CN110343681B - 合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白 - Google Patents
合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白 Download PDFInfo
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
Abstract
本发明公开了一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明通过定点突变技术，发现一个关键氨基酸位点，可以明显提高呋喃酮糖苷的合成能力及改变糖基转移酶对糖的选择性。为呋喃酮及其衍生物糖苷的高效生产，提供了一种生物合成的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白。
背景技术
呋喃酮(4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮,Furaneol,DMHF)，又称菠萝酮或草莓酮，分子量为128.13，是一种白色至浅黄色结晶体或粉末状固体。熔点为78-80℃，微溶于水，易溶于乙醇等有机试剂。
呋喃酮具有强烈的焦糖香气，同时具有浓郁的水果香味，稀释又具有覆盆子香味。自从1965年J.O.Rodin等人在菠萝汁的乙醚萃取液中首次鉴定出呋喃酮以来，先后在菠萝、草莓、番茄、葡萄、茶等天然产物中鉴定了呋喃酮的存在。呋喃酮由于其显著的增香修饰效果和持久的香味，被认为是甜味香料的重要原料和优良的增香剂，同时呋喃酮也是美国食用香料制造者协会(FEMA)和欧洲理事会(COE)共同认可的安全食用香料。呋喃酮被广泛用于食品、饮料以及日化产品中，在面包、饼干、糖果、巧克力、肉制品、奶制品、软饮料、葡萄酒、香烟、口香糖等食用香精的调配中，具有显著的增香、柔和及清新作用；在牙膏和香烟中，具有明显的除辣味、掩盖杂气、改善味道的功效；在日用香制品、化妆品及药物中，呋喃酮可以用来掩盖某些令人不愉快的味道；另外呋喃酮在医学上，还可以用来预防和治疗白内障。
人们先后在草莓和葡萄中发现了呋喃酮葡萄糖苷，并对呋喃酮在草莓和葡萄中的生理代谢进行了解析。从那以后，人们认为呋喃酮在植物中以呋喃酮葡萄糖苷的形式存在。相比游离态香气物质，香气糖苷性质更稳定，水溶性更强，且具有多种重要的生物学功能，在化妆品、食品和药物开发领域具有巨大的商业价值。香气糖苷主要由糖基转移酶(UGT)通过糖基化反应催化合成。此外，糖基化是植物次生代谢最为重要的修饰反应之一，在调节植物细胞代谢平衡、解除外源毒素毒性、维持植物正常生长发育等方面具有重要作用，同时也可以通过代谢工程途径改善植物的香气成分。
目前，香气糖苷的合成主要通过化学和生物两种手段实现。化学合成虽然合成方法多种多样，但总体来看，产率偏低，有的方法甚至需要重金属催化剂。生物合成由于使用酶或工程菌在常温下催化，对环境无危害，且对位点选择性较强，产物单一，安全可靠，近年来，备受人们喜爱。但目前多种香气糖苷的生物合成方法还不成熟，关于呋喃酮糖苷的相关研究更少，目前关于提高呋喃酮糖苷生物合成的方法，并没有研究和报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白，解决呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生物合成效率低的难题。
本发明的技术方案为：
一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
编码SEQ ID No.3所示糖基转移酶突变体的核苷酸，优选地，其碱基序列如SEQ IDNo.4所示。
表达载体，其含有上述所述的核苷酸片段。
基因工程菌，其含上述所述的表达载体。
本发明的糖基转移酶突变体蛋白或所述的核苷酸或所述的表达载体或所述的基因工程菌在呋喃酮及其衍生物糖苷制备上的应用。
糖基转移酶突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)以包含SEQ ID No.1氨基酸序列的质粒为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物进行PCR，得到SEQ ID No.4所示的突变基因；
(2)将步骤(1)得到的突变基因进行原核表达；
(3)分离纯化得到氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的糖基转移酶突变体。
一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的方法，以SEQ ID No.3所示的糖基转移酶突变体蛋白为催化剂，以呋喃酮及其衍生物为底物进行催化反应生成相应的呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷。
进一步地，所述衍生物为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或单甲基呋喃酮。
进一步地，催化反应的温度30℃、pH值8.5。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用定点突变技术，得到一个重要的突变体UGT11(A456V)编码的蛋白，相比于野生型UGT11，可以特异高效的催化呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生成。
附图说明
图1：香气底物的筛选及活性比较；图A底物为DMHF，图B底物为EHMF，图C底物为HMF；
图2：不同pH的酶活数据；
图3：不同温度酶活数据；
