CN112680482B

CN112680482B - 一种甘露醇的生物制备方法

Info

Publication number: CN112680482B
Application number: CN202110037416.0A
Authority: CN
Inventors: 游淳; 魏欣蕾
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2041-01-12
Also published as: CN112680482A

Abstract

本发明公开了一种甘露醇的生物制备方法。本发明所要保护的体外多酶催化反应制备甘露醇的方法，包括以淀粉和/或淀粉衍生物为底物，采用用于制备甘露醇的组合物进行多酶催化反应得到甘露醇的步骤。所述用于制备甘露醇的组合物为组合物X、组合物Y或组合物Z。所述组合物X含有酶X，所述酶X是活性成分为淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、甘露醇1‑磷酸脱氢酶、甘露醇1‑磷酸酶和甲酸脱氢酶的组合物。本发明通过体外多酶催化制备甘露醇，可以使用多种廉价易得原料以99％的收率获得产物，生产成本低、底物转化率和产品收率高、环境友好，适宜推广。

Description

一种甘露醇的生物制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甘露醇的生物制备方法。

背景技术

D-甘露醇(以下简称甘露醇)又名D-甘露糖醇、己六醇、虫草酸、D-木蜜醇，是一种天然化合物，广泛存在于自然界的多种细菌、真菌、藻类和植物中。

甘露醇广泛应用于食品、制药、化工等领域。在食品工业方面，甘露醇吸水性小，并具有爽口的甜味，可用于口香糖、年糕等食品的防粘；在制药工业方面，甘露醇进入体内后能提高血浆渗透压，使组织脱水，可降低颅内压和眼内压，也是良好的利尿剂；在化工领域，以甘露醇为起始剂加压而制成的聚甘露醇-氧化丙烯醚广泛应用于塑料行业中，而由硬脂酸与甘露醇酯化反应制得硬脂酸甘露醇酯可作为工业乳化剂和分散剂等。

目前，应用最广泛的生产甘露醇的方法为化学合成法，以镍作为催化剂，在高温高压条件下，以淀粉、蔗糖或果葡糖浆等为原料，通过催化加氢制备得到甘露醇。该方法原料来源稳定，生产期限不受限制，然而化学催化法的选择性较低，在反应过程中产生大量副产物D-山梨醇。例如，使用蔗糖水溶液甲酸水解成葡萄糖和果糖再进行催化氢化反应的方法获得的实际产物中，山梨醇占80％，而甘露醇仅占20％(吴国荃等.2004.化工技术经济(04):4-6.)从海藻、海带等天然物质中提取甘露醇是另一种工业生产甘露醇的方法，该方法可得到单一的甘露醇，然而受到原料资源、提取收率、气候条件、能源消耗等限制。微生物发酵生产甘露醇具有反应选择性高、反应条件温和、能耗低等优势，但存在微生物工程菌代谢改造困难、易产生代谢副产物等缺点。

因此，亟待开发一种低成本、高产率的生产甘露醇的新方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何通过体外多酶反应体系催化生产甘露醇或如何提高生产甘露醇的产物收率。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了体外多酶催化反应制备甘露醇的方法。

所述方法包括以淀粉和/或淀粉衍生物为底物，采用用于制备甘露醇的组合物进行多酶催化反应，得到甘露醇的步骤；所述多酶催化反应的温度为25-70℃，pH值为5.0-8.5，催化反应的时间为1-72小时。

所述用于制备甘露醇的组合物为组合物X、组合物Y或组合物Z；所述组合物X含有酶X，所述酶X是活性成分为淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、甘露醇1-磷酸脱氢酶、甘露醇1-磷酸酶和甲酸脱氢酶的组合物；所述组合物Y含有酶Y，所述酶Y是活性成分为所述组合物X和异淀粉酶的组合物；所述组合物Z含有酶Z，所述酶Z是活性成分为所述组合物X、异淀粉酶、4-α-转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的组合物。

所述淀粉磷酸化酶可为如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质，

A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第21-817位的蛋白质，

A3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

A4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

所述葡萄糖磷酸变位酶可为如下B1)、B2)、B3)、B4)或B5)的蛋白质：

B1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质，

B2)氨基酸序列是序列表中序列2的第330-921位的蛋白质，

B3)氨基酸序列是序列表中序列2的第344-921位的蛋白质，

B4)在B1)或B2)或B3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

B5)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由B1)或B2)或B3)衍生的或与B1)或B2)或B3)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

所述磷酸葡糖异构酶可为如下C1)、C2)、C3)、C4)或C5)的蛋白质：

C1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质，

C2)氨基酸序列是序列表中序列3的第330-788位的蛋白质，

C3)氨基酸序列是序列表中序列3的第341-788位的蛋白质，

C4)在C1)或C2)或C3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

C5)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由C1)或C2)或C3)衍生的或与C1)或C2)或C3)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

所述甘露醇1-磷酸脱氢酶可为如下D1)、D2)、D3)或D4)的蛋白质：

D1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质，

D2)氨基酸序列是序列表中序列4的第1-382位的蛋白质，

D3)在D1)或D2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

D4)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由D1)或D2)衍生的或与D1)或D2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

所述甘露醇1-磷酸酶可为如下E1)、E2)、E3)或E4)的蛋白质：

E1)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质，

E2)氨基酸序列是序列表中序列5的第35-343位的蛋白质，

E3)在E1)或E2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

E4)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由E1)或E2)衍生的或与E1)或E2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

上述甘露醇1-磷酸酶是使所述甘露醇1-磷酸酶的编码基因在生物中进行表达得到的，所述生物可为所述埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述甘露醇1-磷酸酶的基因可为下述任一种DNA分子：

e1)核苷酸序列为序列表中序列11的DNA分子；

e2)核苷酸序列为序列表中序列11的第103-1032位核苷酸的DNA分子；

e3)与e1)或e2)所示的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。

所述甲酸脱氢酶可为如下F1)、F2)、F3)或F4)的蛋白质：

F1)氨基酸序列是序列表中序列6的蛋白质，

F2)氨基酸序列是序列表中序列6的第1-401位的蛋白质，

F3)在F1)或F2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

F4)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由F1)或F2)衍生的或与F1)或F2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

所述异淀粉酶可为如下G1)、G2)、G3)或G4)的蛋白质：

G1)氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质，

G2)氨基酸序列是序列表中序列7的第1-716位的蛋白质，

G3)在G1)或G2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

G4)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由G1)或G2)衍生的或与G1)或G2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

所述4-α-转葡糖苷酶可为如下H1)、H2)、H3)或H4)的蛋白质：

H1)氨基酸序列是序列表中序列8的蛋白质，

H2)氨基酸序列是序列表中序列8的第1-659位的蛋白质，

H3)在H1)或H2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

H4)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由H1)或H2)衍生的或与H1)或H2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

所述聚磷酸葡萄糖激酶可为如下I1)、I2)、I3)或I4)的蛋白质：

I1)氨基酸序列是序列表中序列9的蛋白质，

I2)氨基酸序列是序列表中序列9的第1-262位的蛋白质，

I3)在I1)或I2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，

I4)将序列表中序列9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由I1)或I2)衍生的或与I1)或I2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上文中，所述淀粉磷酸化酶可为天然的淀粉磷酸化酶，如来源于大肠杆菌(Escherichia coli，UniProt编号P00490、A0A0A0HB49等)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima，UniProt编号G4FEH8)或热纤维梭菌(Clostridium thermocellum，UniProt编号A3DCB6)；也可为非天然的淀粉磷酸化酶，如重组淀粉磷酸化酶。

上文中，所述葡萄糖磷酸变位酶可为天然的葡萄糖磷酸变位酶，如来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum，UniProt编号A3DEW8)或Thermococcus kodakarensis(UniProt编号Q68BJ6)；也可为非天然的葡萄糖磷酸变位酶，如重组葡萄糖磷酸变位酶。

上文中，所述磷酸葡糖异构酶可为天然的磷酸葡糖异构酶，如来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum，UniProt编号A3DBX9)或嗜热栖热菌(Thermusthermophilus，UniProt编号Q5SLL6)；也可为非天然的磷酸葡糖异构酶，如重组磷酸葡糖异构酶。

上文中，所述甘露醇1-磷酸脱氢酶可为天然的甘露醇1-磷酸脱氢酶，如来源于大肠杆菌(Escherichia coli，UniProt编号P09424、Q8XDG9、Q8FCB7、B1IZJ2等)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，UniProt编号P42957)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis，UniProt编号P27543)或变形链球菌(Streptococcus mutans，UniProt编号Q02418)；也可为非天然的甘露醇1-磷酸脱氢酶，如重组甘露醇1-磷酸脱氢酶。

上文中，所述甘露醇1-磷酸酶可为天然的甘露醇1-磷酸酶，如来源于柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella，UniProt编号O43980)或食用海带(Saccharina japonica，UniProt编号A0A068B0R3)；也可为非天然的甘露醇1-磷酸酶，如重组甘露醇1-磷酸酶。

上文中，所述甲酸脱氢酶可为天然的甲酸脱氢酶，如来源于硫杆菌(Thiobacillussp.，UniProt编号Q76EB7)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii，UniProt编号O13437)、假单胞菌(Pseudomonas sp.，UniProt编号P33160)、稳定伯克霍尔德菌(Burkholderiastabilis，UniProt编号B5A8W5)或Mycolicibacterium vaccae(UniProt编号Q93GV1)；也可为非天然的甲酸脱氢酶，如重组甲酸脱氢酶。

上文中，当所述方法使用来源于柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)的甘露醇1-磷酸酶时，优选地，所述甘露醇1-磷酸酶的基因序列为经过大肠杆菌(Escherichia coli)偏爱密码子优化的DNA序列，即通过对甘露醇1-磷酸酶基因编码的密码子的在大肠杆菌中表达的密码子偏好性进行优化和对甘露醇1-磷酸酶基因的GC含量和mRNA在大肠杆菌的稳定性进行优化后获得的DNA序列。

上文中，所述4-α-转葡糖苷酶可为天然的4-α-转葡糖苷酶，如来源于海岸热球菌(Thermococcus litoralis，UniProt编号O32462)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima，UniProt编号P80099)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana，UniProt编号O86956)或丁酸梭菌(Clostridium butyricum，UniProt编号Q59266)；也可为非天然的4-α-转葡糖苷酶，如重组4-α-转葡糖苷酶。

上文中，所述聚磷酸葡萄糖激酶可为天然的聚磷酸葡萄糖激酶，如来源于嗜热子囊菌(Thermobifida fusca，UniProt编号Q47NX5)或结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，UniProt编号A5U654、P9WIN1等)；也可为非天然的聚磷酸葡萄糖激酶，如重组聚磷酸葡萄糖激酶。

