CN112852843A - 黄酮醇3-o-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

黄酮醇3-o-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种黄酮醇3‑O‑半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用。该基因从杨梅果实中分离获得，所述基因为MrUGT78D2，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。本发明首次克隆并验证了杨梅黄酮醇3‑O‑半乳糖苷合成相关的MrUGT78D2基因的功能，通过构建重组质粒，实现MrUGT78D2基因在大肠杆菌中的重组表达，提供转基因工程菌和纯化的重组蛋白。在体外，重组蛋白可以高效地将槲皮素转化成槲皮素3‑O‑半乳糖苷。本发明可用于生物合成大量植物黄酮醇糖苷，应用于提高植物黄酮醇含量和组分改良的基因工程中，并为实现黄酮醇糖苷类物质商品化生产提供代谢工程基础。

Description

黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用，是一种参与杨梅黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成的转移酶MrUGT78D2基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
黄酮醇是类黄酮化合物的一类，通常以糖苷衍生物形式存在于植物液泡中。黄酮醇广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中，对植物生长发育和抵抗逆境等发挥着重要作用，包括调控生长素转运、促进侧根形成、影响花粉发育、抗紫外线等。近些年，植物黄酮醇抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、消炎等医药学活性被大量报道，黄酮醇生物合成与代谢调控研究引发大量关注。
杨梅(Morella rubra)属于我国特色水果，富含黄酮醇化合物，具有良好的医药学活性。杨梅中的黄酮醇主要有杨梅素、槲皮素及其糖苷化合物，包括杨梅素3-O-鼠李糖苷、槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-鼠李糖苷等。其中槲皮素3-O-半乳糖苷具有抗炎、降压、降糖以及对心、脑血管的保护作用等多种生理活性。黄酮醇糖基化主要发生在细胞质中，在糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)的催化下，将活化的糖供体分子转移到受体分子上。糖基化可以改变黄酮醇化合物的亲水性，增加其溶解度和化学稳定性，影响其生物活性，有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运等。
杨梅果实中含有大量黄酮醇糖苷，是决定杨梅生物学活性的重要组成成分，因此鉴别出杨梅黄酮醇糖苷生物合成相关的糖基转移酶，阐明杨梅黄酮醇糖苷生物合成途径具有重要意义。此外，也可用于其他植物基于分子育种、基因工程技术的品种改良工作，应用于代谢工程工业化生产黄酮醇糖苷，对提高食物中的黄酮醇含量，增加食物的保健功能，提高药品产量，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白，所述基因为MrUGT78D2，所述MrUGT78D2基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，编码序列全长为1410个核苷酸，其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，可编码一个含469个氨基酸的蛋白。
本发明提供的一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因，是从杨梅果实中分离获得，为一种尿苷二磷酸半乳糖依赖的黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶。
本发明的另一个目的是提供所述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因及其编码蛋白在合成黄酮醇3-O-半乳糖苷中的应用。将上述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因连接到pET-32a(+)载体的多克隆位点中构建获得重组质粒，命名为pET-32a(+)-MrUGT78D2。在大肠杆菌中表达pET-32a(+)-MrUGT78D2，得到MrUGT78D2重组蛋白，可利用UDP-半乳糖苷作为糖供体将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-半乳糖苷。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了杨梅黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成相关糖基转移酶MrUGT78D2基因的功能，在体外，MrUGT78D2重组蛋白可以高效地将槲皮素转化成槲皮素3-O-半乳糖苷。本发明还提供了含有MrUGT78D2基因的重组质粒和转基因工程菌，为通过代谢工程方法大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷提供靶基因。本发明提供了一种能大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷的途径，进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。
附图说明
图1：杨梅果实发育阶段过程中槲皮素3-O-半乳糖苷含量变化。
图2：杨梅MrUGT78D2蛋白与其他植物UGT系统发育树分析。AtUGT78D1(AAF19756),AtUGT78D2(CAC01718),VvGT1(AAB81683),VvGT5(AB499074),VvGT6(AB499075),FaGT1(AAU09442),Ph3GT(BAA89008),Perilla 3GT(BAA19659),PhF3GalT(AAD55985),CsUGT78A14(ALO19888),CsUGT78A15(KP682361),PpUGT78B(ONI25885),Iris 5GT(BAD06874),Gt5GT7(BAG32255),Perilla 5GT(AB013596),Verbena 5GT(AB013598),Ph5GT(AB027455),Torenia 5GT(AB076698),AtUGT89C1(AAM13132),AtUGT73B1(AEE86330),AtUGT73C6(AEC09298),SbUBGT(BAA83484),LeABRT2(LC131336),LeABRT4(LC131337),Petunia 3RT(CAA50376),Cs16RhaT(ABA18631),GmF3G6Rt(BAN91401),Ip3GGT(BAD95881),AtUGT79B1(AED96443),AtUGT79B6(AED96438).
