鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T重组蛋白以及橙皮素-7-O-葡萄糖苷，其中反应体系1～5依次含有浓度为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM的橙皮素-7-O葡萄糖苷(加入后橙皮素-7-O-葡萄糖苷的浓度)。反应体系1～5分别于37℃反应20min，经高效液相色谱测定产物新橙皮苷的含量，算出不同浓度的底物(橙皮素-7-O-葡萄糖苷)对应的反应速度V(mmol/min)，以底物的浓度为横坐标，不同浓度底物的反应速度为纵坐标，进行作图，采用双倒数法计算鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白的Km等酶活数据，其中鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白对于底物的Km值为47.98±3.18μM，Kcat值为20.54±2.6min^-1，具体见下表：

表2鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白的酶活性参数

实施例5～9鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白应用的放大实验

实施例5～9分别为一种鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T的重组蛋白的应用，它们的步骤与实施例4步骤一)基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表2：

表2实施例5～9中各项工艺参数一览表

实施例5～9其它部分的内容与实施例4相同。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 一种鼠李糖转移酶基因、制备方法及其表达和应用

<130> 202007

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> Rhamnosyl transferase

<400> 1

atggaaagca aactccaaaa caagaagcca agtattctga tgttaccatg gctagctcat 60

ggccacataa ctccatatct tgcgcttgcc aagaagctct cgcaacaaaa ctttcacata 120

tatttctgct ctactcccat caatctacaa tccatgagcc aaaatcttca agaaaaattt 180

tcaacttcaa tacagcttat agacctccaa cttccttgta cgtttcctga acttcatgat 240

ccatataatc acaccaccaa aaacattccc cgccatctga tccccactct catagcagca 300

tttgatgccg caaaacctgc attttgcaat gttctggaga cccttaaacc aaccctagta 360

atatatgatc tattccagcc atgggccgct gaggcagctt atcagcatga cattgctgct 420

gttgcgttcg taatcattgc tgcagcaggc ttttcttttt ttcttcagaa ttccagcttg 480

aaattccctt tcccagaatt tgatctgcct gagtcagaaa tccagaaaat gacccagttc 540

aagcatcgta ttgtgaacgg caccgaaaat agggacaggt tcttaaaagc tattgatctg 600

tcttgcaaac tagtcttggt aaaaacctca agagagatcg aatccaagta tttggattac 660

ttgtcgtatc taacaaaaaa agaaactatc ccggttgggc ctctagttca agaacctata 720

tacacagaca ataataatga tacaaagatc atggactggc tgagcagaaa ggagccttct 780

tcagttgtgt acgtatcatt tggcagtgag tactttcttt ccaaggaaga aatgaatgag 840

atagctagtg ggttattgct cagcgaggtt agttttatat gggttgtgag atttcattct 900

gaaggaaact ttactatcga ggaggcactg cctcaaggct ttgctgagga gattcaaggg 960

aataataagg ggatggtagt gcaaggttgg gctccacagg ctaaaatttt agggcatgga 1020

agcatagggg gatttgtcag tcactgtggt tggggttcta ctgttgaggg aataatgtat 1080

agggtaccaa tcatagcggt gccgatggtg ctcgatcagc tatttaatgc caagatggtt 1140

gctgatatag gtgtgggctt ggaagtgcca agagatgaaa tcaatcaaag ggttagaaaa 1200

gaggaactcg caagggttat taaacaagtg ttggagcaag aagaagggca gcaaataaaa 1260

agaaaagcta aagaattgag tgagagcata aagaagaaag gagatgatga agagatcaat 1320

gtggtggaga agctgctgca gcttgtcaag gtacctagtt ag 1362

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> Rhamnosyl transferase

<400> 2

Met Glu Ser Lys Leu Gln Asn Lys Lys Pro Ser Ile Leu Met Leu Pro

1 5 10 15

Trp Leu Ala His Gly His Ile Thr Pro Tyr Leu Ala Leu Ala Lys Lys

20 25 30

Leu Ser Gln Gln Asn Phe His Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Ile Asn