上述用于制备甘露醇的组合物中的活性成分可混合包装或可单独包装再混合。

上述组合物X还可含有磷酸盐、辅酶、甲酸盐和/或镁盐。

上述组合物Y还可含有磷酸盐、辅酶、甲酸盐和/或镁盐。

上述组合物Z还含有聚磷酸盐。

上述聚磷酸盐可为六偏磷酸钠和/或三聚磷酸钠。

上述组合物Z还可含有磷酸盐、辅酶、甲酸盐和/或镁盐。

上述磷酸盐可为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的至少一种。

上述辅酶可为NADH、NAD+、NADPH、NADP+中的至少一种。

上述甲酸盐可为甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵、甲酸钙中的至少一种。

上述镁盐可为氯化镁和/或硫酸镁。

上述淀粉和/或淀粉衍生物为可溶性淀粉、可溶性直链淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精和/或麦芽多糖。

上述多酶催化反应为分步进行催化或同时进行催化。所述同时进行催化的时间为1-72小时。

所述多酶催化反应为多酶催化反应L、多酶催化反应M或多酶催化反应N。

上述方法中所述多酶催化反应L中，所述用于制备甘露醇的组合物为组合物X。所述进行分步催化的催化反应过程可如图2所示，具体可为：所述淀粉磷酸化酶利用无机磷催化所述淀粉和/或淀粉的衍生物磷酸化为葡萄糖1-磷酸，所述葡萄糖磷酸变位酶催化所述葡萄糖1-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸，所述磷酸葡糖异构酶催化所述葡萄糖6-磷酸转化为果糖6-磷酸，所述甘露醇1-磷酸脱氢酶利用辅酶催化将所述果糖6-磷酸还原为甘露醇1-磷酸，同时NAD+或NADP+依赖的所述甲酸脱氢酶催化甲酸盐为底物进行所述辅酶的再生，所述甘露醇1-磷酸酶催化所述甘露醇1-磷酸脱磷酸基团生成甘露醇。

上述方法中所述多酶催化反应M中，所述用于制备甘露醇的组合物为组合物Y。所述进行分步催化的催化反应过程可为：加入所述异淀粉酶进行催化反应0.1-72小时后，加入所述组合物X进行所述多酶催化反应L得到甘露醇。

上述方法中所述多酶催化反应N中，所述用于制备甘露醇的组合物为组合物Z。所述进行分步催化的催化反应过程可为：加入所述异淀粉酶进行催化反应0.1-72小时后，加入所述组合物X进行所述多酶催化反应L1-48小时，之后加入所述4-α-转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶进行催化反应得到甘露醇。加入所述4-α-转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶进行催化反应的时间可为0.5-30小时。

上述方法中所述多酶催化反应L中可包含缓冲液体系。所述缓冲液可为HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的任一种。所述缓冲液可为Tris-HCl缓冲液。所述Tris-HCl缓冲液的浓度可为20-300mM。所述Tris-HCl缓冲液的浓度可为100-300mM。所述Tris-HCl缓冲液的浓度可为200mM。

上述方法中所述多酶催化反应M或N中的异淀粉酶催化反应中可包含缓冲液体系，所述缓冲液可为乙酸钠缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的任一种。所述缓冲液的浓度可为1-50mM，所述缓冲液的浓度可为2-20mM。所述缓冲液的浓度可为3-10mM，所述缓冲液的浓度可为5mM。

上述方法中所述多酶催化反应为多酶催化反应L，所述多酶催化反应L为分步进行催化或同时进行催化。所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1-200g/L。所述淀粉磷酸化酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述葡萄糖磷酸变位酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述磷酸葡糖异构酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述甘露醇1-磷酸酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述甲酸脱氢酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述辅酶的浓度可为0.005-60mM。所述甲酸盐的浓度可为10-2000mM。所述磷酸盐的浓度可为1-150mM。所述镁盐的浓度可为0.1-20mM。所述多酶催化反应L的反应温度可为25-70℃。pH值可为5.0-8.5。所述同时进行催化的时间可为1-48小时。

或，

上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应M。所述多酶催化反应M为分步进行催化，所述异淀粉酶的催化步骤中，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1-500g/L，所述异淀粉酶的浓度可为0.1-10U/mL，所述镁盐的浓度可为0.01-10mM。所述异淀粉酶催化反应的反应温度可为10-99℃，pH值可为4.0-8.5，所述催化反应时间可为0.1-72小时。

所述多酶催化反应M为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1-200g/L。所述多酶催化反应M的反应温度可为25-70℃。pH值可为5.0-8.5。所述同时进行催化的时间可为1-72小时。

或，

上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应N。所述多酶催化反应N为分步进行催化，所述4-α-转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的催化步骤中，所述4-α-转葡糖苷酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述聚磷酸葡萄糖激酶的浓度可为0.1-10U/mL。所述聚磷酸盐的浓度可为0.01-20mM。所述4-α-转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶催化反应的反应温度可为25-70℃，pH值可为5.0-8.5，所述催化反应反应时间可为0.5-30小时。

所述多酶催化反应N为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1-200g/L，所述多酶催化反应N的反应温度可为25-70℃。pH值可为5.0-8.5。所述同时进行催化的时间可为1-72小时。

上述方法中所述多酶催化反应为多酶催化反应L，所述多酶催化反应L为分步进行催化或同时进行催化。所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为5-100g/L。所述淀粉磷酸化酶的浓度可为0.2-5U/mL。所述葡萄糖磷酸变位酶的浓度可为0.2-5U/mL。所述磷酸葡糖异构酶的浓度可为0.2-5U/mL。所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的浓度可为0.2-5U/mL。所述甘露醇1-磷酸酶的浓度可为0.2-5U/mL。所述甲酸脱氢酶的浓度可为0.2-5U/mL。所述辅酶的浓度可为0.01-10mM。所述甲酸盐的浓度可为40-800mM。所述磷酸盐的浓度可为2-50mM。所述镁盐的浓度可为2-15mM。所述多酶催化反应L的反应温度可为30-50℃，pH值为6.0-7.5，所述同时进行催化的时间可为8-36小时。

或，

上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应M，所述多酶催化反应M为分步进行催化，所述异淀粉酶的催化步骤中，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10-400g/L。所述异淀粉酶的浓度可为0.5-2U/mL。所述镁盐的浓度可为0.2-1mM。所述异淀粉酶催化反应的反应温度可为50-90℃，pH值可为4.5-6.5，所述催化反应的时间可为1-24小时。

所述多酶催化反应M为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为5-100g/L。所述多酶催化反应M的反应温度可为30-50℃。pH值可为6.0-7.5。所述同时进行催化的时间可为8-60小时。

或，

上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应N，所述多酶催化反应N为分步进行催化，所述4-α-转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的催化步骤中，所述4-α-转葡糖苷酶的浓度可为0.5-2U/mL。所述聚磷酸葡萄糖激酶的浓度可为0.5-2U/mL。所述聚磷酸盐的浓度可为0.5-6mM。所述4-α-转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶催化反应的反应温度可为30-50℃，pH值可为6.0-7.5，所述催化反应时间可为5-20小时。

所述多酶催化反应N为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为85-100g/L。所述多酶催化反应N的反应温度可为30-50℃。pH值可为6.0-7.5。所述同时进行催化的时间可为8-60小时。

上述方法中多酶催化反应为多酶催化反应L，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10g/L。所述淀粉磷酸化酶的浓度可为2U/mL。所述葡萄糖磷酸变位酶的浓度可为2U/mL。所述磷酸葡糖异构酶的浓度可为1U/mL。所述甘露醇1-磷酸脱氢酶的浓度可为1U/mL。所述甘露醇1-磷酸酶的浓度可为1U/mL。所述甲酸脱氢酶的浓度可为1U/mL。所述辅酶的浓度可为0.1mM。所述甲酸盐的浓度可为100mM。所述磷酸盐的浓度可为15mM。所述镁盐可为氯化镁，所述氯化镁的浓度可为10mM。所述多酶催化反应L的反应温度可为37℃，pH值可为7.4，所述同时进行催化的时间可为24小时。

或，

上述方法中多酶催化反应为所述多酶催化反应M，所述多酶催化反应M为分步进行催化，所述异淀粉酶的催化步骤中，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为300g/L。所述异淀粉酶的浓度可为1U/mL，所述镁盐可为氯化镁，所述氯化镁的浓度可为10mM。所述异淀粉酶催化反应的反应温度可为85℃，pH值可为5.5，所述催化反应的时间可为12小时。

所述多酶催化反应M为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10g/L。所述多酶催化反应M的反应温度可为37℃。pH值可为7.4。所述同时进行催化的时间可为48小时。

或，

上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应N，所述多酶催化反应N为分步进行催化，所述4-α-转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的催化步骤中，所述4-α-转葡糖苷酶的浓度可为1U/mL，所述聚磷酸葡萄糖激酶的浓度可为1U/mL，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠，所述六偏磷酸钠的浓度可为5mM。所述4-α-转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶催化反应的反应温度可为37℃，pH值可为7.4，所述催化反应的时间可为12小时。

所述多酶催化反应N为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10g/L。所述多酶催化反应N的反应温度可为37℃。pH值可为7.4。所述同时进行催化的时间可为48小时。

上述体外多酶催化反应制备甘露醇的方法可在生物反应器中进行，上述多酶催化反应M或N中加入异淀粉酶的反应步骤与多酶催化反应L可以分步进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行或在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行，也可以与所述多酶催化反应L同时进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行。

上述多酶催化反应N中所述4-α-转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶进行催化的反应可以与所述异淀粉酶的催化反应步骤和/或多酶催化反应L分步进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行或在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行，也可以同时进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行。

优选地，采用异淀粉酶催化反应的步骤在反应L之前进行。此时，优选地，在异淀粉酶催化的反应进行10-99℃反应0.1-72小时，进一步优选在30-95℃反应0.5-48小时，更优选在50-90℃反应1-24小时，最优选在85℃反应12小时后，在反应系统中添加组合物X。

优选地，采用4-α-转葡糖苷酶催化反应的步骤在将淀粉和/或淀粉的衍生物、磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸(G1P)的反应进行一段时间后进行。此时，优选地，在将淀粉和/或淀粉的衍生物、磷酸盐转化为G1P的反应进行0.5-30小时，优选5-20小时，最优选18小时后在反应体系中添加4-α-转葡糖苷酶。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备甘露醇的产品。所述产品为试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒含有上文所述的组合物。

上文所述的用于制备甘露醇的组合物也属于本发明的保护范围。

本发明的实施例中的酶催化反应采用如下方法：在一个反应体系中，以10g/L经异淀粉酶处理的可溶性淀粉为底物，加入10mM氯化镁、15mM磷酸二氢钠、100mM甲酸钠、200mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4)、0.1mM NAD⁺、2U/mL淀粉磷酸化酶、2U/mL葡萄糖磷酸变位酶、1U/mL磷酸葡糖异构酶、1U/mL甘露醇1-磷酸脱氢酶、1U/mL甘露醇1-磷酸酶、1U/mL甲酸脱氢酶，反应混合物在37℃下进行催化反应24h，得到甘露醇。优选地，在反应进行18h时向反应体系中还加入终浓度为1U/mL的4-α-转葡糖苷酶、终浓度为1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶和终浓度为5mM的六偏磷酸钠。最终得到的甘露醇的浓度为9.9g/L，产物收率为99％。

