CN111500601B

CN111500601B - 杨梅黄酮醇3-o-鼠李糖基转移酶基因及编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN111500601B
Application number: CN202010222996.6A
Authority: CN
Inventors: 李鲜; 任传宏; 赵志康; 解林峰; 邢梦云; 曹运琳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: CN111500601A

Abstract

本发明公开一种黄酮醇3‑O‑鼠李糖基转移酶基因及编码蛋白和应用，该基因从杨梅果实中分离获得，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。本发明首次克隆并验证了杨梅黄酮醇3‑O‑鼠李糖苷合成相关的MrUGT78D1基因的功能。本发明通过构建重组质粒，实现了MrUGT78D1基因在大肠杆菌中的重组表达，提供转基因工程菌。所述的黄酮醇3‑O‑鼠李糖基转移酶基因及其编码蛋白在生物合成黄酮醇3‑O‑鼠李糖苷中的应用。本发明可应用于基于基因工程的植物基因组改造，定向改良植物黄酮醇组分，增加食物的保健功能；也可应用于基于代谢工程的黄酮醇鼠李糖苷工业化生产。

Description

杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶基因及编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种参与杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖苷生物合成的基因，尤其涉及杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

杨梅(Morella rubra)是杨梅科杨梅属亚热带果树，原产中国，记载的人工栽培历史2000多年。杨梅果实风味浓郁，营养丰富，深受人们喜爱。《本草纲目》记载，杨梅有“生津止渴，调五脏，涤肠胃，除烦愦恶气”的功效；现代研究也报道了杨梅抗氧化、抗炎和抗过敏、抗癌、止泻抑菌、抑制黑色素生成和抑制脂肪酶活性等不同生物活性。

杨梅富含黄酮醇化合物，其中杨梅素3-O-鼠李糖苷在杨梅叶片和果实中含量丰富。现代研究证明，杨梅素3-O-鼠李糖苷在降糖、改善心肌收缩、抑制癌细胞增殖等方面发挥重要作用。黄酮醇通常以糖苷形式存在于植物细胞的液泡中，黄酮醇糖基化在细胞质中由糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC2.4.x.y)催化发生。糖基化是植物中广泛存在的化合物修饰方式，也是许多次生代谢产物合成反应的最后一步。糖基化可以改变黄酮醇化合物的亲水性，增加其溶解度和化学稳定性，影响其生物活性，有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运。

杨梅中含有大量杨梅素3-O-鼠李糖苷，是决定杨梅生物学活性的重要组成成分。尿苷二磷酸糖依赖的糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs)是参与杨梅中黄酮醇3-O-鼠李糖苷合成的关键酶，因此鉴别相关基因，阐明杨梅黄酮醇糖苷生物合成途径具有重要意义。可应用于基于基因工程的植物基因组改造，定向改良黄酮醇组分，增加食物的保健功能；也可应用于基于代谢工程的黄酮醇糖苷工业化生产，对提高黄酮醇产量，提高药品生物安全性奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶(MrUGT78D1)基因及其编码蛋白，是一种参与杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖苷生物合成的基因，所述MrUGT78D1基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，编码序列全长为1455个核苷酸，其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，可编码一个含484个氨基酸的蛋白。

本发明提供的一种黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶(MrUGT78D1)基因，是从杨梅果实中分离获得，为一种尿苷二磷酸鼠李糖(UDP-鼠李糖)依赖的黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶。

本发明的另一个目的是提供所述黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶(MrUGT78D1)基因及其编码蛋白在合成黄酮醇3-O-鼠李糖苷中的应用。将上述黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶MrUGT78D1基因连接到pET6xHN载体的多克隆位点中构建重组质粒，命名为pET6xHN-MrUGT78D1。通过在大肠杆菌中表达重组质粒pET6xHN-MrUGT78D1，得到MrUGT78D1重组蛋白，可利用UDP-鼠李糖苷作为糖基供体将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-鼠李糖苷。

本发明提供了一种黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶MrUGT78D1基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖苷生物合成相关糖基转移酶MrUGT78D1基因的功能，在体外，MrUGT78D1重组蛋白可将杨梅素和槲皮素分别转化成杨梅素3-O-鼠李糖苷和槲皮素3-O-鼠李糖苷。本发明还提供了含有MrUGT78D1基因的重组质粒和转基因工程菌，可通过代谢工程方法大量合成黄酮醇3-O-鼠李糖苷。本发明提供了一种能大量合成黄酮醇3-O-鼠李糖苷的途径，为进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。

