CN115109762A - 一种黄酮醇3-o-半乳糖苷生物合成相关的半乳糖基转移酶及其应用 - Google Patents
一种黄酮醇3-o-半乳糖苷生物合成相关的半乳糖基转移酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种半乳糖基转移酶、表达载体和以及含有该表达载体的转基因细胞系和宿主菌。本发明首次克隆并验证了桃黄酮醇3‑O‑半乳糖苷生物合成相关的PpUGT78A2基因的功能,实现了PpUGT78A2基因的异源活性表达,重组蛋白可以利用黄酮醇和UDP‑半乳糖,高效转化成黄酮醇3‑O‑半乳糖苷。本发明还提供了PpUGT78A2基因及其编码蛋白、含有该PpUGT78A2核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的转基因细胞系和宿主菌在黄酮醇3‑O‑半乳糖苷生物合成中的用途。本发明进一步提供了表达载体及含有表达载体的转基因细胞系或宿主菌在黄酮醇3‑O‑半乳糖苷生物合成和代谢工程中的用途。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及重组蛋白和基因工程,具体涉及一种黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成相关的半乳糖基转移酶及其应用。
背景技术
桃(Prunus persica)原产中国,历史悠远,后随着丝绸之路和航海技术的发展,桃被传播到世界各地。因其独特的风味和丰富的营养价值而深受消费者的喜爱。黄酮醇是桃中重要的次生代谢物,在植物发育和抵御各种环境胁迫(如紫外线照射)中发挥着重要作用,同时有大量研究报道了黄酮醇抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病和消炎等医药学活性。
黄酮醇以糖苷的形式广泛分布于植物根、茎、叶、花、果实和种子中,桃中重要的黄酮醇糖苷包括槲皮素3-O-半乳糖苷和山奈酚3-O-半乳糖苷等,主要存在于桃叶中,桃花和桃果皮也有分布。黄酮醇糖苷是黄酮醇苷元糖基化修饰后的产物,主要由尿苷二磷酸(Uridine diphosphate,UDP)糖基依赖的转移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)催化。糖基转移酶将糖基供体转移到受体分子,主要的糖基供体包括UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖。糖基化是许多次生代谢产物合成反应的最后一步,同时可以改变黄酮醇化合物的亲水性,增加其溶解度和化学稳定性,影响其生物活性,有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运等。
糖基化的广泛分布以及对调节植物生命活动的重要性,使其受到了广泛的关注。随着基因组学的发展,许多植物UGT家族成员得到报道,但得到充分功能验证的成员尚少。目前,多采用化学法合成黄酮醇类化合物,过程繁杂且某些反应条件苛刻,这和现代绿色化学的合成理念是相互冲突的。因此鉴别出桃黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成的糖基转移酶,对解析桃黄酮醇生物合成有重要意义。同时,对将来通过基因工程进行农作物的改良育种和为黄酮醇3-O-半乳糖苷工业化生产提供了技术背景。
发明内容
本发明首次表征了桃PpUGT78A2基因在参与黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成基因中的独特作用。从桃组织中成功克隆PpUGT78A2基因,即PpUGT78A2的cDNA序列(参见SEQ IDNO.1所示序列),通过PCR扩增此DNA片段,然后将次片段连接至T-easy载体上(参见实施例1和实施列2),验证成功后构建表达载体pET-32a(+)在原核细胞中首次表达了PpUGT78A2多肽或蛋白质,即半乳糖基转移酶(参见SEQ ID NO.2所示序列和实施例2)。进一步,本发明所述的PpUGT78A2半乳糖基转移酶是由所述的PpUGT78A2基因经原核细胞内的复制、转录和翻译过程而来。所述的复制指的是细胞以所述PpUGT78A2基因的核苷酸为模板产生多个相同的基因的过程。PpUGT78A2所述的转录是指细胞以所述多个相同的PpUGT78A2基因的核苷酸为模板,根据核苷酸互补配对原则,以核糖核苷酸为原料,合成对应的PpUGT78A2基因mRNA的过程。所述的翻译是指,细胞进一步以所述的PpUGT78A2基因mRNA为模板,以各种氨基酸为原料,合成出PpUGT78A2基因对应得多肽或蛋白质的过程。所述的PpUGT78A2基因的CDS序列如SEQ:NO.1所示,编码序列全长为1362个核苷酸,可编码一个含453个氨基酸的蛋白。其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示,含有一个保守的PSPG-box结构域,在糖基转移酶大家族中属于GT1家族。