本发明首次使用体外多酶催化反应以淀粉、淀粉衍生物或其任意混合物为底物制备甘露醇。本发明的方法可以使用多种原料，并可以以接近理论值的收率获得目标产物。因此，本发明的方法具有原料廉价易得、生产成本低、底物转化率和产品收率高、环境友好等优点，适宜推广。加入异淀粉酶、4-α-转葡糖苷酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐可以极大地提高目标产物的收率。

附图说明

图1为编码来源于柔嫩艾美球虫的甘露醇1-磷酸酶的核苷酸优化前后序列比对结果。

图2为以淀粉为底物制备甘露醇的体外多酶催化途径的示意图。其中αGP为淀粉磷酸化酶，PGM为葡萄糖磷酸变位酶，PGI为磷酸葡糖异构酶，M1PDH为甘露醇1-磷酸脱氢酶，M1Pase为甘露醇1-磷酸酶，FDH为甲酸脱氢酶，P_i为无机磷。

图3为SDS-PAGE检测以淀粉为底物制备甘露醇的关键酶。M：Marker，αGP表示重组淀粉磷酸化酶his-EcαGP，PGM表示重组葡萄糖磷酸变位酶L-CtPGM，PGI表示重组磷酸葡糖异构酶L-CtPGI，M1PDH表示重组甘露醇1-磷酸脱氢酶EcM1PDH-his，M1Pase表示重组甘露醇1-磷酸酶his-EtM1Pase，FDH表示重组甲酸脱氢酶TsFDH-his。

图4为利用HPLC分析甘露醇标准品。其中3A为甘露醇标准品的HPLC峰图；其中3B为甘露醇标准品的浓度与HPLC峰高的线性关系图，通过甘露醇峰的强度可以对所得到的甘露醇的浓度进行定量。

图5为利用体外多酶体系催化可溶性淀粉合成甘露醇。其中4A为体外多催化可溶性淀粉生成甘露醇的高效液相色谱(HPLC)分析结果；其中4B为体外多酶催化可溶性淀粉合成甘露醇的反应进程曲线。

图6为体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇的反应进程曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中使用的部分材料信息如下：

可溶性淀粉：ACROS公司产品，产品编号：424490020；

pET20b(+)和pET28a(+)载体：Novagen，Madison，WI USA；

pTWIN1载体：New England Biolabs,Ipswich,MA USA；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)：Invitrogen，Carlsbad，CA USA；

实施例1：甘露醇的酶法合成途径中的酶活测定

通过体外多酶催化体系将淀粉转化为甘露醇的催化途径见图2。在本实施例中，(1)淀粉磷酸化酶(α-glucan phosphorylase,EC 2.4.1.1,αGP)来源于大肠杆菌(Escherichia coli，UniProt编号P00490)；(2)葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase,EC 5.4.2.2,PGM)来源于热纤梭菌(Clostridiumthermocellum，UniProt编号A3DEW8)；(3)磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase,EC 5.3.1.9,PGI)来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum，UniProt编号A3DBX9)；(4)甘露醇1-磷酸脱氢酶(mannitol1-phosphate 5-dehydrogenase,EC 1.1.1.17,M1PDH)来源于大肠杆菌(Escherichiacoli，UniProt编号P09424)；(5)甘露醇1-磷酸酶(mannitol 1-phosphatase,EC 3.1.3.22,M1Pase)来源于柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella，UniProt编号O43980)；(6)甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，EC 1.17.1.9或EC 1.17.1.10，FDH)来源于硫杆菌(Thiobacillus sp.，UniProt编号Q76EB7)。除甘露醇1-磷酸酶的基因之外，上述其他5种酶的基因的DNA序列都可从UniProt的官方网站(https://www.uniprot.org/)上获得。经密码子优化获得的甘露醇1-磷酸酶的基因(核苷酸序列如序列表中序列11的第103-1032位DNA分子所示)的合成委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。如图1所示，优化前(图1中SEQID NO.2所示)与优化后(图1中SEQ ID NO.1所示)的序列相比有22.0％的核苷酸序列不同。通过Simple Cloning(You et al.2012.Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法，将上述来源于大肠杆菌的甘露醇1-磷酸脱氢酶基因、来源于柔嫩艾美球虫的甘露醇1-磷酸酶基因分别克隆至pET28a(+)载体(Novagen，Madison，WI)中，分别获得相应的表达载体pET28a-EcM1PDH、pET28a-EtM1Pase。利用同样的Simple Cloning的方法，将来源于硫杆菌的甲酸脱氢酶的基因克隆至pET20b(+)载体(Novagen，Madison，WI)中，获得相应的表达载体pET20b-TsFDH。按照文献(Wei XL et al.2018.ChemCatChem 10(24):5597-5601.)所述，通过Simple Cloning的方法，将上述来源于大肠杆菌的淀粉磷酸化酶基因克隆至pET28a(+)载体中，获得相应的表达载体pET28a-EcαGP。按照文献(Hong et al.2008.JChromatogr A 1194:150-154.)所述，利用PCR分别扩增来源于Clostridium thermocellum的纤维素结合模块(cellulose-binding module，CBM)基因片段、来源于Synechocystissp.的DnaB内含肽(intein)基因片段、来源于Clostridium thermocellum的PGM的基因片段，并使用DNA连接酶将上述三个片段同时连接至pTWIN1载体(New England Biolabs,Ipswich,MA)，获得相应的表达载体pTWIN1-CI-CtPGM。按照文献(Myung etal.2011.Biotechnol.Prog.27(4):969-975.)所述，利用PCR扩增来源于Clostridiumthermocellum的PGI的基因片段，得到含有CtPGI基因的PCR扩增片段，利用上述含有CtPGI基因的PCR扩增片段替代构建pTWIN1-CI-CtPGM时所用的CtPGM基因片段，使用DNA连接酶将CBM、intein、CtPGI三个片段同时连接至pTWIN1载体(New England Biolabs,Ipswich,MA)，获得相应的表达载体pTWIN1-CI-CtPGI。

将pET28a-EcαGP、pTWIN1-CI-CtPGM、pTWIN1-CI-CtPGI、pET28a-EcM1PDH、pET28a-EtM1Pase、pET20b-TsFDH分别单独转入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中。将含有pET28a-EcαGP的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-EcαGP，BL21(DE3)/pET28a-EcαGP能表达序列表中序列1所示的蛋白质—重组淀粉磷酸化酶his-EcαGP；将含有pTWIN1-CI-CtPGM的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pTWIN1-CI-CtPGM，BL21(DE3)/pTWIN1-CI-CtPGM能表达序列表中序列2所示的蛋白质—重组葡萄糖磷酸变位酶CBM-intein-CtPGM；将含有pTWIN1-CI-CtPGI的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pTWIN1-CI-CtPGI，BL21(DE3)/pTWIN1-CI-CtPGI能表达序列表中序列3所示的蛋白质—重组磷酸葡糖异构酶CBM-intein-CtPGI；将含有pET28a-EcM1PDH的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-EcM1PDH，BL21(DE3)/pET28a-EcM1PDH能表达序列表中序列4所示的蛋白质—重组甘露醇1-磷酸脱氢酶EcM1PDH-his，编码EcM1PDH-his的核苷酸序列如序列表中序列10所示；将含有pET28a-EtM1Pase的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-EtM1Pase，BL21(DE3)/pET28a-EtM1Pase能表达序列表中序列5所示的蛋白质—重组甘露醇1-磷酸酶his-EtM1Pase，编码his-EtM1Pase的核苷酸序列如序列表中序列11所示；将含有pET20b-TsFDH的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET20b-TsFDH，BL21(DE3)/pET20b-TsFDH能表达序列表中序列6所示的蛋白质—重组甲酸脱氢酶TsFDH-his，编码TsFDH-his的核苷酸序列如序列表中序列12所示。

将BL21(DE3)/pET28a-EcαGP、BL21(DE3)/pET28a-EcM1PDH、BL21(DE3)/pET28a-EtM1Pase这3个菌株分别单独接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/mL得到的培养基)中，将BL21(DE3)/pTWIN1-CI-CtPGM、BL21(DE3)/pTWIN1-CI-CtPGI、BL21(DE3)/pET20b-TsFDH这3个菌株分别单独姐终于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入氨苄青霉素至氨苄青霉素的浓度为100μg/mL得到的培养基)中，37℃，220rpm振荡培养至0D₆₀₀值(以含50μg/mL卡那霉素或含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，分别得到诱导表达的菌液。上述6株菌的诱导表达均是用0.1mM的IPTG在18℃诱导16-18小时。将上述诱导表达的菌液于4℃，6000rpm离心10min，收集菌体。

制备含有his标签的重组淀粉磷酸化酶his-EcαGP、重组甘露醇1-磷酸脱氢酶EcM1PDH-his、重组甘露醇1-磷酸酶his-EtM1Pase、重组甲酸脱氢酶TsFDH-his的方法如下：向菌体中加入20mL预冷的裂解缓冲液A(含50mM磷酸钠，250mM NaCl，pH 7.4)，重悬菌体，随后进行超声破碎(超声5s，间隔5s，总超声时间10min，功率300W)，超声结束后，4℃，10000rpm离心10min，收集上清液。上清液为含目的蛋白质的上清液。取4mL Ni-beads到柱子中，然后用预冷的裂解缓冲液A洗三遍，加入上述含目的蛋白质的上清液，将结合目的蛋白质的Ni-beads用Wash buffer 1(溶质及其浓度如下：50mM NaH₂PO₄、250mM NaCl、25mM咪唑，溶剂是水，pH 7.4的溶液)洗2次，5mL/次，用离心管收集Wash buffer1洗液，Washbuffer 2(溶质及其浓度如下：50mM NaH₂PO₄、250mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH 7.4的溶液)洗2次，4mL/次，收集Wash buffer 2洗液。随后用Elution buffer(溶质及其浓度如下：50mM NaH₂PO₄、250mM NaCl、500mM咪唑，溶剂是水，pH 7.4的溶液)洗脱目的蛋白2次，4mL/次，收集两次洗脱出的液体，得到含目的蛋白质的液体(含重组淀粉磷酸化酶his-EcαGP的液体、含重组甘露醇1-磷酸脱氢酶EcM1PDH-his的液体、含重组甘露醇1-磷酸酶his-EtM1Pase的液体、含重组甲酸脱氢酶TsFDH-his的液体)。