图4：为呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的获得流程图。
具体实施方式
1、UGT11(A456V)基因
在茶树基因组中，发现了一条糖基转移酶相关的基因，该基因编码的蛋白可以利用呋喃酮及其衍生物，生成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷，将该基因命名为UGT11，该基因的CDS序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。对其进行定点突变，获得突变体为UGT11(A456V)，该基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2、包含UGT11氨基酸序列质粒的获得：
根据上述UGT11的CDS，通过SnapGene Viewer软件设计引物，以茶树基因组的cDNA为模板，用高保真酶克隆目的基因，之后通过商业化的试剂盒进行胶回收，获得单一的目的基因。
UGT11基因克隆的引物序列：
UGT11-F：GGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGAGACACCAAACAGAGC(SEQ ID No.7)
UGT11-R：GCTCGAGTCGACCCGGGTCATGCTAATTCAGCTACGAATTC(SEQ ID No.7)
PCR扩增参数：
反应体系：
反应程序：
重组质粒pGEX4T1-UGT1的构建
将完整的pGEX4T1载体根据需要进行双酶切，从而获得线性载体，之后通过商业化的试剂盒胶回收载体，获得纯化后的线性载体。用连接酶将单一的目的基因与线性载体进行连接，构建重组质粒pGEX4T1-UGT11，之后转化到Trans1-T1感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中，经过菌落PCR验证后，将菌液送给通用生物有限公司完成测序工作。测序成功后，让公司返还质粒，即可得到包含UGT11氨基酸序列的质粒。
3、UGT11(A456V)基因的克隆
根据上述UGT11(A456V)的CDS，通过SnapGene Viewer软件设计引物，以上述包含UGT11氨基酸序列(SEQ ID No.1)的质粒为模板，用高保真酶克隆目的基因，之后通过商业化的试剂盒进行胶回收，获得单一的目的基因。
UGT11基因突变的引物序列：
UGT11T-F：GGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGAGACACCAAACAGAGC(SEQ ID No.5)
UGT11T-R：GCTCGAGTCGACCCGGGTTACACTAATTCAGCTACGAATTC(SEQ ID No.6)
PCR扩增参数：
反应体系：
反应程序：
4、重组质粒pGEX4T1-UGT11(A456V)的构建
将完整的pGEX4T1载体根据需要进行双酶切，从而获得线性载体，之后通过商业化的试剂盒胶回收载体，获得纯化后的线性载体。用连接酶将单一的目的基因与线性载体进行连接，构建重组质粒pGEX4T1-UGT11(A456V)，之后转化到Trans1-T1感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中，经过菌落PCR验证后，将菌液送给通用生物有限公司完成测序工作。
5、UGT11(A456V)基因的原核表达与纯化
将构建成功的表达载体pGEX4T1-UGT11(A456V)转化到BL21感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中37℃过夜培养，在37℃条件下进行扩大培养，直至OD600＝0.6-0.8为止。冷却至16-18℃后，加入1M的IPTG在16℃培养室内诱导过夜。第二天离心收集菌落，超声破碎，按照文献中的优化的糖基转移酶的方法纯化蛋白(Song C,HongX,Zhao S,et al.Glucosylation of 4-Hydroxy-2,5-Dimethyl-3(2H)-Furanone,the KeyStrawberry Flavor Compound in Strawberry Fruit[J].Plant Physiol.2016,171(1):139-151；Song C,Ring L,Hoffmann T,et al.Acylphloroglucinol Biosynthesis inStrawberry Fruit[J].Plant Physiol.2015,169(3):1656-1670；Song C,Gu L,Liu J,etal.Functional Characterization and Substrate Promiscuity of UGT71Glycosyltransferases from Strawberry(Fragaria×ananassa)[J].Plantand CellPhysiology.2015,56(12))，并进行SDS-PAGE检测。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
6、香气底物筛选及活性比较
将纯化成功的蛋白进行香气底物筛选及活性比较，活性测定参考本实验室优化的方法(Song C,Ring L,Hoffmann T,et al.Acylphloroglucinol Biosynthesis inStrawberry Fruit[J].Plant Physiol.2015,169(3):1656-1670；Song C,Gu L,Liu J,etal.Functional Characterization and Substrate Promiscuity of UGT71Glycosyltransferases from Strawberry(Fragaria×ananassa)[J].Plant and CellPhysiology.2015,56(12))，测定UDP的生成量，从而确定测定糖苷的生成量。