本发明提供了一种半乳基转移酶,其特征在于,至少含有下列1)~4)特征之一:
1)所述半乳糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为SEQ:NO.1所示;
2)所述半乳糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ:NO.2所示;
3)与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列;
4)与SEQ ID NO.1编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
优选的,本发明所述半乳糖基转移酶编码基因由桃中分离得到;进一步,所述半乳糖基转移酶编码基因由桃的叶、花、果中得到。只要是编码具有PpUGT78A2黄酮醇3-O-半乳糖基化反应功能蛋白质的核苷酸序列,就应包含在本发明涉及的糖基转移酶基因中。
本发明还提供了一种基因表达载体,其特征在于:所述的载体含有如前所述半乳糖基转移酶的核苷酸序列或氨基酸序列;进一步,所述基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示,该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。具体地,所述的基因表达载体含有如前所述的PpUGT78A2基因的核苷酸序列或含有如前所述的PpUGT78A2基因的氨基酸序列。本发明所述的基因可插入到现有的真核或原核表达载体中,适宜的载体包括细菌质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等。所述的载体是一种环状DNA分子,能够在细胞内自主复制和转录表达,是基因工程中最常用的工具之一。
本发明还提供了一种转基因细胞系或宿主菌,所述的转基因细胞系或宿主菌含有如前所述的半乳糖基转移酶或基因表达载体。具体地,所述的转基因细胞系或宿主菌含有如前所述的具有PpUGT78A2核苷酸序列或PpUGT78A2氨基酸序列的基因表达载体。本发明所述的含有PpUGT78A2基因的载体可以用来转化到适当细胞系或宿主菌,所述的细胞系可以来自动物或植物细胞,例如昆虫细胞、哺乳动物细胞,所述的宿主菌可以是经过修饰的基因工程菌,例如酵母菌、大肠杆菌等。
本发明还提供了如前所述的半乳糖基转移酶、基因表达载体、转基因细胞系或宿主菌在黄酮醇3-O-半乳糖苷制备中的应用;进一步,所述的应用包括生产基因工程产品、培育植物新品种、制备食品等。所述的基因工程产品包括利用基因工程技术获取的药品、食品、化妆品、保养保健品等。
本发明还提供了一种黄酮醇3-O-半乳糖苷制备的方法,所述的制备方法选自以下方法的任何一种:1)向如前所述的半乳糖基转移酶直接提供底物黄酮醇和UDP-半乳糖;2)通向细胞系或宿主菌中导入如前所述的含有半乳糖基转移酶核苷酸序列的基因表达载体,诱导转基因细胞系或宿主菌表达重组蛋白;向重组蛋白提供底物黄酮醇和UDP-半乳糖,从而合成黄酮醇3-O-半乳糖苷;3)向细胞系或宿主菌中导入如前所述的含有半乳糖基转移酶核苷酸序列的基因表达载体,并向宿主菌提供原料黄酮醇和UDP-半乳糖,从而合成黄酮醇3-O-半乳糖苷。
进一步的,本发明提供了一种槲皮素3-O-半乳糖苷的制备方法,所述的方法是向宿主菌中导入所述的含有PpUGT78A2核苷酸序列的基因表达载体,获得PpUGT78A2体外重组蛋白并提供原料槲皮素和UDP-半乳糖,从而合成槲皮素3-O-半乳糖苷。如图4和实施例3所示,以大肠杆菌宿主菌为例,向PpUGT78A2体外重组蛋白提供原料槲皮素和UDP-半乳糖,则生成了槲皮素3-O-半乳糖苷。
进一步的,本发明提供了一种山奈酚3-O-半乳糖苷的制备方法,所述的方法是向宿主菌中导入所述的含有PpUGT78A2核苷酸序列的基因表达载体,获得PpUGT78A2体外重组蛋白并提供原料山奈酚和UDP-半乳糖,从而合成山奈酚3-O-半乳糖苷。如图4和实施例3所示,以大肠杆菌宿主菌为例,向PpUGT78A2体外重组蛋白提供原料山奈酚和UDP-半乳糖,则生成了山奈酚3-O-半乳糖苷。
以大肠杆菌宿主菌为例,诱导其翻译表达PpUGT78A2蛋白,然后提供原料黄酮醇和UDP-半乳糖,从而合成黄酮醇3-O-半乳糖苷。如图4和实施例3所示,以大肠杆菌宿主菌为例,提供原料槲皮素和UDP-半乳糖,则生成了槲皮素3-O-半乳糖苷;提供原料山奈酚和UDP-半乳糖,则生成了山奈酚3-O-半乳糖苷。
本发明对研究更多物种具有独特催化活力和特性的半乳糖基转移酶具有指导性意义,为开发工程微生物菌或基于基因工程技术的植物黄酮醇3-O-半乳糖苷组分改良奠定基础。
附图说明
图1是PpUGT78A2氨基酸序列SEQ:NO.2与其他植物中半乳糖基转移酶氨基酸序列比对结果。VvGT5(AB499074),VvGT6(AB499075),CsUGT78A14(KP682360),AtUGT78D1(At1g30530),AtUGT78D2(At5g17050),AtUGT78D3(At5g17030),MdUGT75B1(XP_008380456),PhF3GalTase(AAD55985),PhF3GalTase(BBE29003)。