附图说明

图1：杨梅MrUGT78D1蛋白与其他植物UGT系统发育树分析。AtUGT78D1(AAF19756),AtUGT78D2(CAC01718),CcUGT77B2(MG938542),VvGT1(AAB81683),VvGT5(AB499074),VvGT6(AB499075),FaGT1(AAU09442),Ph3GT(BAA89008),Bronze1(AAK73112),PhF3GalT(AAD55985),CsUGT78A14(ALO19888),CsUGT78A15(KP682361),PpUGT78B(ONI25885),Cp3GT(ACS15351),Iris 5GT(BAD06874),Gt5GT7(BAG32255),Perilla 5GT(AB013596),Verbena5GT(AB013598),Ph5GT(AB027455),Torenia5GT(AB076698),Va5GT(AHL68667),AtUGT89C1(AAM13132),AtUGT73B2(AAK59668),AtUGT73C6(AEC09298),SbUBGT(BAA83484),FaGT6(DQ289587),FaGT7(DQ289588),LeABRT2(LC131336),LeABRT4(LC131337),Petunia 3RT(CAA50376),Cs16RhaT(ABA18631),Cm12RhaT(AY048882),GmF3G6Rt(BAN91401),Ip3GGT(BAD95881),AtUGT79B2(AEE85357),AtUGT79B3(AEE85358),AtUGT79B6(AED96438).

图2：MrUGT78D1氨基酸序列SEQ:NO.2与其他植物UDP-鼠李糖基转移酶氨基酸比对结果。

图3：杨梅MrUGT78D1重组蛋白的SDS-PAGE分析图。

图4：重组蛋白MrUGT78D1对杨梅素和槲皮素体外酶活性分析HPLC图谱。

图5：黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶MrUGT78D1催化模式图；以UDP-鼠李糖为糖基供体，杨梅素和槲皮素为糖基受体，经MrUGT78D1催化生成杨梅素3-O-鼠李糖苷和槲皮素3-O-鼠李糖苷。

具体实施方式

下面对本发明的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：杨梅RNA提取及MrUGT78D1基因克隆

一、实验方法

1、材料：以‘荸荠’杨梅果实为材料，设置三个生物学重复，每个重复4-6个果实，取果实果肉组织，迅速用液氮冻透，放至-80℃冰箱中保存。

2、利用CTAB法提取杨梅果肉的RNA，按照PrimeScript^TMRT reagent Kit withgDNA Eraser(Takara)试剂说明书操作合成cDNA。以反转录产物cDNA为模板，用SEQ:NO.3和SEQ:NO.4所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta Max Buffer25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNA polymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA 1μL，H2O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。得到扩增产物。

3、将PCR扩增产物连接到T-easy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性菌落进行测序。

二、实验结果

1、测序结果返还之后经过比对分析得到与转录组数据库相匹配的MrUGT78D1基因序列SEQ:NO.1，含有1455个核苷酸，编码484个氨基酸的蛋白质，如SEQ:NO.2所示。将SEQ:NO.2与已报道其他植物UGT进行系统发育树分析，得到图1所示结果。图中红色圆点标注的即为MrUGT78D1。

2、利用MrUGT78D1氨基酸序列与部分已发表具有鼠李糖基转移功能的糖基转移酶比对，结果如图2所示。他们共同含有UDP糖基转移酶保守序列PSPG-box。

实施例2：MrUGT78D1基因的原核表达

一、实验方法

1、设计带有表达载体pET6xHN载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示。

2、以测序正确T-easy载体为模板，用SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNA polymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA 1μL，H₂O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。

3、将PCR扩增产物连接到用限制性内切酶SalI和HindIII双酶切过的线性pET6xHN载体，获得pET6xHN-MrUGT78D1重组质粒。

4、将pET6xHN-MrUGT78D1重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌中，经菌落PCR验证，挑取阳性菌落接种到500mL LB(Amp⁺)液体培养基，37℃培养，直至OD₆₀₀为0.6～1.0，获得转基因工程菌。

5、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为0.5mM，16℃诱导24h，收集菌体，500mL收集到1管中，加入20mL 1×PBS缓冲液，充分重悬浮菌体，-80℃放置12h以上。将菌体置于30℃水浴锅解冻后，用超声破碎仪破碎5min。在4℃温度下，10000rpm离心30min，收集上清液。用Clontech HisTALON重力纯化试剂盒进一步纯化，获得目的蛋白。

二、实验结果

利用SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图3所示。图中可看出，加上重组标签后在55.86kDa左右有明显的重组蛋白条带，重组蛋白条带大小与预测的一致。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。

