CN107523578B

CN107523578B - 海带中编码甘露醇-1-磷酸酶的基因、其蛋白和用途

Info

Publication number: CN107523578B
Application number: CN201710963893.3A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 池姗; 刘翠
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2037-10-16
Also published as: CN107523578A

Abstract

本发明属于基因工程领域，更具体涉及海带中编码甘露醇‑1‑磷酸酶的基因、其蛋白和用途。本发明公开了真海带中编码甘露醇‑1‑磷酸酶的基因SjaM1P2，SjaM1P2基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列。该基因编码的产物为甘露醇‑1‑磷酸酶，该甘露醇‑1‑磷酸酶氨基酸为SEQ ID NO：2所示的序列，该酶具有催化甘露醇‑1‑磷酸转化为甘露醇的活性。本发明公开的SjaM1P2基因，其编码产物甘露醇‑1‑磷酸酶与底物的结合能力强，催化效率高，可应用于甘露醇的生产。

Description

海带中编码甘露醇-1-磷酸酶的基因、其蛋白和用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体涉及海带中编码甘露醇-1-磷酸酶的基因、其蛋白和用途。

背景技术

甘露醇(Mannitol)是一种六元糖醇(C6H14O6)，与山梨醇(Sorbitol)、艾杜糖醇(Iditol)和塔里糖醇(Talitd)等互为同分异构体。甘露醇为白色或无色针状晶体或结晶性粉末，无臭、味甜，其甜度相当于蔗糖的40％-50％。对稀酸稀碱性质稳定，是唯一一种不吸湿的多元醇。

甘露醇广泛存在于细菌，真菌，原生动物，高等植物和藻类中。1806年，Proust首次从甘露蜜树中分离得到甘露醇，1884年，Stenhouse从褐藻中发现了甘露醇，也是自然界中发现的第一种结晶糖醇。甘露醇在食用菌类、地衣及胡萝卜中含量较多，在褐藻中的含量也相当丰富。

甘露醇的多种特性使它成为一种有吸引力的食品和医药原料，它的血糖指数和胰岛素指数为0，并且在人体内不代谢，食入后有75％被肠菌群发酵吸收，剩余25％在尿液排出前吸收，由于甘露醇几乎不产生热量，因此一般作为低热量和低生龋齿的甜味剂。

甘露醇在食品保健行业的应用有以下几方面：作为无糖口香糖的甜味剂或防粘剂；作为糖果和冰淇淋等甜味食品的糖衣；作为食品的定型剂、防结块剂和品质改良剂；用于储藏水果和果脯，提升香味。此外，由于甘露醇在体内的一次代谢途径与胰岛素无关，故可作为替代糖味剂用来制作低热值、低糖食品供糖尿病人使用。

医药方面，甘露醇是我国基本药物，已收载于《中国药典》。甘露醇注射液因其高渗特性，可作为脱水药用于治疗青光眼、脑水肿并可预防和治疗糖尿病、急性肾功能衰竭、腹水等。甘露醇化学性质稳定，无吸湿性，可作为片剂的赋形剂、填充剂，以及胶囊的增塑剂等。此外，甘露醇可发生酯化、醚化、取代、缩合等反应，其衍生物可用作降低胆甾醇药物及冠状血管扩张药。甘露醇还可与氨基酸配制成复合输液用于醒酒药、口中清凉剂等咀嚼片及糖尿病患者、肥胖患者以及防龋齿的甜味剂等。

甘露醇还是重要的化工原料，甘露醇在塑料行业用作增塑剂，在化妆品中作保湿剂，并可作为植物生长调节剂，用于果品贮藏保鲜。此外，甘露醇在一定条件下可合成大量精细化工制品。甘露醇衍生物聚甘露醇-氧化丙烯醚可用来制造硬质泡沫塑料，用于保温和消防。硬脂酸甘露醇酯可用作涂料、纺织、农药等的乳化剂、分散剂。

甘露醇每年全球的消费量约为150000t，占多元醇总产量的11％左右，其中美国的消耗量最大，其次是一些欧洲国家。甘露醇主要用于医药行业，现阶段最主要的用途仍是制作大输液，在食品行业甘露醇则是主要用于生产口香糖、咀嚼片和口含片等，而且使用量正在不断扩大。近年来甘露醇的需求量一直有较大的增长，潜在市场较大。