香气底物筛选的反应体系：
香气底物筛选的对照体系：
Tris-HCl pH＝7.5(50mM) 4.6ul
DTT(50mM) 0.2ul
UDPG(2.5mM) 0.2ul
所用的香气底物有：呋喃酮、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、单甲基呋喃酮。
发现突变体UGT11(A456V)编码的蛋白糖基化呋喃酮及其衍生物的能力明显高于UGT11编码的蛋白；同时，突变体UGT11(A456V)可以影响糖基化过程中酶对糖的选择，相对活性见图1所示。
7、酶的最适pH及最适温度
对突变体UGT11(A456V)编码的蛋白催化呋喃酮及其衍生物糖苷生成过程的反应参数进行了检测，温度25℃-35℃、pH值6.5-10；结果如图2和图3所示。催化反应的最优值为温度30℃、pH值8.5。
8、呋喃酮及其衍生物糖苷的合成
通过上面的描述和数据可以看出，定点突变是一个提高呋喃酮及其衍生物糖苷重要的手段，UGT11(A456V)是一个重要的突变体，该突变体相比于野生型UGT11编码的蛋白可以高效的催化呋喃酮及其衍生物糖苷的生成，并且可以影响糖基转移酶对糖的选择。呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的获得流程图见图4。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 456
<212> PRT
<213> 茶树(Camellia sinensis)
<400> 1
Met Glu Thr Pro Asn Arg Ala Tyr Lys Ala His Val Leu Val Leu Pro
1 5 10 15
Tyr Pro Ala Gln Gly His Ile Asn Pro Met Leu Gln Phe Ser Lys Arg
20 25 30
Leu Val Ala Arg Gly Val Lys Ala Thr Leu Ala Asn Ser Val Tyr Ile
35 40 45
Ser Lys Ser Met His Lys Asp Gln Ile Ser Thr Ile Asp Thr Asp Thr
50 55 60
Phe Ser Asp Gly His Asp Asp Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Glu Asn Pro
65 70 75 80
Glu Ala Tyr Leu Thr Lys Leu Arg Asp Val Gly Ser Arg Thr Leu Ala
85 90 95
Ser Leu Ile Glu Lys Leu Asn Gly Leu Gly Arg Pro Val Asp Ala Leu
100 105 110
Ile Tyr Asp Gly Phe Leu Pro Trp Ala Leu Asp Val Ala Lys Glu Leu
115 120 125
Gly Ile Leu Gly Val Val Phe Phe Thr Gln Thr Cys Ala Val Asn Ser
130 135 140
Ile Tyr Tyr His Val His Glu Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Thr Ile Leu Leu Pro Gly Leu Pro Pro Leu Glu Ser Cys Glu
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Val Tyr Ala Tyr Gly Leu His Pro Ser Phe Tyr Asp
180 185 190
Leu Leu Val Asn Gln Phe Ser Asn Val Asp Lys Ala Asp Trp Val Leu
195 200 205
Phe Asn Thr Phe Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Val Val Asp Trp Met Ser
210 215 220
Lys Leu Trp Arg Val Arg Thr Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met Tyr
225 230 235 240
Leu Asp Gln Lys Leu Lys Asp Asp Ile Asp Tyr Gly Ile Asn Leu Phe
245 250 255
Lys Pro His Ser Thr Val Cys Met Asn Trp Leu Asn Ala Lys Pro Ser
260 265 270
Ser Ser Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Met Ala Gln Phe Glu Pro
275 280 285
Glu Gln Met Glu Glu Ile Ala Trp Gly Leu Asn Gln Ser Asn Tyr Asn
290 295 300
Phe Leu Trp Val Val Arg Ala Thr Glu Glu Ala Lys Leu Pro Asn Asn
305 310 315 320