实施例3：MrUGT78D1重组蛋白的酶学活性检测分析

一、实验方法

1、UDP-鼠李糖溶液：由于本研究进行时UDP-鼠李糖无商业购买途径，因此参照发表文献并作一定修改，通过生物合成方式，实验室自行制备。利用茶叶UDP-鼠李糖合成酶CsRHM催化，反应体系为200μl，含有100mM的Na₂CO₃/NaHCO₃(pH9.5)缓冲液包含2mM UDP-葡萄糖作为反应底物，3mM的NAD辅酶和3mM的NADPH辅酶，20μl纯化后的CsRHM重组蛋白，37℃温度下反应3小时，得到UDP-鼠李糖制备液。

2、对于黄酮醇底物的酶活性检测，是在总体积100μl，0.1M pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中进行，缓冲液包含50μl UDP-鼠李糖制备液作为糖基供体，50μM黄酮醇作为糖基受体，5μg纯化后的重组蛋白和0.1％的DTT。

3、酶反应体系在37℃反应10min后加入等量甲醇停止反应，反应均以空载蛋白作为对照，获得酶反应产物。

4、酶反应产物经HPLC进行检测鉴定，所述HPLC检测条件如下：Waters 2695-2996DAD检测器，ODS C18柱(4.6×250mm)色谱柱。以含0.1％甲酸水溶液(溶液A)和含0.1％甲酸的100％乙腈(溶液B)为流动相，洗脱梯度为：0-7min，10％-50％B；7-10min，50％B；10-15min，50％-100％B；15-15.1min，100％-10％B；15.1-20min，10％B。检测波长为370nm，柱温为25℃，流速为1ml/min，进样体积为10μl。

二、实验结果

结果如图4所示，MrUGT78D1重组蛋白以UDP-鼠李糖作为糖基供体，可选择性地催化杨梅素、槲皮素3-OH糖基化，生成与标准品一致的杨梅素3-O-鼠李糖苷、槲皮素3-O-鼠李糖苷，催化流程如图5所示，说明MrUGT78D1重组蛋白具有黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶活性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶基因及编码蛋白和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 杨梅(Morella rubra)

<400> 1

atggcccaaa gctcgccgga tcaacatgtt gccgttttgg cattcccgtt tggttgccat 60

ccccggcctc tatttaatct ggcttgcagg ttagcatgcg ccgcaccaac agtgaggttt 120

tcgttcttca acactcccaa atccagccgc aagctctttt cgacctcaca ggctgagagc 180

ccgcagaacc tgcaacacta ctatgtggcg gatggggtgc cggagggcca tgtgctcact 240

ccgggcaatc ccctcgagga attggagctg ttccttaagg ctgcacctga gagtttccga 300

aaaggcatgg atatggcggt ggcggagacg gggagaaaga tcagttgctt gttgaccgat 360

gctttcttgg tctttgcctg cgagatggct cgtgacatgc atataaagtg ggttcctttt 420

tgggttcccg caccctacaa cctctccgct cacatatata ttgacctcat ccacgacact 480

tactctaacg cttgtggtgg tggtggtggt gaggatggta ttaattttgg tgaaaattcg 540

atacttcgaa agcccgaatc cctgaaagct ggcataaagc ccattgacaa agccttggat 600

tttgttccag ggctgtccat aatgcgtttt cgggacttat cccaggaaat actcctaggt 660

gactccaatt catcactctt ttcaagcaca ttatacagaa ttggtggagt actgccacaa 720

gccactgctg ttatcatgaa ctcatttcag gaactaaacc ctgcaaccct cacagacgat 780

ctcaagtcaa agtttcaaga tttactgtac gtgggcttcc tcacattaac actgccacct 840

ccacctccac caccatcaca ttcagatgcc acaggctgcc ttccatggtt ggacaacaaa 900

aagccaacat ccgtagctta tattagcttt ggaacggtgg ctgcggtgcc acctcacgag 960

tttgttgctt tagccgaggc gctggaagcg agtcatgttc cttttctttg gtctctcagg 1020

gacaatttca aagaaattct accaactggg tttctgcaga gaacacgaac gcagggaaaa 1080

atagttccat ggacacccca gactcatgtc ttggcacaca gggcagtagg cgtgtatgtg 1140

acccactgtg gatacaactc cgtgtttgag agcattgttg gagaggtgcc gatgatctgt 1200

aggccgatct tgggtgataa tatgatgaac ggacggatgg tagaggacgt ttgggggata 1260

ggcgtagggg ttgagggagg ggtatttaca aagaatggaa tgctcaagag cttggaagta 1320

gttttgggac aagaacaagg aaagaggatg cgcgagaaga tcagagacat caaagatctt 1380

gtagtgaagg cagccggacc aaatgggatt gcttccaaag atttcaaaag tttggtagag 1440

gtgatctcca aataa 1455

<210> 2

<211> 484

<212> PRT

<213> 杨梅(Morella rubra)