35 40 45

Leu Gln Ser Met Ser Gln Asn Leu Gln Glu Lys Phe Ser Thr Ser Ile

50 55 60

Gln Leu Ile Asp Leu Gln Leu Pro Cys Thr Phe Pro Glu Leu His Asp

65 70 75 80

Pro Tyr Asn His Thr Thr Lys Asn Ile Pro Arg His Leu Ile Pro Thr

85 90 95

Leu Ile Ala Ala Phe Asp Ala Ala Lys Pro Ala Phe Cys Asn Val Leu

100 105 110

Glu Thr Leu Lys Pro Thr Leu Val Ile Tyr Asp Leu Phe Gln Pro Trp

115 120 125

Ala Ala Glu Ala Ala Tyr Gln His Asp Ile Ala Ala Val Ala Phe Val

130 135 140

Ile Ile Ala Ala Ala Gly Phe Ser Phe Phe Leu Gln Asn Ser Ser Leu

145 150 155 160

Lys Phe Pro Phe Pro Glu Phe Asp Leu Pro Glu Ser Glu Ile Gln Lys

165 170 175

Met Thr Gln Phe Lys His Arg Ile Val Asn Gly Thr Glu Asn Arg Asp

180 185 190

Arg Phe Leu Lys Ala Ile Asp Leu Ser Cys Lys Leu Val Leu Val Lys

195 200 205

Thr Ser Arg Glu Ile Glu Ser Lys Tyr Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Leu

210 215 220

Thr Lys Lys Glu Thr Ile Pro Val Gly Pro Leu Val Gln Glu Pro Ile

225 230 235 240

Tyr Thr Asp Asn Asn Asn Asp Thr Lys Ile Met Asp Trp Leu Ser Arg

245 250 255

Lys Glu Pro Ser Ser Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Phe

260 265 270

Leu Ser Lys Glu Glu Met Asn Glu Ile Ala Ser Gly Leu Leu Leu Ser

275 280 285

Glu Val Ser Phe Ile Trp Val Val Arg Phe His Ser Glu Gly Asn Phe

290 295 300

Thr Ile Glu Glu Ala Leu Pro Gln Gly Phe Ala Glu Glu Ile Gln Gly

305 310 315 320

Asn Asn Lys Gly Met Val Val Gln Gly Trp Ala Pro Gln Ala Lys Ile

325 330 335

Leu Gly His Gly Ser Ile Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp Gly

340 345 350

Ser Thr Val Glu Gly Ile Met Tyr Arg Val Pro Ile Ile Ala Val Pro

355 360 365

Met Val Leu Asp Gln Leu Phe Asn Ala Lys Met Val Ala Asp Ile Gly

370 375 380

Val Gly Leu Glu Val Pro Arg Asp Glu Ile Asn Gln Arg Val Arg Lys

385 390 395 400

Glu Glu Leu Ala Arg Val Ile Lys Gln Val Leu Glu Gln Glu Glu Gly

405 410 415

Gln Gln Ile Lys Arg Lys Ala Lys Glu Leu Ser Glu Ser Ile Lys Lys

420 425 430

Lys Gly Asp Asp Glu Glu Ile Asn Val Val Glu Lys Leu Leu Gln Leu

435 440 445

Val Lys Val Pro Ser

450

Claims

1.一种鼠李糖转移酶基因，其特征在于，所述鼠李糖转移酶基因为鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T ，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的鼠李糖转移酶基因的一种制备方法，其特征在于，该制备方法是取酸橙提取RNA，经反转录得其cDNA，再以该cDNA为模板，利用KOD高保真酶进行克隆，然后以CaRa1,2T-F和CaRa1,2T-R为扩增引物进行扩增，制得所述鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T。

3.权利要求1所述的鼠李糖转移酶基因的一种制备方法，其特征在于，该制备方法是利用基因序列合成，按照权利要求1公开的序列进行基因化学全合成，制得所述鼠李糖转移酶基因CaRa1,2T。

4.包含权利要求1所述的鼠李糖转移酶基因的重组载体。

5.包含权利要求1所述的鼠李糖转移酶基因的重组表达菌株。

6.根据权利要求1所述的鼠李糖转移酶基因表达的重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7.权利要求6所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是取包含鼠李糖转移酶基因的重组表达菌株进行培养，诱导蛋白表达后，然后经纯化处理制得。

8.权利要求6或7所述的重组蛋白的一种应用，其特征在于，所述重组蛋白用于制备新橙皮苷。

9.根据权利要求8所述的重组蛋白的应用，其特征在于，该应用是以橙皮素-7-O-葡萄糖苷和糖基供体UDP-鼠李糖为底物，在所述重组蛋白的催化作用下生成新橙皮苷。