图3：MrUGT78D2氨基酸序列SEQ:NO.2比对结果；VvGT6(AB499075)，PhF3GalT(AAD55985)，CsUGT78A15(KP682361)。
图4：杨梅MrUGT78D2重组蛋白SEQ:NO.2的SDS-PAGE凝胶电泳分析图。
图5：重组蛋白MrUGT78D2对槲皮素体外酶活性分析HPLC图谱。
图6：黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2催化模式图；以UDP-半乳糖为糖供体，槲皮素为糖受体，经MrUGT78D2催化生成槲皮素3-O-半乳糖苷。
具体实施方式
下面对本发明的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
一、材料
1、杨梅品种：以‘荸荠’杨梅果实为材料，设置三个生物学重复，每个重复4-6个果实，取果实果肉组织，迅速用液氮冻透，放至-80℃冰箱中保存。
2、大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌株：购于上海普洛麦格生物产品有限公司。
3、pET-32a(+)载体：购于长沙优宝生物科技有限公司。
4、槲皮素3-O-半乳糖苷标准品：购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。使用时用甲醇溶液溶解。
5、UDP-半乳糖溶液：购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。配置10mg/mL的UDP-半乳糖溶液。称取10mg UDP-半乳糖，融于超纯水，定容至1mL，-20℃保存。
6、氨苄青霉素母液(Amp+，500mM)：称取9.3mg氨苄青霉素钠Amp，溶于50mL灭菌超纯水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。
7、500mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)：称取5.95g IPTG，溶于灭菌超纯水，定容至50mL，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。
8、蛋白纯化试剂盒：Clontech HisTALON试剂盒购于Takara宝生物工程有限公司。
9、Tris-HCl缓冲液：购于上海生工生物工程有限公司，pH7.5，浓度为1M，使用时稀释1/10至0.1M。
二、杨梅槲皮素3-O-半乳糖苷含量的检测
1、杨梅果实黄酮醇糖苷提取：所有样品用样品研磨仪磨成粉末，称取0.1g样品粉末加入1mL 50％甲醇水溶液中，超声30min，然后11000rpm离心15min，吸取上清液至新管中，用0.22μm滤膜过滤除去杂质，用于HPLC检测。
2、HPLC检测黄酮醇糖苷含量：检测体系为：流动相：A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈：水(0.1％甲酸)＝1：1；进样体积：10μl；流速：1mL/min；HPLC程序如下：0-45min，23％-50％B；45-50min，50％-100％B；50-55min，100％B；55-56min，100％-23％B；56-60min，23％B。
3、结果显示(图1)，随着杨梅果实发育，槲皮素3-O-半乳糖苷含量逐渐积累，在S4成熟阶段达到40.82±11.77μg/g FW。
三、杨梅RNA提取与MrUGT78D2基因的克隆
1、利用CTAB法提取杨梅果肉的RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit withgDNA Eraser(Takara)试剂说明书操作合成cDNA。以反转录产物cDNA为模板，用SEQ:NO.3和SEQ:NO.4所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta Max Buffer25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNA polymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA1μL，H2O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min40s，72℃5min，4℃hold。得到扩增产物。
2、将PCR扩增产物连接到T-easy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性菌落进行测序。
四、MrUGT78D2基因序列及编码蛋白分析
1、测序结果返还之后经过比对分析得到与转录组数据库相匹配的MrUGT78D2基因序列SEQ:NO.1，如SEQ：NO.1所示含有1410个核苷酸，编码467个氨基酸的蛋白质，如SEQ:NO.2所示。将SEQ:NO.2与已报道其他植物UGT进行系统发育树分析，得到图2所示结果。图中红色圆点标注的即为MrUGT78D2，MrUGT78D2聚类到3GT分支，预示着其具有在3-OH位置催化生成3-O糖苷化合物功能。
2、利用MrUGT78D2氨基酸序列与部分已发表具有黄酮醇3-OH半乳糖基转移功能的糖基转移酶比对，结果如图3所示。他们共同含有UDP糖基转移酶保守序列PSPG-box。
五、MrUGT78D2基因的原核表达
1、设计带有表达载体pET-32a(+)载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示。
2、以测序正确T载体为模板，用SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNApolymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA1μL，H2O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。
3、将PCR扩增产物连接到用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切过的线性pET-32a(+)载体，获得pET-32a(+)-MrUGT78D2重组质粒。
4、将pET-32a(+)-MrUGT78D2重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌中，经菌落PCR验证，挑取阳性菌落接种到500mL LB(Amp+)液体培养基，37℃培养，直至OD600为0.6～1.0，获得转基因工程菌。
5、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为0.5mM，16℃诱导24h，收集菌体，500mL收集到1管中，加入20mL 1×PBS缓冲液，充分重悬浮菌体，-80℃放置12h以上。将菌体置于30℃水浴锅解冻后，用超声破碎仪破碎5min。在4℃温度下，10000rpm离心30min，收集上清液。用Clontech HisTALON重力纯化试剂盒进一步纯化，获得目的蛋白。利用SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图4所示。