制备重组葡萄糖磷酸变位酶L-CtPGM(L-CtPGM是CBM-intein-CtPGM去掉了CBM和intein标签的重组葡萄糖磷酸变位酶)、重组磷酸葡糖异构酶L-CtPGI(L-CtPGI是CBM-intein-CtPGI去掉了CBM和intein标签的重组磷酸葡糖异构酶)的方法如下：按照文献(Zhang et al.2006.Biomacromolecules 7(2):644-8.)所述方法制备再生无定型纤维素。向菌体中加入20mL预冷的裂解缓冲液B(含30mM Tris-HCl，1mMβ-巯基乙醇，1mM EDTA，pH8.5)，重悬菌体，随后进行超声破碎(超声5s，间隔5s，总超声时间10min，功率300W)，超声结束后，4℃，10000rpm离心10min，收集上清液。上清液为含目的蛋白质的上清液。将按照上述方法所得的再生无定型纤维素5mL与20mL含目的蛋白质的细胞破碎上清液混合，室温孵育30min，4℃8000rpm离心，所得沉淀为与CBM-intein-CtPGM、CBM-intein-CtPGI结合的再生无定型纤维素。使用20mL裂解缓冲液洗涤沉淀1次，4℃8000rpm离心获得沉淀，再使用intein切割缓冲液(含50mM HEPES，0.5M NaCl，0.1mM EDTA，pH 6.5)洗涤沉淀两次，每次20mL，4℃8000rpm离心获得沉淀，向所得沉淀加入10mL intein切割缓冲液，40℃水浴孵育8小时，4℃12000rpm离心，收集上清液，所得上清液为含有重组目的蛋白L-CtPGM或L-CtPGI的溶液。

取少量上述方法制备的目的蛋白质的液体加入蛋白裂解液煮样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后用考马斯亮蓝染色检测蛋白纯化效果(图3)。结果表明得到了大小为92.7kDa的重组淀粉磷酸化酶his-EcαGP(图3中αGP)，大小为65kDa的重组葡萄糖磷酸变位酶L-CtPGM(图3中PGM)，大小为51.5kDa的重组磷酸葡糖异构酶L-CtPGI(图3中PGI)，大小为42.2kDa的重组甘露醇1-磷酸脱氢酶EcM1PDH-his(图3中M1PDH)，大小为38.3kDa的重组甘露醇1-磷酸酶his-EtM1Pase(图3中M1Pase)，大小为45.1kDa的重组甲酸脱氢酶TsFDH-his(图3中FDH)。

重组葡萄糖磷酸变位酶(L-CtPGM)的酶活测定在含有10mM氯化镁的200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，溶质是10mM氯化镁，溶剂是200mM Tris-HCl缓冲液)中进行。以10mM葡萄糖1-磷酸(G1P)为底物，在37℃下反应10min，测定产生的葡萄糖6-磷酸(G6P)的量。G6P的定量检测方法如下：取40μL含有G6P的样品溶液，添加200μL含有2mM氯化镁、0.15mM NAD⁺、0.5U/mL葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)的200mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4，溶质是2mM氯化镁、0.15mM NAD⁺、0.5U/mL G6PDH，溶剂为200mMTris-HCl缓冲液)，37℃反应30分钟，测定340nm处的吸光度，计算产生的NADH的量。实验结果显示，纯化后的重组葡萄糖磷酸变位酶在37℃下的比酶活为44.6U/mg。其中，酶活力单位(U)定义为：在上述条件(37℃pH 7.4)下，在1min内产生1μmol G6P的酶量。

重组淀粉磷酸化酶his-EcαGP的酶活测定在含有10mM氯化镁、15mM磷酸二氢钠、1U/mL葡萄糖磷酸变位酶的200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中进行。以10g/L可溶性淀粉为底物，在37℃下反应10min，将重组淀粉磷酸化酶产生的葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)，测定产生的G6P的量。实验结果显示，纯化后的重组淀粉磷酸化酶在37℃下的比酶活为1.0U/mg。其中，酶活力单位(U)定义为：在上述条件(37℃pH 7.4)下，在1min内产生1μmol G1P的酶量。

重组磷酸葡糖异构酶(L-CtPGI)的酶活测定在含有10mM氯化镁的200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中进行。以10mM果糖6-磷酸(F6P)为底物，在37℃下反应10min，测定产生的葡萄糖6-磷酸(G6P)的量。实验结果显示，纯化后的重组磷酸葡糖异构酶在37℃下的比酶活为884.7U/mg。其中，酶活力单位(U)定义为：在上述条件(37℃pH 7.4)下，在1min内产生1μmol G6P的酶量。

重组甘露醇1-磷酸脱氢酶(M1PDH-his)的酶活测定在含有10mM氯化镁的200mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4)中进行。以10mM果糖6-磷酸(F6P)和0.15mM NADH为底物，在37℃下反应10min，测定消耗的NADH的量。实验结果显示，大肠杆菌来源的甘露醇1-磷酸脱氢酶在37℃下的比酶活为387.4U/mg。其中，酶活力单位(U)定义为：在上述条件(37℃pH 7.4)下，在1min内产生1μmol NAD+的酶量。

重组甘露醇1-磷酸酶(his-M1Pase)的酶活测定在含有10mM氯化镁、1U/mL甘露醇1-磷酸脱氢酶的200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中进行。以10mM果糖6-磷酸(F6P)和1mMNADH为底物，在37℃下反应10min，通过文献中无机磷酸根的检测方法(Saheki etal.1985.Anal.Biochem.148(2):277-81.)，测定产生的无机磷酸根的量。实验结果显示，柔嫩艾美球虫来源的甘露醇1-磷酸酶在37℃下的比酶活为58.9U/mg。其中，酶活力单位(U)定义为：在上述条件(37℃pH 7.4)下，在1min内产生1μmol无机磷酸根的酶量。

重组甲酸脱氢酶(FDH-his)的酶活测定在含有10mM氯化镁的200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中进行。以10mM甲酸和1mM NAD⁺为底物，在37℃下反应10min，测定产生的NADH的量。实验结果显示，硫杆菌来源的甲酸脱氢酶在37℃下的比酶活为9.2U/mg。其中，酶活力单位(U)定义为：在上述条件(37℃pH 7.4)下，在1min内产生1μmol NADH的酶量。

实施例2：体外多酶催化可溶性淀粉合成甘露醇

本实施例采用酶在体外催化可溶性淀粉合成甘露醇。首先重组表达了六种酶(实施例1)：来源于大肠杆菌的αGP、来源于热纤梭菌的PGM、来源于热纤梭菌的PGI、来源于大肠杆菌的M1PDH、来源于柔嫩艾美球虫的M1Pase、来源于硫杆菌的FDH。

采用高效液相色谱法(HPLC)定量分析甘露醇。所用色谱柱为Bio-Rad AminexHPX-87H，流动相为5mM硫酸，流速0.6mL/min，柱温60℃，所用检测器为示差折光检测器。标准样品检测如图4中A所示，甘露醇保留时间约为10.0分钟。甘露醇浓度与甘露醇的HPLC特征峰的响应强度成正比，标准曲线如图4中B所示。

将含有10g/L可溶性淀粉、10mM氯化镁、15mM磷酸二氢钠、100mM甲酸钠、0.1mM NAD⁺、200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、2U/mLαGP、2U/mL PGM、1U/mL PGI、1U/mL M1PDH、1U/mLM1Pase、1U/mL FDH，其余为水的1mL反应混合物在37℃下反应24h。反应结束后，取样77μL，添加50μL的2M高氯酸溶液终止反应，之后添加20μL的5M氢氧化钾中和反应液，13800x g离心5min，取上清液通过高效液相色谱法测定反应溶液中的甘露醇的浓度(图5中A)。反应进行24h时，上清液中，甘露醇的浓度为4.9g/L，产物收率为49％(图5中B)。

产物收率的计算公式如下：

实施例3体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇

淀粉为经α-1,4和α-1,6糖苷键混合连接的多糖，不能被淀粉磷酸化酶完全磷酸解。异淀粉酶(IA，EC 3.2.1.68)能够水解淀粉中的α-1,6糖苷键，从而帮助淀粉磷酸化酶磷酸解底物，提高甘露醇的得率。

在本实施例中，异淀粉酶来源于来源于头寇岱硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii，UniProt编号Q973H3)。将文献(Cheng et al.2015.Scientific Reports 5:13184.)报道的表达载体pET20b-StIA导入大肠杆菌BL21(DE3),得到含有pET20b-StIA的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-StIA，BL21(DE3)/pET20b-StIA能表达序列表中序列7所示的重组异淀粉酶StIA-his。按照实施例1的方法进行重组异淀粉酶StIA-his的蛋白质表达。按照实施例1中制备含有his标签的重组酶的方法进行StIA-his的纯化。

将含有300g/L可溶性淀粉、5mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)、0.5mM氯化镁和1U/mL异淀粉酶，其余为水的1mL反应混合物，在85℃处理12个小时，得到的液体为300g/L经异淀粉酶处理的可溶性淀粉溶液。其中，酶活力单位(U)定义为：80℃,pH 5.5的条件下，在1min内能够产生1μmol淀粉还原端的酶量。

将含有10g/L经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、10mM氯化镁、15mM磷酸二氢钠、100mM甲酸钠、0.1mM NAD⁺、200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、2U/mLαGP、2U/mL PGM、1U/mL PGI、1U/mL M1PDH、1U/mL M1Pase、1U/mL FDH，其余为水的1mL反应混合物在37℃下孵育24h。不同时间取样77μL用以检测生成的甘露醇浓度，通过添加50μL的2M高氯酸溶液终止反应，之后添加20μL的5M氢氧化钾中和反应液，13800x g离心5min，取上清液通过高效液相色谱法测定甘露醇的浓度(同实施例2)。实验结果表明，体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇的反应进行24h时，上清液中，甘露醇的浓度为6.6g/L，产物收率为66％(图6中实线所示)，添加异淀粉酶可有效提高体外多酶催化可溶性淀粉合成甘露醇的产物收率。

实施例4通过添加4-α-转葡糖苷酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐，提高合成甘露醇的产物收率

淀粉磷酸化酶将异淀粉酶处理的可溶性淀粉磷酸解，最终剩余的底物为麦芽三糖和麦芽糖。4-α-转葡糖苷酶(4GT，EC 2.4.1.25)能够通过转糖基作用将短链麦芽寡糖的糖链进行延长，进一步被淀粉磷酸化酶利用，进而转化为甘露醇，提高产物得率。4-α-转葡糖苷酶在转糖基过程中产生较长链的麦芽寡糖和葡萄糖。聚磷酸葡萄糖激酶(PPGK，EC2.7.1.63)能够利用聚磷酸盐，将包含D-葡萄糖单元的二糖、多糖或其任意混合物发生转糖基反应后产生的葡萄糖磷酸化为G6P，进一步被磷酸葡糖异构酶利用，进而转化为甘露醇，提高产物得率。

