CN115109763B

CN115109763B - 一种黄酮醇3-o-葡萄糖苷生物合成相关的黄酮醇3-o-葡萄糖基转移酶及其应用

Info

Publication number: CN115109763B
Application number: CN202210340159.2A
Authority: CN
Inventors: 李鲜; 曹运琳; 解林峰; 郭妍; 梅宇洋; 张波; 陈昆松
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Shandong Linyi Institute of Modern Agriculture of Zhejiang University
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Shandong Linyi Institute of Modern Agriculture of Zhejiang University
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN115109763A

Abstract

本发明提供了一种黄酮醇3‑O‑葡萄糖基转移酶、表达载体和以及含有该表达载体的转基因细胞系和宿主菌。本发明首次克隆并验证了桃黄酮醇3‑O‑葡萄糖苷生物合成相关的PpUGT78T3基因的功能，实现了PpUGT78T3基因的异源活性表达，重组蛋白可以利用黄酮醇和UDP‑葡萄糖，高效转化成黄酮醇3‑O‑葡萄糖苷。本发明还提供了PpUGT78T3基因及其编码蛋白、含有该PpUGT78T3核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的转基因细胞系和宿主菌在黄酮醇3‑O‑葡萄糖苷生物合成中的用途。本发明进一步提供了表达载体及含有表达载体的转基因细胞系或宿主菌在黄酮醇3‑O‑葡萄糖苷生物合成中的用途。

Description

一种黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成相关的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，一种黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成相关的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶及其应用。

背景技术

类黄酮是植物体内一种重要的次生代谢物，根据化学结构的差异，类黄酮可以被分为6大类：黄酮、黄烷酮、黄烷醇、黄酮醇、花色苷和异黄酮。近年来，大量研究报道了黄酮醇具有抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病和消炎等医药学活性。黄酮醇苷元多达十余种，其中园艺产品中常见的苷元主要是槲皮素、山柰酚和杨梅素等。黄酮醇苷元理化性质不稳定，通常以糖苷衍生物形式存在于植物液泡中。黄酮醇糖基化主要由尿苷二磷酸(Uridinediphosphate，UDP)糖基依赖的转移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)催化，将糖基从活化的供体分子转移到受体分子，主要的糖基供体包括UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖。糖基化是许多次生代谢产物合成反应的最后一步，同时可以改变黄酮醇苷元的亲水性，增加其溶解度和化学稳定性，影响其生物活性，有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运等。因此，开展黄酮醇生物合成UGT的研究，对于进一步解释自然界类黄酮的多样性及其丰富的生物学功能具有重要意义，也对保健品开发或具有医药学活性化合物挖掘的关键性指导。

桃(Prunus persica)是蔷薇科桃属果树，因果实风味浓郁，富含类黄酮等具有生物活性的天然产物而受到人们的喜爱。黄酮醇是桃中重要的类黄酮组分，包括槲皮素、山奈酚及其糖苷如槲皮素3-O-葡萄糖苷和山奈酚3-O-葡萄糖苷等，主要存在于桃果皮和桃花中。由于糖苷化产物的潜在的药用价值以及对植物生命活动调节的重要性，现在已受到人们的广泛关注。糖苷化产物主要依靠黄酮醇糖基化获得，此反应主要由糖基依赖的酶进行催化。截至目前，桃类黄酮醇3-O-葡萄糖苷的生物合成的关键酶仍未被鉴别。然而鉴别出桃黄酮醇糖苷生物合成的关键酶，对于阐明桃黄酮醇糖苷生物合成途径具有重要意义，也可用于其他植物基于基因工程技术的黄酮醇组分改良，对提高食物中的黄酮醇含量，增加食物的保健功能，具有重要的商业化或工业化应用价值。