甘露醇的生产方法较多，主要有海带提取法、化学合成法、生物合成法。但大部分产物都不是纯净物，而是山梨醇和甘露醇的混合物，如要得到单一产品，必须经过分离提纯。

其中，海带提取法指的是从海带制备碘及褐藻胶后的废水中回收甘露醇，从海带中提取的甘露醇，纯度高，无副产物山梨醇，是我国生产甘露醇的传统方法和主要手段。但该法回收率较低，且精制工序繁琐，加上原料来源受地区局限等因素，使得这种传统生产工艺受到极大限制。制约甘露醇制备的另一因素是海带中甘露醇的含量有逐年减少的趋势，主要与海带厚成期海上光照不足及品种选择等有关。因此，从海带甘露醇代谢途径入手，进行相关基因解析，可对提高海带甘露醇含量提供科学依据。

Iwamoto等2005年提出藻类中甘露醇的合成与分解途径:果糖-6-磷酸在甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase,M1PDH)的作用下生成甘露醇-1-磷酸，然后甘露醇-1-磷酸在甘露醇-1-磷酸酶

(mannitol-1-phosphatase,M1Pase)的作用下生成甘露醇；分解途径为甘露醇在甘露醇-2-脱氢酶(mannitol-2-dehydrogenase,M2DH)作用下生成果糖，果糖又在果糖激酶(fructose kinase,FK)作用下生成果糖-6-磷酸。由此可知，甘露醇-1-磷酸酶M1Pase是藻类中甘露醇合成途径的关键酶之一，藻类M1Pase基因的克隆，对获得甘露醇含量高的海带(筛选甘露醇-1-磷酸酶表达量或活性高的海带株)，或构建甘露醇高含量的基因工程海带(如在海带中过表达M1Pase基因)等具有重要实际应用意义。

另外，生物合成法，又称发酵法，指微生物，如酵母、丝状真菌、乳酸菌等，利用碳水化合物经一系列酶促反应，合成甘露醇。发酵法即酵母、乳酸菌、类球红细菌、一些丝状真菌(如Pircularia oryzae、产黄青霉、亮白曲霉等)等利用的甘露醇的合成途径主要有两种：前述的Iwamoto发现的甘露醇合成途径和以葡萄糖和果糖的混合物为底物，也可以只以果糖为底物，其中葡萄糖和果糖进入膜内后转变为6-磷酸葡萄糖，然后进入磷酸戊糖途径，生成NADH，同时果糖在甘露醇脱氢酶的作用下，利用生成的NADH直接转变为甘露醇，NADH则重新转变为NAD⁺。因此，克隆得到催化活性更高的合成途径中的关键酶基因，包括M1Pase基因等，从而利用基因工程手段改造发酵菌对提高发酵法效率具有重要意义。

综上，克隆M1Pase基因及其编码产物甘露醇-1-磷酸酶对甘露醇生产中的海带提取法和发酵法均具有重要应用价值，对提高甘露醇产量，满足市场对甘露醇的巨大需求具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供来源于真海带(Saccharina japonica Aresch)的编码甘露醇-1-磷酸酶(M1Pase)的基因。

本发明的另一个目的在于提供一种甘露醇-1-磷酸酶，该酶具有催化甘露醇-1-磷酸转化为甘露醇的活性。

本发明的目的还在于提供一种来源于真海带的编码甘露醇-1-磷酸酶的基因在得到高甘露醇含量的海带中的用途。

本发明提供了一种来源于真海带的编码甘露醇-1-磷酸酶(M1Pase)的基因，命名为SjaM1P2基因，所述的SjaM1P2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明提供了一种甘露醇-1-磷酸酶，所述的甘露醇-1-磷酸酶由SjaM1P2基因编码；所述的甘露醇-1-磷酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。