在本实施例中，4-α-转葡糖苷酶来源于海岸热球菌(Thermococcus litoralis，UniProt编号O32462)。将文献(Zhou et al.2016.J.Agric.Food Chem.64(8):1777-83.)报道的表达载体P20b-Ti4GF-CO导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有P20b-Ti4GF-CO的重组大肠杆菌BL21(DE3)/P20b-Ti4GF-CO，BL21(DE3)/P20b-Ti4GF-CO能表达序列表中序列8所示的重组4-α-转葡糖苷酶Tl4GT-his。按照实施例1的方法进行重组4-α-转葡糖苷酶Tl4GT-his的蛋白质表达。按照实施例1中制备含有his标签的重组酶的方法进行Tl4GT-his的纯化。

在本实施例中，聚磷酸葡萄糖激酶来源于嗜热子囊菌(Thermobifida fusca，UniProt编号Q47NX5)。将文献(Zhou et al.2018.Appl.Environ.Microbiol.84(16):e01224-18.)报道的含有五个突变位点的ppgk基因(文献中为突变体4-1)的重组表达载体pET28a-P_tac-ppgk导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有pET28a-P_tac-ppgk的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-P_tac-ppgk，BL21(DE3)/pET28a-P_tac-ppgk能表达序列表中序列9所示的重组聚磷酸葡萄糖激酶TfuPPGK-his。按照实施例1的方法进行重组聚磷酸葡萄糖激酶TfuPPGK-his的蛋白质表达。按照实施例1中制备含有his标签的重组酶的方法进行TfuPPGK-his的纯化。

将含有实施例3中的10g/L经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、10mM氯化镁、15mM磷酸二氢钠、100mM甲酸钠、0.1mM NAD⁺、200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、2U/mLαGP、2U/mLPGM、1U/mL PGI、1U/mL M1PDH、1U/mL M1Pase、1U/mL FDH，其余为水的1mL反应混合物在37℃下孵育18h。然后向体系中加入4GT、PPGK和六偏磷酸钠，使4GT的含量为1U/mL、PPGK的含量为1U/mL和六偏磷酸钠的含量为5mM，37℃继续反应至30h。其中，4GT酶活力单位(U)定义为：37℃,pH 7.4的条件下，在1min内能够产生1μmol葡萄糖的酶量，PPGK酶活力单位(U)定义为：37℃,pH 7.4的条件下，在1min内能够产生1μmol G6P的酶量。不同时间取样77μL用以测定合成甘露醇的浓度，通过添加50μL的2M高氯酸终止反应，之后添加20μL的5M氢氧化钾中和反应液，13800x g离心5min，取上清液通过高效液相色谱法测定甘露醇的浓度。实验结果表明，通过添加4GT和PPGK到甘露醇的合成反应体系中，反应进行30h时，上清液中甘露醇的浓度为9.9g/L，产物收率为99％(图6中虚线所示)，体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇的产物收率显著提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种甘露醇的生物制备方法

<130> GNCSQ210205

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 817

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ser Gln Pro Ile Phe Asn Asp Lys Gln Phe Gln

20 25 30

Glu Ala Leu Ser Arg Gln Trp Gln Arg Tyr Gly Leu Asn Ser Ala Ala

35 40 45

Glu Met Thr Pro Arg Gln Trp Trp Leu Ala Val Ser Glu Ala Leu Ala

50 55 60

Glu Met Leu Arg Ala Gln Pro Phe Ala Lys Pro Val Ala Asn Gln Arg

65 70 75 80

His Val Asn Tyr Ile Ser Met Glu Phe Leu Ile Gly Arg Leu Thr Gly

85 90 95

Asn Asn Leu Leu Asn Leu Gly Trp Tyr Gln Asp Val Gln Asp Ser Leu

100 105 110

Lys Ala Tyr Asp Ile Asn Leu Thr Asp Leu Leu Glu Glu Glu Ile Asp

115 120 125

Pro Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ala Cys Phe Leu

130 135 140

Asp Ser Met Ala Thr Val Gly Gln Ser Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Asn

145 150 155 160

Tyr Gln Tyr Gly Leu Phe Arg Gln Ser Phe Val Asp Gly Lys Gln Val

165 170 175

Glu Ala Pro Asp Asp Trp His Arg Ser Asn Tyr Pro Trp Phe Arg His

180 185 190

Asn Glu Ala Leu Asp Val Gln Val Gly Ile Gly Gly Lys Val Thr Lys

195 200 205

Asp Gly Arg Trp Glu Pro Glu Phe Thr Ile Thr Gly Gln Ala Trp Asp

210 215 220

Leu Pro Val Val Gly Tyr Arg Asn Gly Val Ala Gln Pro Leu Arg Leu

225 230 235 240

Trp Gln Ala Thr His Ala His Pro Phe Asp Leu Thr Lys Phe Asn Asp

245 250 255

Gly Asp Phe Leu Arg Ala Glu Gln Gln Gly Ile Asn Ala Glu Lys Leu

260 265 270

Thr Lys Val Leu Tyr Pro Asn Asp Asn His Thr Ala Gly Lys Lys Leu

275 280 285

Arg Leu Met Gln Gln Tyr Phe Gln Cys Ala Cys Ser Val Ala Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Arg Pro His Leu Ala Gly Arg Lys Leu His Glu Leu Ala Asp

305 310 315 320

Tyr Glu Val Ile Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Ile Ala Ile Pro

325 330 335

Glu Leu Leu Arg Val Leu Ile Asp Glu His Gln Met Ser Trp Asp Asp

340 345 350

Ala Trp Ala Ile Thr Ser Lys Thr Phe Ala Tyr Thr Asn His Thr Leu

355 360 365

Met Pro Glu Ala Leu Glu Arg Trp Asp Val Lys Leu Val Lys Gly Leu

370 375 380

Leu Pro Arg His Met Gln Ile Ile Asn Glu Ile Asn Thr Arg Phe Lys

385 390 395 400

Thr Leu Val Glu Lys Thr Trp Pro Gly Asp Glu Lys Val Trp Ala Lys

405 410 415

Leu Ala Val Val His Asp Lys Gln Val His Met Ala Asn Leu Cys Val

420 425 430

Val Gly Gly Phe Ala Val Asn Gly Val Ala Ala Leu His Ser Asp Leu

435 440 445

Val Val Lys Asp Leu Phe Pro Glu Tyr His Gln Leu Trp Pro Asn Lys

450 455 460

Phe His Asn Val Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Lys Gln

465 470 475 480

Cys Asn Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Asp Lys Ser Leu Gln Lys Glu

485 490 495

Trp Ala Asn Asp Leu Asp Gln Leu Ile Asn Leu Glu Lys Phe Ala Asp

500 505 510

Asp Ala Lys Phe Arg Gln Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Gln Ala Asn Lys

515 520 525

Val Arg Leu Ala Glu Phe Val Lys Val Arg Thr Gly Ile Glu Ile Asn

530 535 540

Pro Gln Ala Ile Phe Asp Ile Gln Ile Lys Arg Leu His Glu Tyr Lys

545 550 555 560

Arg Gln His Leu Asn Leu Leu His Ile Leu Ala Leu Tyr Lys Glu Ile

565 570 575

Arg Glu Asn Pro Gln Ala Asp Arg Val Pro Arg Val Phe Leu Phe Gly

580 585 590

Ala Lys Ala Ala Pro Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Asn Ile Ile Phe Ala

595 600 605

Ile Asn Lys Val Ala Asp Val Ile Asn Asn Asp Pro Leu Val Gly Asp

610 615 620

Lys Leu Lys Val Val Phe Leu Pro Asp Tyr Cys Val Ser Ala Ala Glu

625 630 635 640

Lys Leu Ile Pro Ala Ala Asp Ile Ser Glu Gln Ile Ser Thr Ala Gly

645 650 655

Lys Glu Ala Ser Gly Thr Gly Asn Met Lys Leu Ala Leu Asn Gly Ala

660 665 670

Leu Thr Val Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Ala Glu Lys

675 680 685

Val Gly Glu Glu Asn Ile Phe Ile Phe Gly His Thr Val Glu Gln Val

690 695 700

Lys Ala Ile Leu Ala Lys Gly Tyr Asp Pro Val Lys Trp Arg Lys Lys

705 710 715 720

Asp Lys Val Leu Asp Ala Val Leu Lys Glu Leu Glu Ser Gly Lys Tyr

725 730 735

Ser Asp Gly Asp Lys His Ala Phe Asp Gln Met Leu His Ser Ile Gly

740 745 750

Lys Gln Gly Gly Asp Pro Tyr Leu Val Met Ala Asp Phe Ala Ala Tyr

755 760 765

Val Glu Ala Gln Lys Gln Val Asp Val Leu Tyr Arg Asp Gln Glu Ala

770 775 780

Trp Thr Arg Ala Ala Ile Leu Asn Thr Ala Arg Cys Gly Met Phe Ser

785 790 795 800

Ser Asp Arg Ser Ile Arg Asp Tyr Gln Ala Arg Ile Trp Gln Ala Lys

805 810 815

Arg

<210> 2

<211> 921

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Met Pro Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro

1 5 10 15

Ser Asp Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr

20 25 30

Gly Ser Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr

35 40 45

Thr Val Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala

50 55 60

Ile Ile Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr

85 90 95

Leu Glu Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val

100 105 110

Gln Ile Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln

115 120 125

Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp

130 135 140

Gln Val Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro

145 150 155 160

Arg Pro Asn Asn Gly Asn Asn Gly Leu Glu Leu Arg Glu Ser Gly Ala

165 170 175

Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg Val

180 185 190

Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp Glu Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala Ile

195 200 205

Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu Glu Ser Ala Lys Val Ser Arg Val Phe

210 215 220

Cys Thr Gly Lys Lys Leu Val Tyr Ile Leu Lys Thr Arg Leu Gly Arg

225 230 235 240

Thr Ile Lys Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly Trp

245 250 255

Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser Leu Lys Glu His Ile Ala Leu Pro Arg

260 265 270

Lys Leu Glu Ser Ser Ser Leu Gln Leu Ser Pro Glu Ile Glu Lys Leu

275 280 285

Ser Gln Ser Asp Ile Tyr Trp Asp Ser Ile Val Ser Ile Thr Glu Thr

290 295 300

Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro His Asn Phe

305 310 315 320

Val Ala Asn Asp Ile Ile Val His Asn Gly Arg Ala Met Gly Gly Arg

325 330 335

Glu Phe Leu Glu Gly Ser Ser Met Arg Ser Ser Ala Leu Tyr Lys Phe

340 345 350

Trp Val Glu Asn Asp Tyr Phe Asp Ala Glu Thr Lys Lys Glu Leu Leu

355 360 365

Ser Ile Lys Asp Asn Pro Lys Glu Ile Glu Glu Arg Phe Tyr Lys Asp

370 375 380

Leu Glu Phe Gly Thr Gly Gly Leu Arg Gly Ile Ile Gly Ala Gly Thr

385 390 395 400

Asn Arg Ile Asn Ile Tyr Thr Val Arg Lys Ala Ser Gln Gly Leu Ala

405 410 415

Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Gly Leu Gln Asp Arg Gly Ile Ala Ile Ala