6、图4中可看出，pET-32a(+)-MrUGT78D2重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，经IPTG诱导，上清蛋白经Clontech HisTALON重力纯化试剂盒纯化后得到较纯的重组蛋白，且重组蛋白条带大小与预测的一致，加上重组标签后在69.84kDa左右有明显的重组蛋白条带。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。
六、MrUGT78D2重组蛋白的酶学活性检测分析
1、对于黄酮醇底物的酶活检测，是在100μL，0.1M pH 7.5的Tris-HCl缓冲液包含5mM UDP-半乳糖作为糖基供体，200uM槲皮素作为糖基受体，5μg纯化后的重组蛋白和0.1％的DTT。
2、所有酶反应体系在37℃反应5min后加入等量甲醇停止反应，反应均以空载蛋白作为对照，获得酶反应产物。
3、酶反应产物经产物标准品结合HPLC进行检测鉴定，所述HPLC检测条件如下：Waters 2695-2996DAD检测器，ODS C18柱(4.6×250mm)色谱柱。以含0.1％甲酸水溶液(溶液A)和含0.1％甲酸的100％乙腈(溶液B)为流动相，洗脱梯度为：0-7min，10％-50％B；7-10min，50％B；10-15min，50％-100％B；15-15.1min，100％-10％B；15.1-20min，10％B。检测波长为370nm，柱温为25℃，流速为1mL/min，进样体积为10μL。
4、结果如图5所示，可以看出MrUGT78D2重组蛋白以UDP-半乳糖作为糖基供体，可选择性地催化槲皮素3-OH糖基化，生成槲皮素3-O-半乳糖苷与标准品一致，催化流程如图6所示，说明MrUGT78D2重组蛋白具有黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶活性。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 杨梅(Morella rubra)
<400> 1
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<210> 2
<211> 469
<212> PRT
<213> 杨梅(Morella rubra)
<400> 2
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20 25 30
Lys Leu Ala His Ala Ala Pro Asn Val Arg Phe Ser Phe Phe Ser Thr
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Asn Val Ser Thr Glu Asn Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Ala Val Ala
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Glu Asn Gly Lys Arg Ile Thr Cys Leu Leu Ser Asp Ala Phe Leu Thr
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Ser Ala Gly Asp Val Ala Glu Tyr Phe His Val Ala Trp Val Pro Val
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Trp Val Ser Phe Pro Cys Ser Leu Ser Ala His Ile His Thr Asp Leu
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Ile Arg Lys Arg Cys Ala Ile Asn Gly Thr Lys Val Gly Ala Gly Ser
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Arg Val Ser Asp Leu Pro Glu Glu Val Val Ser Gly Arg Asp Asp Glu
195 200 205
Ser Leu Phe Ser Leu Thr Leu Ser Gln Val Gly Leu Val Leu Pro Arg
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Glu Met Arg Lys Lys Ala His Glu Leu Lys Asp Leu Val His Asn Ala
435 440 445
Ala Ser Pro Asn Gly Ser Ala Thr Arg Asp Leu Ile Asp Leu Val Asp
450 455 460
Leu Ile Ser Thr Ser
465
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 3
atggctggga cggaaagttc tgat 24
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 4
ttaagacgta gatattaagt ccaccagatc 30
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 5
gccatggctg atatcggatc catggctggg acggaaagtt ctgat 45
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 6
gtggtggtgg tggtgctcga gagacgtaga tattaagtcc accagatc 48

Claims (4)

1.一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因，其特征在于，所述基因为MrUGT78D2，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。
2.一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因，其特征在于，所述基因MrUGT78D2编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因在合成黄酮醇3-O-半乳糖苷中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过将构建的重组质粒pET-32a(+)-MrUGT78D2转化到工程菌中表达，得到MrUGT78D2重组蛋白，将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-半乳糖苷。
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