本发明还提供了重组载体，该重组载体含有SjaM1P2基因。

本发明还提供了制备上述的重组载体的方法，该方法包括将SjaM1P2基因插入载体；

其中，所述的载体包括原核细胞表达载体或真核细胞表达载体；

优选地，所述的真核细胞表达载体包括但不限于酵母表达载体、昆虫细胞表达载体或哺乳动物细胞表达载体；

优选地，所述的原核细胞表达载体包括但不限于pET表达载体、pGEX表达载体或pMAL表达载体。

本发明还提供了一种重组有机体，其含有上述的重组载体。

本发明还提供了制备上述的重组有机体的方法，该方法包括将上述重组载体导入宿主有机体；

其中，所述的宿主有机体选自大肠杆菌、酿酒酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞。

本发明还提供了SjaM1P2基因在甘露醇生产中的用途；

优选地，所述的用途为：以SjaM1P2基因或甘露醇-1-磷酸酶为分子标记，筛选或选育甘露醇含量高的海带；

优选地，所述的用途还为：在海带中过表达SjaM1P2基因，构建甘露醇含量高的基因工程海带。

优选地，所述的用途还为：根据SjaM1P2基因，改造现有的甘露醇发酵法中的发酵微生物中的相关M1Pase基因，以获得甘露醇-1-磷酸催化活性更高、甘露醇产量更高的发酵微生物。

本发明还提供了甘露醇-1-磷酸酶在甘露醇生产中的用途，该用途包括：以所述的甘露醇-1-磷酸酶为标记，筛选或选育甘露醇含量高的海带。

本发明提供的SjaM1P2基因编码的甘露醇-1-磷酸酶，是甘露醇合成途径中的重要酶，该基因或酶对甘露醇的生产具有重要的价值：可用于改进海带提取法及生物合成法。与现有克隆得到的甘露醇-1-磷酸酶，如长囊水云中的甘露醇-1-磷酸酶相比，本发明提供的SjaM1P2基因编码的甘露醇-1-磷酸酶Km值(以甘露醇-1-磷酸为底物)更小，即本发明的提供的SjaM1P2基因编码的甘露醇-1-磷酸酶对甘露醇-1-磷酸的亲和力更高，催化效果更好。

附图说明

图1为实施例4中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2为实施例5中的最适反应pH曲线图。

图3为实施例6中的最适反应温度曲线图。

具体实施方法

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

实施例1真海带中SjaM1P2基因的获取

根据SEQ ID NO：1所示SjaM1P2基因序列，对SjaM1P2基因进行全序列合成(委托上海旭冠生物科技发展有限公司进行合成)，同时在两端引入BamH I和EcoR I限制性酶切位点及相应保护碱基，得到SjaM1P2基因。

实施例2真海带中SjaM1P2基因的获取

采集海带，采用Trizol法提取海带雌配子体总RNA，使用TAKARA公司PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒以海带雌配子体总RNA反转录的第一链cDNA为模板，采用PCR方法克隆SjaM1P2基因，PCR扩增引物为：5’-gga tcc atggagcag gcaaccgccaacaa-3’和5’-gaa ttc tta ggc ctt gcc gtg gac cc-3’。PCR扩增程序为：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，于-20℃保存。

实施例3SjaM1P2基因的载体构建和表达纯化

将实施例1合成得到的SjaM1P2基因或实施例2经PCR扩增回收到的SjaM1P2基因，连接至pGEX-6P1载体(购自Novagen公司)的BamH I和EcoR I位点之间，获得pGEX-6P1-SjaM1P2重组载体；将获得的pGEX-6P1-SjaM1P2重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞(购自Takara公司)中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养平板上，37℃培养过夜；将阳性克隆接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.4时，加入终浓度为0.5mM IPTG，在20℃、160rpm的诱导条件培养16h，诱导目的蛋白的表达；诱导结束后取2mL菌液于4℃、12000rpm离心5min，弃上清，将管倒置于吸水纸上；沉淀加入1/2体积提前预冷好的50mM的PBS缓冲液(pH＝7.5)中(即2mL离心后的沉淀中加入1mLPBS)，充分混匀；超声破碎菌液，收集破碎后的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，GST柱(购自GE公司)纯化，切除GST标签，获得重组蛋白，该重组蛋白为SjaM1P2基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，以下称为SjaM1P2酶。

实施例4重组蛋白的鉴定

将实施例2获得的SjaM1P2酶，进行SDS聚丙烯酰胺胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳图如图1所示，SjaM1P2酶的分子量约70KD，符合预期大小。