420 425 430

Tyr Asp Ser Arg Tyr Lys Ser Pro Glu Phe Ala Leu Glu Ala Ala Lys

435 440 445

Val Phe Ala Gly Asn Gly Ile Lys Ala Phe Leu Phe Asp Glu Leu Arg

450 455 460

Pro Thr Pro Glu Leu Ser Phe Thr Val Arg His Leu Asn Ala Ala Ala

465 470 475 480

Gly Val Val Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Lys Glu Tyr Asn Gly Tyr

485 490 495

Lys Val Tyr Gly Glu Asp Gly Gly Gln Leu Pro Val Glu Ala Ser Asn

500 505 510

Lys Val Ile Ser Tyr Ile Asn Lys Ile Glu Asp Ile Thr Gln Val Lys

515 520 525

Val Met Glu Lys Asp Glu Ala Ile Glu Lys Gly Leu Leu Arg Ile Ile

530 535 540

Gly Lys Glu Ile Asp Asp Glu Tyr Ile Ser Lys Leu Lys Thr Leu Ser

545 550 555 560

Ala Asn Pro Glu Leu Ala Ala Glu Ile Gly Lys Thr Phe Lys Ile Val

565 570 575

Tyr Thr Pro Leu His Gly Ala Gly Asn Lys Pro Val Arg Arg Ile Leu

580 585 590

Asp Glu Ile Gly Phe Lys Asn Val Leu Val Val Lys Glu Gln Glu Leu

595 600 605

Pro Asp Ser Glu Phe Ser Thr Val Lys Ser Pro Asn Pro Glu Glu Arg

610 615 620

Glu Ala Phe Glu Leu Ala Ile Glu Leu Ala Lys Lys Glu Asn Val Asp

625 630 635 640

Leu Ile Ile Gly Thr Asp Pro Asp Cys Asp Arg Val Gly Ile Val Val

645 650 655

Arg Asn Lys Glu Gly Glu Tyr Val Pro Leu Thr Gly Asn Gln Thr Gly

660 665 670

Cys Leu Leu Leu Glu Tyr Ile Leu Ser Gln Lys Lys Gln Arg Gly Glu

675 680 685

Leu Pro Glu Asn Gly Phe Val Val Lys Thr Ile Val Thr Thr Glu Leu

690 695 700

Ala Arg Ala Ile Thr Asp Ala Tyr Asn Val Glu Leu Val Glu Val Leu

705 710 715 720

Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly Glu Lys Ile Lys Gln Leu Asp Glu Phe

725 730 735

Gly Asp Lys Lys Tyr Leu Phe Gly Phe Glu Glu Ser Tyr Gly Tyr Leu

740 745 750

Ala Gly Thr Phe Ala Arg Asp Lys Asp Ala Val Val Ala Ser Met Leu

755 760 765

Ile Ala Glu Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Ser Arg Gly Leu Thr Leu Tyr

770 775 780

Glu Gly Leu Met Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Gly Tyr Thr Leu Glu Gly

785 790 795 800

Ile Thr Ser Phe Thr Leu Lys Gly Lys Asp Gly Val Glu Lys Ile Lys

805 810 815

Ser Ala Met Lys Asn Leu Arg Glu Asn Arg Val Val Lys Phe Gly Glu

820 825 830

Tyr Glu Ala Val Ala Val Arg Asp Tyr Leu Thr Ser Glu Arg Tyr Glu

835 840 845

Val Ala Thr Gly Ala Lys Glu Lys Leu Thr Leu Val Glu Ser Asp Val

850 855 860

Leu Tyr Tyr Glu Leu Lys Asp Lys Ala Trp Phe Cys Ile Arg Pro Ser

865 870 875 880

Gly Thr Glu Pro Lys Ile Lys Ile Tyr Tyr Gly Val Thr Glu Lys Ser

885 890 895

Met Asp Ala Ala Lys Glu Lys Leu Lys His Leu Gln Asp Asn Val Leu

900 905 910

Ser Val Ile Glu Pro Leu Leu Lys Asp

915 920

<210> 3

<211> 788

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

Met Pro Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro

1 5 10 15

Ser Asp Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr

20 25 30

Gly Ser Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr

35 40 45

Thr Val Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala

50 55 60

Ile Ile Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr

85 90 95

Leu Glu Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val

100 105 110

Gln Ile Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln

115 120 125

Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp

130 135 140

Gln Val Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro

145 150 155 160

Arg Pro Asn Asn Gly Asn Asn Gly Leu Glu Leu Arg Glu Ser Gly Ala

165 170 175

Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg Val

180 185 190

Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp Glu Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala Ile

195 200 205

Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu Glu Ser Ala Lys Val Ser Arg Val Phe

210 215 220

Cys Thr Gly Lys Lys Leu Val Tyr Ile Leu Lys Thr Arg Leu Gly Arg

225 230 235 240

Thr Ile Lys Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly Trp

245 250 255

Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser Leu Lys Glu His Ile Ala Leu Pro Arg

260 265 270

Lys Leu Glu Ser Ser Ser Leu Gln Leu Ser Pro Glu Ile Glu Lys Leu

275 280 285

Ser Gln Ser Asp Ile Tyr Trp Asp Ser Ile Val Ser Ile Thr Glu Thr

290 295 300

Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro His Asn Phe

305 310 315 320

Val Ala Asn Asp Ile Ile Val His Asn Gly Arg Ala Met Gly Gly Arg

325 330 335

Glu Phe Leu Glu Met Glu Arg Ile Lys Phe Asp Tyr Ser Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Phe Val Ser Glu Arg Glu Val Ala Tyr Phe Glu Asn Phe Val Arg

355 360 365

Ser Ala His Asp Met Leu His Asn Lys Thr Gly Ala Gly Asn Asp Phe

370 375 380

Val Gly Trp Val Asp Leu Pro Val Asn Tyr Asp Arg Glu Glu Phe Ala

385 390 395 400

Arg Ile Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ile Lys Ser Asp Ser Asp Ala Leu

405 410 415

Val Val Ile Gly Ile Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala Arg Ala Ala Ile

420 425 430

Glu Met Leu Ser His Ser Phe His Asn Leu Met Pro Lys Ser Lys Arg

435 440 445

Asn Ala Pro Glu Ile Tyr Phe Val Gly Asn Asn Ile Ser Ser Thr Tyr

450 455 460

Ile Ala Asp Leu Leu Glu Val Ile Glu Gly Lys Glu Ile Ser Val Asn

465 470 475 480

Val Ile Ser Lys Ser Gly Thr Thr Thr Glu Pro Ala Ile Ala Phe Arg

485 490 495

Ile Phe Lys Glu Tyr Met Glu Asn Lys Tyr Gly Lys Asp Gly Ala Ser

500 505 510

Lys Arg Ile Tyr Ala Thr Thr Asp Lys Glu Lys Gly Ala Leu Arg Lys

515 520 525

Leu Ala Thr Glu Glu Gly Tyr Glu Thr Phe Val Val Pro Asp Asp Ile

530 535 540

Gly Gly Arg Phe Ser Val Leu Thr Ala Val Gly Leu Leu Pro Ile Ala

545 550 555 560

Val Ala Gly Ile Asp Ile Asp Ser Met Met Lys Gly Ala Ala Asp Ala

565 570 575

Arg Glu Leu Tyr Ser Asn Pro Asn Leu Met Glu Asn Asp Cys Tyr Lys

580 585 590

Tyr Ala Ala Val Arg Asn Ala Leu Tyr Arg Lys Asn Lys Thr Ile Glu

595 600 605

Ile Met Val Asn Tyr Glu Pro Ser Leu His Tyr Phe Thr Glu Trp Trp

610 615 620

Lys Gln Leu Tyr Gly Glu Ser Glu Gly Lys Asp Gln Lys Gly Ile Phe

625 630 635 640

Pro Ala Gly Val Asp Phe Thr Thr Asp Leu His Ser Met Gly Gln Tyr

645 650 655

Ile Gln Asp Gly Leu Arg Asn Ile Phe Glu Thr Val Ile Arg Val Glu

660 665 670

Lys Pro Arg Lys Asn Ile Val Ile Lys Glu Glu Lys Asp Asn Leu Asp

675 680 685

Gly Leu Asn Phe Ile Ala Gly Lys Asp Val Asp Tyr Val Asn Lys Lys

690 695 700

Ala Met Glu Gly Thr Val Leu Ala His Thr Asp Gly Gly Val Pro Asn

705 710 715 720

Leu Val Val Thr Val Pro Glu Leu Ser Ala Tyr Tyr Phe Gly Asn Met

725 730 735

Val Tyr Phe Phe Glu Lys Ala Cys Gly Ile Ser Gly Tyr Leu Leu Gly

740 745 750

Val Asn Pro Phe Asp Gln Pro Gly Val Glu Ala Tyr Lys Lys Asn Met

755 760 765

Phe Ala Leu Leu Gly Lys Pro Gly Tyr Glu Glu Gln Arg Lys Lys Leu

770 775 780

Glu Glu Arg Leu

785

<210> 4

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

Met Lys Ala Leu His Phe Gly Ala Gly Asn Ile Gly Arg Gly Phe Ile

1 5 10 15

Gly Lys Leu Leu Ala Asp Ala Gly Ile Gln Leu Thr Phe Ala Asp Val

20 25 30

Asn Gln Val Val Leu Asp Ala Leu Asn Ala Arg His Ser Tyr Gln Val

35 40 45

His Val Val Gly Glu Thr Glu Gln Val Asp Thr Val Ser Gly Val Asn

50 55 60

Ala Val Ser Ser Ile Gly Asp Asp Val Val Asp Leu Ile Ala Gln Val

65 70 75 80

Asp Leu Val Thr Thr Ala Val Gly Pro Val Val Leu Glu Arg Ile Ala

85 90 95

Pro Ala Ile Ala Lys Gly Gln Val Lys Arg Lys Glu Gln Gly Asn Glu

100 105 110

Ser Pro Leu Asn Ile Ile Ala Cys Glu Asn Met Val Arg Gly Thr Thr

115 120 125

Gln Leu Lys Gly His Val Met Asn Ala Leu Pro Glu Asp Ala Lys Ala

130 135 140

Trp Val Glu Glu His Val Gly Phe Val Asp Ser Ala Val Asp Arg Ile

145 150 155 160

Val Pro Pro Ser Ala Ser Ala Thr Asn Asp Pro Leu Glu Val Thr Val

165 170 175

Glu Thr Phe Ser Glu Trp Ile Val Asp Lys Thr Gln Phe Lys Gly Ala

180 185 190

Leu Pro Asn Ile Pro Gly Met Glu Leu Thr Asp Asn Leu Met Ala Phe

195 200 205

Val Glu Arg Lys Leu Phe Thr Leu Asn Thr Gly His Ala Ile Thr Ala

210 215 220

Tyr Leu Gly Lys Leu Ala Gly His Gln Thr Ile Arg Asp Ala Ile Leu

225 230 235 240

Asp Glu Lys Ile Arg Ala Val Val Lys Gly Ala Met Glu Glu Ser Gly

245 250 255

Ala Val Leu Ile Lys Arg Tyr Gly Phe Asp Ala Asp Lys His Ala Ala

260 265 270

Tyr Ile Gln Lys Ile Leu Gly Arg Phe Glu Asn Pro Tyr Leu Lys Asp

275 280 285

Asp Val Glu Arg Val Gly Arg Gln Pro Leu Arg Lys Leu Ser Ala Gly

290 295 300

Asp Arg Leu Ile Lys Pro Leu Leu Gly Thr Leu Glu Tyr Gly Leu Pro

305 310 315 320

His Lys Asn Leu Ile Glu Gly Ile Ala Ala Ala Met His Phe Arg Ser

325 330 335

Glu Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Leu Ala Ala Leu Ile Ala Asp Lys