发明内容

本发明首次表征了桃PpUGT78T3基因在参与黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成基因中的独特作用。从桃组织中成功克隆PpUGT78T3基因，即PpUGT78T3的cDNA序列(参见SEQ IDNO.1所示序列)，通过PCR扩增此DNA片段，然后将次片段连接至T-easy载体上(参见实施例1和实施列2)，验证成功后构建表达载体pET-32a(+)在原核细胞中首次表达了PpUGT78T3多肽或蛋白质，即黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶(参见SEQ ID NO.2所示序列和实施例2)。进一步，本发明所述的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶是由所述的PpUGT78T3基因经原核细胞内的复制、转录和翻译过程而来。所述的复制指的是细胞以所述PpUGT78T3基因的核苷酸为模板产生多个相同的基因的过程。PpUGT78T3所述的转录是指细胞以所述多个相同的PpUGT78T3基因的核苷酸为模板，根据核苷酸互补配对原则，以核糖核苷酸为原料，合成对应的PpUGT78T3基因mRNA的过程。所述的翻译是指，细胞进一步以所述的PpUGT78T3基因mRNA为模板，以各种氨基酸为原料，合成出PpUGT78T3基因对应得多肽或蛋白质的过程。所述的PpUGT78T3基因的CDS序列如SEQ:NO.1所示，编码序列全长为1362个核苷酸，可编码一个含453个氨基酸的蛋白。其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，含有一个保守的PSPG-box结构域，在糖基转移酶大家族中属于GT1家族。

本发明提供了一种黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶，其特征在于，至少含有下列1)～4)特征之一：

1)所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为SEQ:NO.1所示；

2)所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ:NO.2所示；

3)与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与SEQ ID NO.1编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

优选的，本发明所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因由桃中分离得到；进一步，所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因由桃的叶、花、果中得到。只要是编码具有PpUGT78T3黄酮醇3-O-葡萄糖基化反应功能蛋白质的核苷酸序列，就应包含在本发明涉及的糖基转移酶基因中。

本发明还提供了一种基因表达载体，其特征在于：所述的载体含有如前所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列或氨基酸序列；进一步，所述基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。具体地，所述的基因表达载体含有如前所述的PpUGT78T3基因的核苷酸序列或含有如前所述的PpUGT78T3基因的氨基酸序列。本发明所述的基因可插入到现有的真核或原核表达载体中，适宜的载体包括细菌质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等。所述的载体是一种环状DNA分子，能够在细胞内自主复制和转录表达，是基因工程中最常用的工具之一。

本发明还提供了一种转基因细胞系或宿主菌，其特征在于：所述的转基因细胞系或宿主菌含有如前所述的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶或基因表达载体。具体地，所述的转基因细胞系或宿主菌含有如前所述的具有PpUGT78T3核苷酸序列或PpUGT78T3氨基酸序列的基因表达载体。本发明所述的含有PpUGT78T3基因的载体可以用来转化到适当细胞系或宿主菌，所述的细胞系可以来自动物或植物细胞，例如昆虫细胞、哺乳动物细胞，所述的宿主菌可以是经过修饰的基因工程菌，例如酵母菌、大肠杆菌等。

本发明还提供了如前所述的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶、基因表达载体、转基因细胞系或宿主菌在黄酮醇3-O-葡萄糖苷制备中的应用；进一步，所述的应用包括生产基因工程产品、培育植物新品种、制备食品等。所述的基因工程产品包括利用基因工程技术获取的药品、食品、化妆品、保养保健品等。

本发明还提供了一种黄酮醇3-O-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自以下的任意一种：1)向如前所述的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶直接提供底物黄酮醇和UDP-葡萄糖；2)通向细胞系或宿主菌中导入如前所述的含有黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶核苷酸序列的基因表达载体，诱导转基因细胞系或宿主菌表达重组蛋白；向重组蛋白提供底物黄酮醇和UDP-葡萄糖，从而合成黄酮醇3-O-葡萄糖苷；3)向细胞系或宿主菌中导入如前所述的含有黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶核苷酸序列的基因表达载体，并向宿主菌提供原料黄酮醇和UDP-葡萄糖，从而合成黄酮醇3-O-葡萄糖苷。

进一步的，本发明提供了一种槲皮素3-O-葡萄糖苷的制备方法，所述的方法是向宿主菌中导入所述的含有PpUGT78T3核苷酸序列的基因表达载体，获得PpUGT78T3体外重组蛋白并提供原料槲皮素和UDP-葡萄糖，从而合成槲皮素3-O-葡萄糖。如图4和实施例3所示，以大肠杆菌宿主菌为例，向PpUGT78T3体外重组蛋白提供原料槲皮素和UDP-葡萄糖，则生成了槲皮素3-O-葡萄糖苷。