实施例5最适反应pH值的测定

酶活性检测方法为：在80μL的反应体系中，含有100mMTris-HCl(pH7.5)和0.8mMMgCl₂(终浓度)，加入约2.1μg的重组蛋白，30℃进行反应。将不含底物的各反应组分，加入PCR管中，利用PCR仪精确保温1.5min，通过向反应体系中添加终浓度为0.02mM的甘露醇-1-磷酸起始反应，反应5min后，添加20μL孔雀绿试剂(MalachiteGreen257PhosphateAssayKit,Centaur)终止反应。室温孵育30min显色后，用分光光度计检测生成的自由磷酸基团。

分别在不同pH值下(pH5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.75、pH 9.0、pH 10.0)测定SjaM1P2酶的活性，绘制最适反应pH曲线，最适反应pH曲线如图2所示.根据图2显示，SjaM1P2酶的最适反应pH为8.5和9.5之间。

实施例6最适反应温度的测定

根据实施例5中的酶活测定方法，分别在不同温度下(5℃、10℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、50℃、60℃)测定SjaM1P2酶的活性，绘制最适反应温度曲线，最适反应温度曲线如图3所示。根据图3显示，SjaM1P2酶的最适反应温度30℃。

实施例7酶学参数的测定

根据实施例5所述酶活性检测方法，分别在0.001mM、0.005mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.1mM甘露醇-1-磷酸浓度下，测定SjaM1P2酶的活性，结果见表1：

表1

底物浓度(mM)	0.001	0.005	0.02	0.03	0.04	0.1
							酶活(μmol min<sup>-1</sup>mg protein<sup>-1</sup>)	1.1	1.9	3.4	3.8	4.3	4.8

绘制底物浓度与酶活曲线，计算SjaM1P2酶的酶学参数，结果见表2：

表2

SjaM1P2酶学参数	值
		Vmax(μmol min<sup>-1</sup>mg<sup>-1</sup>)	6.6
Km(mM)	0.024
		Kcat(s<sup>-1</sup>)	8.135
pH	8.5
		温度(℃)	30

对比例本申请和其他物种甘露醇-1-磷酸酶的Km值比较

在最适pH和最适反应温度条件下，以甘露醇-1-磷酸为底物，分别测定SjaM1P2酶和长囊水云(Ectocarpus siliculosus)的甘露醇-1-磷酸酶(编码基因为EsiM1P2，简称EsiM1P2酶)、红藻Caloglossa continua的甘露醇-1-磷酸酶、红藻Dixoniellagrisea的甘露醇-1-磷酸酶、褐藻Dictyota dichotoma的甘露醇-1-磷酸酶的Km值，结果如表3。

表3

种类	Km(mM)	pH	温度
				SjaM1P2	0.024	8.5	30℃
EsiM1P2	0.67	7.0	30℃
				红藻Caloglossa continua	0.41	7.4	30℃
红藻Dixoniellagrisea	6.3	7.3	30℃
				褐藻Dictyota dichotoma	0.83	7.0	30℃

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛海大蓝科生物科技有限公司、中国海洋大学

<120> 海带中编码1-磷酸甘露醇磷酸酶的M1P2基因、其蛋白和用途

<130> 20170809

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> Saccharina japonica Aresch