340 345 350

Gly Pro Gln Ala Ala Leu Ala Gln Ile Ser Gly Leu Asp Ala Asn Ser

355 360 365

Glu Val Val Ser Glu Ala Val Thr Ala Tyr Lys Ala Met Gln Leu Glu

370 375 380

His His His His His His

385 390

<210> 5

<211> 343

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Met Ala Glu Thr Glu Trp Thr Pro Glu Ala Leu Ser Gly Arg

35 40 45

Tyr Glu Glu Ile Lys Ser Cys Ile Pro Gln Gln Leu Glu Ala Tyr Ala

50 55 60

Arg Phe Leu Arg Glu Ala Ala Pro Glu Asp Leu Arg Arg Trp Gln Gln

65 70 75 80

Ile Ala Gln Asp Leu Lys Leu Glu Leu Asn Leu Glu Asn Gly Arg Ile

85 90 95

Lys Tyr Lys Lys Glu Phe Lys Pro Leu Glu Leu Pro Val Asp Ile Cys

100 105 110

Tyr Ile Arg His Gly Lys Thr Gln Gly Asn Thr Glu Pro Arg Val Phe

115 120 125

Gln Gly Gln Val Asp Tyr Ala Asn Asn Gln Leu Thr Gln Gln Gly Gln

130 135 140

Gln Gln Ala Ala Ala Ala Ala Thr Lys Leu Glu Ala Met Ala Ala Ala

145 150 155 160

Lys Glu Phe Ile Pro Asp Leu Leu Leu Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ala

165 170 175

Val His Thr Ala Gln Pro Phe Val Asp Ala Asn Pro Lys Pro Leu Phe

180 185 190

Arg Val Leu Pro Glu Leu Ala Glu Met Ala Phe Gly Glu Trp Asp Asn

195 200 205

Arg Lys Val Ala Glu Leu Glu Lys Asp Asp Pro Ala His Leu Phe Tyr

210 215 220

Leu Gln Gln Asn Ala Val Ile Lys Ala Lys Gly Pro His Arg Ile Cys

225 230 235 240

Cys Gln Leu Trp Gln Ser Pro Glu Trp Leu Glu Gly Lys Lys Glu Leu

245 250 255

Pro Ala Glu Asn Phe Leu Glu Cys Leu Asp Arg Gln Arg Lys Ala Leu

260 265 270

Ile Lys Val Gly Glu Ile Ala Lys Glu Leu Cys Gly Pro Ser Cys Gly

275 280 285

Glu Arg Lys Pro Arg Val Ala Val Tyr Gly His Ser Met Ala Gly Ala

290 295 300

Ala Val Ser Val Leu Leu Gly Phe Gly Lys Glu Asp Gln Leu Gly Phe

305 310 315 320

Leu Gly Phe Asp Gly Asn Tyr Ile Met Pro Asn Ala Thr Pro Thr Ile

325 330 335

Leu Ile Pro Asn Ala Lys Pro

340

<210> 6

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

Met Ala Lys Ile Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr

1 5 10 15

Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro

20 25 30

Gly Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly

35 40 45

Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu

50 55 60

Glu Ala Asn Gly His Thr Phe Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Phe Glu Lys Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser

85 90 95

Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala

100 105 110

Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val

115 120 125

Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr

130 135 140

Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu

145 150 155 160

Gly Leu Val Arg Asn Tyr Ile Pro Ser His Asp Trp Ala Arg Lys Gly

165 170 175

Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu His Ser Tyr Asp Leu Glu Gly

180 185 190

Met Thr Val Gly Ser Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu

195 200 205

Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val Lys Leu His Tyr Thr Asp Arg His

210 215 220

Arg Leu Pro Glu Ala Val Glu Lys Glu Leu Gly Leu Val Trp His Asp

225 230 235 240

Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro His Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Val

245 250 255

Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys

260 265 270

Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu

275 280 285

Ala Asp Arg Asp Ala Ile Val Arg Ala Ile Glu Ser Gly Gln Leu Ala

290 295 300

Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His

305 310 315 320

Pro Trp Arg Thr Met Lys Trp Glu Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly

325 330 335

Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile

340 345 350

Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile

355 360 365

Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys

370 375 380

Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala

385 390 395 400

Gly Leu Glu His His His His His His

405

<210> 7

<211> 722

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

Met Val Phe Ser His Lys Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Glu Pro Tyr

1 5 10 15

Pro Leu Gly Ala Asn Trp Glu Glu Glu Asp Asp Gly Val Asn Phe Ser

20 25 30

Ile Phe Ser Glu Asn Ala Thr Lys Val Glu Leu Leu Ile Tyr Ser Pro

35 40 45

Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Val Ile Glu Val Lys Gln Arg Ser

50 55 60

Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Arg Ile Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Asp Gln Gly Leu Arg

85 90 95

Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Ile Asn

100 105 110

Gly Thr Leu Asn Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile Gly Asp

115 120 125

Ser Asn Gln Asp Leu Ser Phe Asp Asp Arg Pro Asp Asp Glu Phe Ile

130 135 140

Pro Lys Gly Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp Asp His

145 150 155 160

Phe Phe Arg Arg Lys Lys Ile Pro Leu Lys Asp Thr Ile Ile Tyr Glu

165 170 175

Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Glu Asn

180 185 190

Ile Arg Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Ser Arg Gln Met Ile Glu Tyr

195 200 205

Leu Lys Asp Leu Gly Val Thr Thr Val Glu Ile Met Pro Val Gln Gln

210 215 220

Phe Val Asp Asp Arg Phe Leu Val Glu Lys Gly Leu Arg Asn Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Tyr Asn Pro Ile Asn Tyr Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr Ser Ser

245 250 255

Ser Gly Cys Met Gly Glu Gln Val Asn Glu Phe Lys Glu Met Val Asn

260 265 270

Glu Leu His Asn Ala Gly Phe Glu Val Ile Ile Asp Val Val Tyr Asn

275 280 285

His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly

290 295 300

Ile Asp Asn Leu Ala Tyr Tyr Met Leu Val Pro Asp Asn Lys Arg Tyr

305 310 315 320

Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser His Pro

325 330 335

Arg Val Leu Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Leu Glu

340 345 350

Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg

355 360 365

Gln Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Ser Thr Phe Phe Val Ala Ile Gln

370 375 380

Gln Asp Pro Val Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro Trp Asp

385 390 395 400

Val Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Trp Ala

405 410 415

Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Thr Ile Arg Arg Phe Trp Arg Gly

420 425 430

Glu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Leu Ala Asn Arg Leu Met Gly Ser Pro

435 440 445

Asp Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile Asn Tyr

450 455 460

Ile Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Asn

465 470 475 480

Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly Met Asn

485 490 495

Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Val Glu Gly Glu Thr Asn Asp Ala

500 505 510

Asn Val Ile Gln Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Ile Ile Thr

515 520 525

Leu Phe Val Ser Gln Gly Val Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp Glu Leu

530 535 540

Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp Asn Glu

545 550 555 560

Ile Ser Trp Phe Asn Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Gln Arg Phe His

565 570 575

Asp Phe Val Arg Ser Met Ile Tyr Phe Tyr Arg Ala His Pro Ile Phe

580 585 590

Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu His Gly Met Pro Leu

595 600 605

Lys Asp Val Thr Phe Leu Lys Pro Asp Gly Asn Glu Ala Asp Glu Gln

610 615 620

Thr Trp Lys Ser Pro Thr Asn Phe Ile Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Ser

625 630 635 640

Val Ile Asp Glu Val Asn Asp Arg Gly Glu Arg Ile Ala Asp Asp Ser

645 650 655

Phe Leu Ile Ile Leu Asn Gly Ser Pro Asn Asn Ile Lys Phe Lys Phe

660 665 670

Pro Gln Gly Lys Trp Ser Leu Val Val Ser Ser Tyr Leu Arg Glu Leu

675 680 685

Arg Asp Asp Glu Arg Val Val Asp Gly Gly Lys Glu Leu Glu Ile Glu

690 695 700

Gly Arg Thr Ala Met Val Tyr Arg Arg Ile Glu Tyr His His His His

705 710 715 720

His His

<210> 8

<211> 667

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

Met Glu Arg Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro Leu

1 5 10 15

Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Asn Arg Ser Tyr Arg

20 25 30

Pro Phe Met Glu Ile Leu Glu Glu Phe Pro Glu Met Lys Val Asn Val

35 40 45

His Phe Ser Gly Pro Leu Leu Glu Trp Ile Glu Glu Asn Lys Pro Asp

50 55 60

Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Ser Leu Ile Lys Arg Gly Gln Leu Glu Ile

65 70 75 80

Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val Leu Ala Ala Ile Pro Lys Glu

85 90 95

Asp Arg Leu Val Gln Ile Glu Met Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Lys Leu

100 105 110

Gly Tyr Asp Ala Lys Gly Val Trp Leu Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro

115 120 125

Glu Leu Val Lys Ser Leu Arg Glu Ala Gly Ile Glu Tyr Val Val Val

130 135 140

Asp Asp Tyr His Phe Met Ser Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Phe

145 150 155 160

Trp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asp Gly Gly Glu Val Ile Thr Val Phe Pro

165 170 175

Ile Asp Glu Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Lys Lys

180 185 190

Thr Ile Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro Ser Lys Val

195 200 205

Ala Val Phe His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Val Trp Pro Gly Thr

210 215 220

Tyr Glu Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp Ala

225 230 235 240

Ile Thr Ser Asn Glu Lys Ile Asn Leu Met Thr Tyr Ser Glu Tyr Leu

245 250 255

Ser Lys Phe Thr Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile Ala Ser Tyr

260 265 270

Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Lys Leu Phe

275 280 285

Val Glu Phe Val Glu Gln Leu Lys Glu Glu Gly Lys Phe Glu Lys Tyr

290 295 300

Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys Asn Phe Phe Phe Lys Tyr

305 310 315 320

Pro Glu Ser Asn Phe Met His Lys Arg Met Leu Met Val Ser Lys Ala

325 330 335

Val Arg Asp Asn Pro Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Leu Lys Ala Gln Cys