<400> 2

Met Ala Gln Ser Ser Pro Asp Gln His Val Ala Val Leu Ala Phe Pro

1 5 10 15

Phe Gly Cys His Pro Arg Pro Leu Phe Asn Leu Ala Cys Arg Leu Ala

20 25 30

Cys Ala Ala Pro Thr Val Arg Phe Ser Phe Phe Asn Thr Pro Lys Ser

35 40 45

Ser Arg Lys Leu Phe Ser Thr Ser Gln Ala Glu Ser Pro Gln Asn Leu

50 55 60

Gln His Tyr Tyr Val Ala Asp Gly Val Pro Glu Gly His Val Leu Thr

65 70 75 80

Pro Gly Asn Pro Leu Glu Glu Leu Glu Leu Phe Leu Lys Ala Ala Pro

85 90 95

Glu Ser Phe Arg Lys Gly Met Asp Met Ala Val Ala Glu Thr Gly Arg

100 105 110

Lys Ile Ser Cys Leu Leu Thr Asp Ala Phe Leu Val Phe Ala Cys Glu

115 120 125

Met Ala Arg Asp Met His Ile Lys Trp Val Pro Phe Trp Val Pro Ala

130 135 140

Pro Tyr Asn Leu Ser Ala His Ile Tyr Ile Asp Leu Ile His Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ser Asn Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Glu Asp Gly Ile Asn Phe

165 170 175

Gly Glu Asn Ser Ile Leu Arg Lys Pro Glu Ser Leu Lys Ala Gly Ile

180 185 190

Lys Pro Ile Asp Lys Ala Leu Asp Phe Val Pro Gly Leu Ser Ile Met

195 200 205

Arg Phe Arg Asp Leu Ser Gln Glu Ile Leu Leu Gly Asp Ser Asn Ser

210 215 220

Ser Leu Phe Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Ile Gly Gly Val Leu Pro Gln

225 230 235 240

Ala Thr Ala Val Ile Met Asn Ser Phe Gln Glu Leu Asn Pro Ala Thr

245 250 255

Leu Thr Asp Asp Leu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Leu Leu Tyr Val Gly

260 265 270

Phe Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser His Ser

275 280 285

Asp Ala Thr Gly Cys Leu Pro Trp Leu Asp Asn Lys Lys Pro Thr Ser

290 295 300

Val Ala Tyr Ile Ser Phe Gly Thr Val Ala Ala Val Pro Pro His Glu

305 310 315 320

Phe Val Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Ser His Val Pro Phe Leu

325 330 335

Trp Ser Leu Arg Asp Asn Phe Lys Glu Ile Leu Pro Thr Gly Phe Leu

340 345 350

Gln Arg Thr Arg Thr Gln Gly Lys Ile Val Pro Trp Thr Pro Gln Thr

355 360 365

His Val Leu Ala His Arg Ala Val Gly Val Tyr Val Thr His Cys Gly

370 375 380

Tyr Asn Ser Val Phe Glu Ser Ile Val Gly Glu Val Pro Met Ile Cys

385 390 395 400

Arg Pro Ile Leu Gly Asp Asn Met Met Asn Gly Arg Met Val Glu Asp

405 410 415

Val Trp Gly Ile Gly Val Gly Val Glu Gly Gly Val Phe Thr Lys Asn

420 425 430

Gly Met Leu Lys Ser Leu Glu Val Val Leu Gly Gln Glu Gln Gly Lys

435 440 445

Arg Met Arg Glu Lys Ile Arg Asp Ile Lys Asp Leu Val Val Lys Ala

450 455 460

Ala Gly Pro Asn Gly Ile Ala Ser Lys Asp Phe Lys Ser Leu Val Glu

465 470 475 480

Val Ile Ser Lys

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

atggcccaaa gctcgccgga 20

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

ttatttggag atcacctcta ccaaac 26

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

taaggcctct gtcgacatgg cccaaagctc gccgga 36

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

cagaattcgc aagcttttat ttggagatca cctctaccaa ac 42

Claims

1.一种黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶基因及其编码蛋白在生物合成黄酮醇3-O-鼠李糖苷中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在大肠杆菌中表达重组质粒pET6xHN-MrUGT78D1，得到杨梅黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶重组蛋白，利用UDP-鼠李糖苷作为糖基供体将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-鼠李糖苷，所述重组质粒是将黄酮醇3-O-鼠李糖基转移酶基因连接到pET6xHN载体中构建获得。