<400> 1

atggagcagg caaccgccaa caaggatatc tctatcctct tcgacttcga tggcaccatc 60

ggagacacgg agaccccggc tatggaggtg gcgttctggg agctcgcccc ttacctcccc 120

gataccaccc ccgacaagct ggacaacttg atgcccgagt tcgtgaggga caacgccggc 180

aaggctttcg agttcatggt ggagacggtc gacgaggagc gcaaggccgc ggggatggac 240

agcgtcgagg agatgtttgc cgccaagtcg gagccccaga acatgcttga cgcggtagac 300

ccccacagga aaaagttcgg cctgaagagc ttcgccgagc tccgcgcccc ggaagggggt 360

gaggcggcga cccttctgat tcagcagaag acggagaccg tcgacgccct cagcaagatc 420

gcgcagccct gcaacggcgt cagagaagta ctggcggcct tgaccgcggc gacggtgcca 480

ttctgcatct ctactaccag ccccaagccg agggtgccag cgtccatcac ggcctgcggc 540

cttgacgagt acttcccccc cgacaaggtg cacagcggag agagcgactt cgacccccct 600

cgcttcaagc ccaacccgtc ggtctacctc aaggccgccg aaaccgaggg caaggagccc 660

gtgaactgca tcgcggttga ggacagcggt tctggcgtgg gttcagcttc gaacgccggc 720

gtcggactca ccgtggggta cgtcggggcg tctcacattc ccgaatacaa gaaggacacg 780

cacgccgaga tgctcatggc cggggggcgc gcggagaacg ggaagggcgc ggagatcgtg 840

atctcggaca tgaaggacct gctgaagatc atcgacttct tcgcgggcgc gaagacagcc 900

ggaaagttgg cgcccttcga tttcccgacg gccatggttg cctccatgca gcagccggtg 960

tgggtccacg gcaagaaggc ctaa 984

<210> 2

<211> 327

<212> PRT

<213> Saccharina japonica Aresch

<400> 2

Met Glu Gln Ala Thr Ala Asn Lys Asp Ile Ser Ile Leu Phe Asp Phe

1 5 10 15

Asp Gly Thr Ile Gly Asp Thr Glu Thr Pro Ala Met Glu Val Ala Phe

20 25 30

Trp Glu Leu Ala Pro Tyr Leu Pro Asp Thr Thr Pro Asp Lys Leu Asp

35 40 45

Asn Leu Met Pro Glu Phe Val Arg Asp Asn Ala Gly Lys Ala Phe Glu

50 55 60

Phe Met Val Glu Thr Val Asp Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Met Asp

65 70 75 80

Ser Val Glu Glu Met Phe Ala Ala Lys Ser Glu Pro Gln Asn Met Leu

85 90 95

Asp Ala Val Asp Pro His Arg Lys Lys Phe Gly Leu Lys Ser Phe Ala

100 105 110

Glu Leu Arg Ala Pro Glu Gly Gly Glu Ala Ala Thr Leu Leu Ile Gln

115 120 125

Gln Lys Thr Glu Thr Val Asp Ala Leu Ser Lys Ile Ala Gln Pro Cys

130 135 140

Asn Gly Val Arg Glu Val Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Thr Val Pro

145 150 155 160

Phe Cys Ile Ser Thr Thr Ser Pro Lys Pro Arg Val Pro Ala Ser Ile

165 170 175

Thr Ala Cys Gly Leu Asp Glu Tyr Phe Pro Pro Asp Lys Val His Ser

180 185 190

Gly Glu Ser Asp Phe Asp Pro Pro Arg Phe Lys Pro Asn Pro Ser Val

195 200 205

Tyr Leu Lys Ala Ala Glu Thr Glu Gly Lys Glu Pro Val Asn Cys Ile

210 215 220

Ala Val Glu Asp Ser Gly Ser Gly Val Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly

225 230 235 240

Val Gly Leu Thr Val Gly Tyr Val Gly Ala Ser His Ile Pro Glu Tyr

245 250 255

Lys Lys Asp Thr His Ala Glu Met Leu Met Ala Gly Gly Arg Ala Glu

260 265 270

Asn Gly Lys Gly Ala Glu Ile Val Ile Ser Asp Met Lys Asp Leu Leu

275 280 285

Lys Ile Ile Asp Phe Phe Ala Gly Ala Lys Thr Ala Gly Lys Leu Ala

290 295 300

Pro Phe Asp Phe Pro Thr Ala Met Val Ala Ser Met Gln Gln Pro Val

305 310 315 320

Trp Val His Gly Lys Lys Ala

325

Claims

1.真海带中编码甘露醇-1-磷酸酶的基因，所述基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

2.权利要求1所述的基因编码的甘露醇-1-磷酸酶，所述甘露醇-1-磷酸酶氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。

3.重组表达载体，其含有如权利要求1所述的基因。

4.制备权利要求3所述的重组表达载体的方法，所述方法包括将权利要求1所述的基因插入载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述的载体包括原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。

6.重组有机体，其含有权利要求3所述的重组表达载体；所述的有机体选自大肠杆菌、酿酒酵母。

7.制备权利要求6所述的重组有机体的方法，所述方法包括将权利要求3所述的重组表达载体导入宿主有机体。

8.权利要求1所述的基因在甘露醇生产中的用途，所述用途包括：以权利要求1所述的基因为分子标记，筛选甘露醇含量高的海带。

9.权利要求2所述的甘露醇-1-磷酸酶在甘露醇生产中的用途，所述用途包括：以所述的甘露醇-1-磷酸酶为标记，筛选甘露醇含量高的海带。