进一步的，本发明提供了一种山奈酚3-O-葡萄糖苷的制备方法，所述的方法是向宿主菌中导入所述的含有PpUGT78T3核苷酸序列的基因表达载体，获得PpUGT78T3体外重组蛋白并提供原料山奈酚和UDP-葡萄糖，从而合成山奈酚3-O-葡萄糖苷。如图4和实施例3所示，以大肠杆菌宿主菌为例，向PpUGT78T3体外重组蛋白提供原料山奈酚和UDP-葡萄糖，则生成了山奈酚3-O-葡萄糖苷。

以大肠杆菌宿主菌为例，诱导其翻译表达PpUGT78T3蛋白，然后提供原料类黄酮醇和UDP-葡萄糖，从而合成黄酮醇3-O-葡萄糖苷。如图4和实施例3所示，以大肠杆菌宿主菌为例，提供原料类槲皮素和UDP-葡萄糖，则生成了槲皮素3-O-葡萄糖苷；提供原料山奈酚UDP-葡萄糖，则生成了山奈酚3-O-葡萄糖苷。

本发明对研究更多物种具有独特催化活力和特性的葡萄糖基转移酶具有指导性意义，为开发工程微生物菌或基于基因工程技术的植物黄酮醇3-O-葡萄糖苷组分改良奠定基础。

附图说明

图1：PpUGT78T3氨基酸序列和其他已报道UGT比对结果。VvGT5(AB499074)，VvGT6(AB499075)，CsUGT78A14(KP682360)，AtUGT78D1(At1g30530)，AtUGT78D2(At5g17050)，AtUGT78D3(At5g17030)，MdUGT75B1(XP_008380456)，PhF3GalTase(AAD55985)，PhF3GalTase(BBE29003)。

图2：纯化所得PpUGT78T3重组蛋白SDS-PAGE凝胶图。

图3：重组蛋白PpUGT78T3对槲皮素、山奈酚体外酶活分析HPLC图谱。

图4：重组蛋白PpUGT78T3对槲皮素、山奈酚体外酶活产物LC-MS图谱。-ESI EIC(负离子模式产物分子量)；槲皮素3-O-葡萄糖苷负离子模式分子量：463；山奈酚3-O-葡萄糖苷负离子模式分子量：447。

图5：黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的催化流程图与化学结构式；以槲皮素为糖受体，UDP-葡萄糖为糖供体，经PpUGT78T3催化生成槲皮素3-O-葡萄糖苷；以山奈酚为糖受体，UDP-葡萄糖为糖供体，经PpUGT78T3催化生成山奈酚3-O-葡萄糖苷。

具体实施方式

下面对本发明的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：桃RNA提取及PpUGT78T3基因克隆

一、实验方法

1、材料：以‘湖景蜜露’桃果实为材料，设置四个生物学重复，每个重复6个果实，取果皮组织，迅速用液氮冻透，放至-80℃冰箱中保存。

2、利用CTAB法提取桃果肉的RNA，按照PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Takara Bio Inc.)试剂说明书操作合成cDNA。以反转录产物cDNA为模板，用SEQ:NO.3和SEQ:NO.4所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta MaxBuffer 25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNA polymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA 1μL，H₂O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。得到扩增产物。

3、将PCR扩增产物连接到T-easy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性菌落进行测序。

二、实验结果

1、测序结果返还之后经过比对分析得到与基因组数据库相匹配的PpUGT78T3基因序列SEQ:NO.1，含有1425个核苷酸，编码474个氨基酸的蛋白质，如SEQ:NO.2所示。

2、利用PpUGT78T3氨基酸序列与已报道UGT的比对，结果如图1所示，他们共同含有UGT保守序列PSPG-box。

实施例2：PpUGT78T3基因的原核表达

一、实验方法

1、设计带有表达载体pET-32a(+)载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示。

2、以测序正确T-easy载体为模板，用SEQ:NO.5和SEQ:NO.6所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，成分分别为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，DNA polymerse(1U/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2μL，cDNA 1μL，H₂O 18μL。PCR程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。

3、将PCR扩增产物连接到用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切过的线性pET-32a(+)载体，获得pET-32a(+)-PpUGT78T3重组质粒。

4、将pET-32a(+)-PpUGT78T3重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达宿主菌中，经菌落PCR验证，挑取阳性菌落接种到500mL LB(Amp⁺)液体培养基，37℃培养，直至OD₆₀₀为0.6～1.0，获得转基因工程菌。