图2是桃PpUGT78A2重组蛋白的SDS-PAGE分析图。
图3是重组蛋白PpUGT78A2对槲皮素、山奈酚体外酶活性分析HPLC图谱,Q:槲皮素;Q3Gal:槲皮素3-O-半乳糖苷;K:山奈酚;K3Gal:山奈酚3-O-半乳糖苷;UDP-Glc:UDP-葡萄糖;UDP-Gal:UDP-半乳糖;UDP-Rha:UDP-鼠李糖。
图4是重组蛋白PpUGT78A2体外酶活性产物LC-MS图谱。-ESI EIC(负离子模式产物分子量),槲皮素3-O-半乳糖苷负离子模式分子量:463;山奈酚3-O-半乳糖苷负离子模式分子量:447。
具体实施方式
下面对本发明的实施例和附图作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:桃RNA提取及PpUGT78A2基因克隆
一、实验方法
1、材料:以‘湖景蜜露’桃果实为材料,设置四个生物学重复,每个重复6个果实,取果皮组织,迅速用液氮冻透,放至-80℃冰箱中保存。
2、利用CTAB法提取桃果肉的RNA,按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Takara Bio Inc.)试剂说明书操作合成cDNA。以反转录产物cDNA为模板,用SEQ:NO.3和SEQ:NO.4所示引物进行PCR扩增,PCR反应体系为50μL,成分分别为:2×Phanta MaxBuffer 25μL,dNTP Mix(10mM each)1μL,DNA polymerse(1U/μL)1μL,上下游引物(10μM)各2μL,cDNA 1μL,H2O 18μL。PCR程序为:95℃预变性3min,35个循环的95℃15s,58℃15s和72℃1min 40s,72℃5min,4℃hold。得到扩增产物。
3、将PCR扩增产物连接到T-easy载体,转化大肠杆菌DH5α,挑取单菌落进行菌落PCR验证,获得阳性菌落进行测序。
二、实验结果
1、测序结果返还之后经过比对分析得到与基因组数据库相匹配的PpUGT78A2基因序列SEQ:NO.1,含有1362个核苷酸,编码453个氨基酸的蛋白质,如SEQ:NO.2所示。利用PpUGT78A2氨基酸序列与已报道糖基转移酶比对,结果如图1所示。他们共同含有UGT保守序列PSPG-box。
实施例2:PpUGT78A2基因的原核表达
一、实验方法
1、设计带有表达载体pET-32a(+)载体的多克隆酶切位点的特异引物,其引物序列如SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示。
2、以测序正确T-easy载体为模板,用SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示引物进行PCR扩增,PCR反应体系为50μL,成分分别为:2×Phanta Max Buffer 25μL,dNTP Mix(10mM each)1μL,DNA polymerse(1U/μL)1μL,上下游引物(10μM)各2μL,cDNA 1μL,H2O 18μL。PCR程序为:95℃预变性3min,35个循环的95℃15s,58℃15s和72℃1min 40s,72℃5min,4℃hold。
3、将PCR扩增产物连接到用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切过的线性pET-32a(+)载体,获得pET-32a(+)-PpUGT78A2重组质粒。
4、将pET-32a(+)-PpUGT78A2重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌中,经菌落PCR验证,挑取阳性菌落接种到500mL LB(Amp+)液体培养基,37℃培养,直至OD600为0.6~1.0,获得转基因工程菌。
5、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为1mM,16℃诱导24h,收集菌体,500mL收集到1管中,加入20mL 1×PBS缓冲液,充分重悬浮菌体,-80℃放置12h以上。将菌体置于30℃水浴锅解冻后,用超声破碎仪破碎5min。在4℃温度下,10000rpm离心30min,收集上清液。用Clontech HisTALON重力纯化试剂盒进一步纯化,获得目的蛋白。
二、实验结果
利用SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果,结果如图2所示。图中可看出,加上重组标签后在67.86kDa左右有明显的重组蛋白条带,重组蛋白条带大小与预测的一致。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。
实施例3:PpUGT78A2重组蛋白的酶学活性检测分析
一、实验方法