Phe Ile Asn Asp Thr Ala Glu Lys Gly Leu Val Val Thr Trp Ser Pro
325 330 335
Gln Leu Glu Val Leu Ala His Glu Ser Ile Gly Cys Phe Val Thr His
340 345 350
Cys Gly Phe Asn Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Leu Gly Val Pro Met
355 360 365
Val Gly Val Pro Tyr Trp Ser Asp Gln Ala Thr Asn Ala Lys Phe Val
370 375 380
Glu Asp Val Trp Gly Ile Gly Ile Arg Ala Lys Met Asp Asp Lys Gly
385 390 395 400
Ile Val Arg Arg Glu Val Leu Glu Ala Cys Met Lys Glu Val Phe Glu
405 410 415
Gly Lys Lys Lys Asn Glu Val Lys Met Asn Ala Met Lys Trp Lys Lys
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Leu Ala Lys Glu Ala Leu Gly Asp Gly Gly Ser Ser Asp Lys Asn Ile
435 440 445
Asp Glu Phe Val Ala Glu Leu Ala
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<211> 1371
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gacactgaca cgttttccga cggacacgac gatggcggct acgacaacgc cgaaaatccc 240
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gctcttgatg ttgccaagga gttaggaata cttggagttg tgtttttcac tcagacttgt 420
gctgtcaata gcatatatta tcatgtgcac gagggtcttc tttcactccc actttcacca 480
gattcaacta ttttgttgcc tggattgcca ccacttgaat cctgtgaaac gccatcgttt 540
gtgtatgctt atgggttgca tccaagtttc tatgacttgt tggtgaatca attcagtaac 600
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aatgaagtta agatgaatgc aatgaaatgg aaaaaattgg cgaaagaggc gcttggtgat 1320
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Claims (9)
1.一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.编码SEQ ID No.3所示糖基转移酶突变体蛋白的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.4所示。
4.表达载体，其含有权利要求2或3所述的核苷酸片段。
5.基因工程菌，其含有权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求1所述的糖基转移酶突变体蛋白或权利要求3所述的核苷酸或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的基因工程菌在呋喃酮及其衍生物糖苷制备上的应用； 所述衍生物为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或单甲基呋喃酮。
7.权利要求1所述的糖基转移酶突变体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以包含编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的质粒为模板，以SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物进行PCR，得到SEQ ID No.4所示的突变基因；
（2）将步骤（1）得到的突变基因进行原核表达；
（3）分离纯化得到氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的糖基转移酶突变体蛋白。
8.一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的方法，其特征在于，以SEQ ID No.3所示的糖基转移酶突变体蛋白为催化剂，以呋喃酮及其衍生物为底物进行催化反应生成相应的呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷，所述衍生物为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或单甲基呋喃酮。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，催化反应的温度30℃、pH值8.5。
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