5、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为1mM，16℃诱导24h，收集菌体，500mL收集到1管中，加入20mL 1×PBS缓冲液，充分重悬浮菌体，-80℃放置12h以上。将菌体置于30℃水浴锅解冻后，用超声破碎仪破碎5min。在4℃下，10000rpm离心30min，收集上清液。用Clontech HisTALON重力纯化试剂盒进一步纯化，获得目的蛋白。

二、实验结果

利用SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图2所示。图中可看出，加上重组标签后在70.32kDa左右有明显的重组蛋白条带，重组蛋白条带大小与预测的一致。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。

实施例3：PpUGT78T3重组蛋白的酶学活性检测分析

一、实验方法

1、对于黄酮醇底物的酶活性检测，是在总体积100μL，0.1M pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中进行，缓冲液包含10μL10mg/mLUDP-葡萄糖作为糖基供体，10μL1mg/mL槲皮素、10μL1mg/mL山奈酚作为糖基受体，5μg纯化后的重组蛋白和0.1％的DTT。

2、酶反应体系在37℃反应10min后加入等量甲醇停止反应，反应均以空载蛋白作为对照，获得酶反应产物。

3、酶反应产物经HPLC进行检测鉴定，所述HPLC检测条件如下：Waters 2695-2996DAD检测器，ODS C18柱(4.6×250mm)色谱柱。以含0.1％甲酸水溶液(溶液A)和含0.1％甲酸的100％乙腈(溶液B)为流动相，洗脱梯度为：0-7min，10％-50％B；7-10min，50％B；10-15min，50％-100％B；15-15.1min，100％-10％B；15.1-20min，10％B。检测波长为370nm，柱温为25℃，流速为1mL/min，进样体积为10μL。

二、实验结果

结果如图3和图4所示，PpUGT78T3重组蛋白以UDP-葡萄糖作为糖基供体，可催化槲皮素、山奈酚糖基化，生成与标准品一致的槲皮素3-O-葡萄糖苷、山奈酚3-O-葡萄糖苷，催化流程如图5所示，说明PpUGT78T3重组蛋白具有催化槲皮素生成槲皮素3-O-葡萄糖苷，催化山奈酚生成山奈酚3-O-葡萄糖苷的功能。