1、对于黄酮醇底物的酶活性检测,是在总体积100μl,0.1M pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中进行,缓冲液包含10μl 10mg/ml UDP-半乳糖作为糖基供体,10μl 1mg/ml槲皮素或山奈酚为糖基受体,5μg纯化后的重组蛋白和0.1%的DTT。
2、酶反应体系在37℃反应10min后加入等量甲醇停止反应,反应均以空载蛋白作为对照,获得酶反应产物。
3、酶反应产物经HPLC进行检测鉴定,所述HPLC检测条件如下:Waters 2695-2996DAD检测器,ODS C18柱(4.6×250mm)色谱柱。以含0.1%甲酸水溶液(溶液A)和含0.1%甲酸的100%乙腈(溶液B)为流动相,洗脱梯度为:0-7min,10%-50%B;7-10min,50%B;10-15min,50%-100%B;15-15.1min,100%-10%B;15.1-20min,10%B。检测波长为370nm,柱温为25℃,流速为1ml/min,进样体积为10μl。
二、实验结果
结果如图3和图4所示,PpUGT78A2重组蛋白以UDP-半乳糖作为糖基供体,可催化槲皮素和山奈酚糖基化,生成与标准品一致的槲皮素3-O-半乳糖苷和山奈酚3-O-半乳糖苷,说明PpUGT78A2重组蛋白具有催化黄酮醇生成黄酮醇3-O-半乳糖苷的功能。
Claims (9)
1.一种半乳糖基转移酶,其特征在于,至少含有下列1)~4)特征之一:
1)所述半乳糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为SEQ:NO.1所示;
2)所述半乳糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ:NO.2所示;
3)与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列;
4)与SEQ ID NO.1编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的半乳糖基转移酶,其特征在于,所述半乳糖基转移酶编码基因由桃中分离得到;进一步,所述半乳糖基转移酶编码基因由桃的叶、花、果中得到。
3.一种基因表达载体,其特征在于:所述的载体含有编码权利要求1或2所述半乳糖基转移酶的核苷酸序列或氨基酸序列;进一步,所述基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示,该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。
4.一种转基因细胞系或宿主菌,其特征在于:所述的转基因细胞系或宿主菌含有权利要求1或2所述的半乳糖基转移酶或权利要求3所述的基因表达载体。
5.权利要求1或2所述的半乳糖基转移酶、权利要求3所述的基因表达载体、权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌在黄酮醇3-O-半乳糖苷制备中的应用;进一步,所述的用途选自制备基因工程产品、培育植物新品种、制备食品。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于:所述的黄酮醇3-O-半乳糖苷选自槲皮素3-O-半乳糖苷或山奈酚3-O-半乳糖苷的任意一种或多种。
7.一种黄酮醇3-O-半乳糖苷的制备方法,其特征在于,所述的制备方法选自以下的任意一种:
1)向权利要求1或2所述的半乳糖基转移酶直接提供底物黄酮醇和UDP-半乳糖。
2)向转基因细胞系或宿主菌中导入权利要求3所述的基因表达载体;向转基因细胞系或宿主菌提供黄酮醇和UDP-半乳糖。
3)通过权利要求3所述的基因表达载体或权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌获得重组蛋白;向重组蛋白提供底物黄酮醇和UDP-半乳糖。
8.一种槲皮素3-O-半乳糖苷的制备方法,其特征在于,所述的制备方法选自以下的任意一种:
1)向权利要求1或2所述的半乳糖基转移酶直接提供底物槲皮素和UDP-半乳糖。
2)向转基因细胞系或宿主菌中导入权利要求3所述的基因表达载体;向转基因细胞系或宿主菌提供槲皮素和UDP-半乳糖。
3)通过权利要求3所述的基因表达载体或权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌获得重组蛋白;向重组蛋白提供底物槲皮素和UDP-半乳糖。
9.一种山奈酚3-O-半乳糖苷的制备方法,其特征在于,所述的制备方法选自以下的任意一种:
1)向权利要求1或2所述的半乳糖基转移酶直接提供底物山奈酚和UDP-半乳糖。
2)向转基因细胞系或宿主菌中导入权利要求3所述的基因表达载体;向转基因细胞系或宿主菌提供山奈酚和UDP-半乳糖。
3)通过权利要求3所述的基因表达载体或权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌获得重组蛋白;向重组蛋白提供底物山奈酚和UDP-半乳糖。
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