<110> 浙江大学山东（临沂）现代农业研究院

<120> 一种黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成相关的葡萄糖基转移酶及其应用

<160> 53

<210> 1

<211> 1425

<212> DNA

<213> Prunus persica

<400> 1

atggcaccac aaccgattga tgatgatcat attgtgtatg agcatcatgt ggcggcccta 60

gccttccctt tctccaccca tgccagtccc accttggccc tcgtccgccg cctagccgct 120

gcctctccca acactctctt ctcattcttc agcacttcac aatccaacaa ctcactcttt 180

tccaacacta ttaccaatct tccacgtaac ataaaggtgt ttgatgtggc tgatggcgtc 240

cccgaaggct atgtgtttgc gggtaagccc caggaggata ttgagctttt catgaaggct 300

gccccccaca actttacaac cagcttagac gcctgcgtgg ctcacaccgg gaagcgcctc 360

acctgcttga ttaccgacgc cttcctttgg tttggggcca acttggcaca cgacttggga 420

gtcccttggc tccctctttg gctctccgga cttaattccc tctccctgca tgtccatact 480

gacctcctcc gccacactat cggaactcaa agtattgcag gtcgtgaaaa cgaactcatc 540

accaagaatg tcaacatccc aggaatgtcc aaagtacgaa tcaaagattt gcctgaaggt 600

gtcatctttg gaaacttgga ctcagtcttc tcgcgcatgc tgcatcaaat gggccaactg 660

ctaccccgtg ccaacgcagt tctcgtaaac agctttgaag aactggatat tgccgtaaca 720

aacgatttga aatccaaatt caacaagctt ctcaatgtcg gacctttcaa cctagctgct 780

gctgcttccc ctccactgcc ggaagcccca acagccgcag acgacgttac tggttgccta 840

tcctggcttg acaaacaaaa ggcggcatcc tccgtggtgt atgttagttt tgggtcagtc 900

gcaaggccac cggagaagga gcttatggcg atggcacaag ccttggaagc cagcggggta 960

cccttcttat ggtctctcaa ggacagtttt aagacacctt tgctaaatga gttgctaata 1020

aaagcaacta atgggatggt ggtgccctgg gctccccagc cacgtgtcct agcccatgct 1080

tcagtcggag ccttcgtaac gcactgcggt tggagctcat tgctggagac tatagcaggc 1140

ggggtgccaa tgatttgcag gcctttcttt ggcgaccaaa gggtcaacgc aagactggtg 1200

gaggacgtgt tggagatcgg ggtcactgtt gaggatgggg tttttaccaa gcacggcatg 1260

atcaaatatt ttgatcaagt tttgtcacaa caaagaggga agaaaatgag agagaacata 1320

aacaccgtca aactactcgc acaacagtcg gttgaaccaa aagggggctc agctcagaat 1380

ttcaaattat tgctagatgt catatctgga tccactaaag tataa 1425

<210> 2

<211> 474

<212> PRT

<213> Prunus persica

<400> 2

MAPQPIDDDH IVYEHHVAAL AFPFSTHASP TLALVRRLAA ASPNTLFSFF STSQSNNSLF 60

SNTITNLPRN IKVFDVADGV PEGYVFAGKP QEDIELFMKA APHNFTTSLD ACVAHTGKRL 120

TCLITDAFLW FGANLAHDLG VPWLPLWLSG LNSLSLHVHT DLLRHTIGTQ SIAGRENELI 180

TKNVNIPGMS KVRIKDLPEG VIFGNLDSVF SRMLHQMGQL LPRANAVLVN SFEELDIAVT 240

NDLKSKFNKL LNVGPFNLAA AASPPLPEAP TAADDVTGCL SWLDKQKAAS SVVYVSFGSV 300

ARPPEKELMA MAQALEASGV PFLWSLKDSF KTPLLNELLI KATNGMVVPW APQPRVLAHA 360

SVGAFVTHCG WSSLLETIAG GVPMICRPFF GDQRVNARLV EDVLEIGVTV EDGVFTKHGM 420

IKYFDQVLSQ QRGKKMRENI NTVKLLAQQS VEPKGGSAQN FKLLLDVISG STKV 474

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

ATGGCACCACAACCGATTGATG

atggcaccac aaccgattga tg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

TTATACTTTAGTGGATCCAGATAT

ttatacttta gtggatccag atat 24

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

gccatggctgatatcggatccatggcaccacaaccgattgatg

gccatggctg atatcggatc catggcacca caaccgattg atg 43

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

gtggtggtggtggtgctcgagtactttagtggatccagatat

gtggtggtgg tggtgctcga gtactttagt ggatccagat at 42

Claims

1.一种黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶在黄酮醇3-O-葡萄糖苷制备中的应用，其中，所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为与SEQ IDNO:1所示序列编码相同的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列；所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的黄酮醇3-O-葡萄糖苷选自槲皮素3-O-葡萄糖苷或者山奈酚3-O-葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶由桃中分离得到。

3.一种基因表达载体在黄酮醇3-O-葡萄糖苷制备中的应用，其特征在于，所述的载体含有编码权利要求1或2所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列。

4.一种转基因细胞系或宿主菌在黄酮醇3-O-葡萄糖苷制备中的应用，其中，所述细胞系或宿主菌含有黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶或包含黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因的表达载体，所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为与SEQ ID NO:1所示序列编码相同的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列；所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的黄酮醇3-O-葡萄糖苷选自槲皮素3-O-葡萄糖苷或者山奈酚3-O-葡萄糖苷。

5.一种槲皮素3-O-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自以下的任意一种：

(1)向黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶直接提供底物槲皮素和UDP-葡萄糖；

(2)向转基因细胞系或宿主菌中导入包含黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因的表达载体；向转基因细胞系或宿主菌提供槲皮素和UDP-葡萄糖；或

(3)通过包含黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因的表达载体或者含有黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的转基因细胞系或宿主菌获得重组黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶；向重组黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶提供底物槲皮素和UDP-葡萄糖；

其中，所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为与SEQ ID NO:1所示序列编码相同的黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列；所述黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.一种山奈酚3-O-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自以下的任意一种：

(1)向黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶直接提供底物山奈酚和UDP-葡萄糖；

(2)向转基因细胞系或宿主菌中导入包含黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因的表达载体；向转基因细胞系或宿主菌提供山奈酚和UDP-葡萄糖；

(3)通过包含黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶编码基因的表达载体或者含有黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶的转基因细胞系或宿主菌获得重组黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶；向重组黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶提供底物山奈酚和UDP-葡萄糖；