340 345 350

Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly Val Phe Gly Gly Ile Tyr Leu Pro His

355 360 365

Leu Arg Arg Thr Val Trp Glu Asn Ile Ile Lys Ala Gln Arg Tyr Leu

370 375 380

Lys Pro Glu Asn Lys Ile Leu Asp Val Asp Phe Asp Gly Arg Ala Glu

385 390 395 400

Ile Met Val Glu Asn Asp Gly Phe Ile Ala Thr Ile Lys Pro His Tyr

405 410 415

Gly Gly Ser Ile Phe Glu Leu Ser Ser Lys Arg Lys Ala Val Asn Tyr

420 425 430

Asn Asp Val Leu Pro Arg Arg Trp Glu His Tyr His Glu Val Pro Glu

435 440 445

Ala Thr Lys Pro Glu Lys Glu Ser Glu Glu Gly Ile Ala Ser Ile His

450 455 460

Glu Leu Gly Lys Gln Ile Pro Glu Glu Ile Arg Arg Glu Leu Ala Tyr

465 470 475 480

Asp Trp Gln Leu Arg Ala Ile Leu Gln Asp His Phe Ile Lys Pro Glu

485 490 495

Glu Thr Leu Asp Asn Tyr Arg Leu Val Lys Tyr His Glu Leu Gly Asp

500 505 510

Phe Val Asn Gln Pro Tyr Glu Tyr Glu Met Ile Glu Asn Gly Val Lys

515 520 525

Leu Trp Arg Glu Gly Gly Val Tyr Ala Glu Glu Lys Ile Pro Ala Arg

530 535 540

Val Glu Lys Lys Ile Glu Leu Thr Glu Asp Gly Phe Ile Ala Lys Tyr

545 550 555 560

Arg Val Leu Leu Glu Lys Pro Tyr Lys Ala Leu Phe Gly Val Glu Ile

565 570 575

Asn Leu Ala Val His Ser Val Met Glu Lys Pro Glu Glu Phe Glu Ala

580 585 590

Lys Glu Phe Glu Val Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Gly Lys Val Arg Ile

595 600 605

Glu Leu Asp Lys Ala Ala Lys Val Trp Lys Phe Pro Ile Lys Thr Leu

610 615 620

Ser Gln Ser Glu Ala Gly Trp Asp Phe Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr

625 630 635 640

Thr Met Leu Phe Pro Ile Glu Lys Glu Leu Glu Phe Thr Val Arg Phe

645 650 655

Arg Glu Leu Leu Glu His His His His His His

660 665

<210> 9

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

Met Ala Ser Arg Gly Arg Val Gly Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Leu Asp Arg Gly Thr Leu Val Val

20 25 30

Asp Pro Val Lys Ile Ala Thr Pro Gln Pro Ala Thr Pro Glu Ala Val

35 40 45

Ala Ala Val Val Ala Glu Ile Val Thr Ala Phe Ala Asp Asp Val Pro

50 55 60

Gln Asp Ala Pro Leu Gly Val Ala Phe Pro Ala Val Ile Gln His Gly

65 70 75 80

Val Ala Arg Ser Ala Ala Asn Met Asp Arg Ser Trp Ile Gly Thr Asn

85 90 95

Val Glu Glu Leu Leu Ser Ala Val Thr Gly Arg Arg Val Leu Val Val

100 105 110

Asn Asp Ala Asp Ala Ala Ala Met Ala Glu His Arg Tyr Gly Ala Ala

115 120 125

Ser Gly Val Asp Gly Val Val Leu Leu Thr Thr Leu Gly Thr Gly Ile

130 135 140

Gly Thr Ala Val Leu Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Asn Thr Glu Phe

145 150 155 160

Gly His Leu Glu Ile Asp Gly Tyr Asp Ala Glu Thr Arg Ala Ser Ala

165 170 175

Ser Ala Lys Glu Arg Glu Asn Leu Ser Tyr Lys Glu Trp Ala Glu Glu

180 185 190

Arg Leu Gln Arg Tyr Tyr Ser Val Ile Glu Asp Leu Leu Trp Pro Asp

195 200 205

Leu Ile Val Val Gly Gly Gly Val Ser Arg Lys Ala Asp Lys Phe Leu

210 215 220

Pro His Leu Arg Leu Arg Thr Pro Ile Val Pro Ala Lys Leu Arg Asn

225 230 235 240

Thr Ala Gly Ile Val Gly Ala Ala Val Leu Ala Ala Glu Arg Leu Gly

245 250 255

Gly Asp Arg Val Ser Ala Leu Glu His His His His His His

260 265 270

<210> 10

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

atgaaagcat tacattttgg cgcaggtaat atcggtcgtg gctttatcgg taaactgctg 60

gcagacgcgg gtatccaact gacgtttgcc gatgtcaatc aggtggtact tgatgccctg 120

aatgcccgtc atagctatca ggtacatgtg gttggtgaaa ccgagcaggt agataccgtt 180

tccggcgtca atgctgtcag cagcattggt gatgatgtcg ttgatctgat tgctcaggtt 240

gatttagtca ctaccgccgt tggcccggtt gtgctggaac gtattgctcc ggcaatcgcc 300

aaagggcagg tgaaacgtaa agaacaaggt aatgaatccc cgctgaacat catcgcctgt 360

gaaaacatgg tacgcggtac cacgcagctg aaaggccatg tgatgaacgc cctgccggaa 420

gacgccaaag cgtgggtaga agaacacgtt ggctttgtcg attccgccgt tgaccgcatc 480

gtaccgcctt cggcttcggc aactaacgat ccgctggaag tgacggtaga aaccttcagc 540

gaatggattg tcgataaaac gcagttcaaa ggcgcactgc cgaacatccc aggcatggag 600

ttaaccgaca acctgatggc atttgtcgaa cgtaaactct tcaccctgaa cacgggtcat 660

gctataaccg cgtacctcgg aaaactggcc ggtcatcaga ccattcgtga cgcgattctc 720

gacgagaaaa tccgcgcggt ggtaaaaggt gcgatggaag aaagtggtgc agtattgatc 780

aagcgctacg gctttgacgc tgacaagcat gcggcgtaca tccagaaaat tctcggccgt 840

tttgagaacc cgtatctgaa agatgatgta gagcgcgtag gccgtcagcc actgcgtaaa 900

ctgagtgctg gcgaccgtct gatcaagcca ctgctcggta cgctggaata tggtctgcca 960

cataaaaacc tgattgaagg tattgccgct gcaatgcact tccgcagtga agatgatccg 1020

caggctcagg aactggcagc actgatcgct gacaaaggtc cgcaggcggc gctggcacag 1080

atttccggtc ttgatgccaa cagcgaggtt gtatccgagg cggtaaccgc ttataaagca 1140

atgcaactcg agcaccacca ccaccaccac tga 1173

<210> 11

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatggcgga gaccgaatgg 120

accccggaag cgctgagcgg ccgttacgag gaaatcaaga gctgcattcc gcagcaactg 180

gaggcgtatg cgcgtttcct gcgtgaagcg gcgccggaag acctgcgtcg ttggcagcaa 240

atcgcgcaag atctgaagct ggagctgaac ctggaaaacg gtcgtattaa gtacaagaaa 300

gaattcaaac cgctggagct gccggtggac atctgctata ttcgtcacgg caaaacccag 360

ggtaacaccg aaccgcgtgt gtttcaaggc caggttgatt acgcgaacaa ccagctgacc 420

cagcaaggtc aacaacaggc ggcggcggcg gcgaccaagc tggaagcgat ggcggcggcg 480

aaagagttta ttccggacct gctgctgagc agcccgctgc tgcgtgcggt gcacaccgcg 540

cagccgttcg ttgatgcgaa cccgaaaccg ctgtttcgtg tgctgccgga gctggcggaa 600

atggcgttcg gcgagtggga caaccgtaag gttgcggagc tggaaaaaga cgatccggcg 660

cacctgtttt atctgcaaca gaacgcggtg atcaaggcga aaggcccgca ccgtatttgc 720

tgccaactgt ggcagagccc ggagtggctg gaaggtaaga aagagctgcc ggcggaaaac 780

ttcctggagt gcctggatcg tcagcgtaag gcgctgatca aagttggtga aattgcgaaa 840

gagctgtgcg gtccgagctg cggtgaacgt aaaccgcgtg tggcggttta tggtcacagc 900

atggcgggtg cggctgtgag cgttctgctg ggttttggca aagaggacca gctgggtttc 960

ctgggctttg atggtaacta tattatgccg aacgcgaccc cgaccatcct gattccgaac 1020

gcgaaaccgt aa 1032

<210> 12

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

atggcgaaga ttctgtgtgt tctgtacgat gacccggttg acggttatcc gaagacctat 60

gcccgcgatg acctgccgaa gattgaccac tatccgggcg gtcagaccct gccgacgccg 120

aaagcgatcg attttacccc gggccaactg ctgggtagtg tgtccggcga actgggtctg 180

cgtaaatacc tggaagccaa cggccatacc tttgtggtta cgagcgataa agacggtccg 240

gattctgtgt tcgaaaagga actggttgat gctgacgtcg tgatttctca gccgttctgg 300

ccggcatatc tgaccccgga acgtatcgca aaagctaaga acctgaaact ggcactgacg 360

gctggcattg gtagtgatca cgtggacctg cagtccgcca ttgatcgcgg catcaccgtc 420

gcagaagtga cgtattgcaa ttcaatttcg gttgccgaac atgttgtcat gatgattctg 480

ggtctggtcc gtaactacat cccgagccac gattgggctc gcaaaggcgg ttggaatatc 540

gcggattgtg ttgaacatag ctatgatctg gaaggcatga ccgttggttc ggtcgcagca 600

ggtcgtattg gtctggcagt cctgcgtcgc ctggcaccgt ttgatgtgaa gctgcattat 660

accgaccgtc accgtctgcc ggaagcagtg gaaaaagaac tgggcctggt ttggcatgat 720

acccgcgaag acatgtaccc gcactgcgat gtggttacgc tgaacgtccc gctgcatccg 780

gaaaccgaac acatgatcaa tgatgaaacg ctgaaactgt ttaagcgtgg cgcttatatt 840

gtgaacaccg cgcgcggtaa actggcagat cgtgacgcta ttgttcgtgc aatcgaaagc 900

ggtcagctgg caggttacgc aggtgatgtt tggttcccgc aaccggcacc gaaagaccat 960

ccgtggcgta ccatgaagtg ggaaggcatg accccgcaca tcagcggtac gagcctgtct 1020

gcacaggcac gttatgcagc tggtacgcgc gaaattctgg aatgcttttt cgaaggtcgt 1080

ccgattcgcg atgaatatct gatcgtgcaa ggcggtgcac tggctggtac cggtgcccat 1140

agttactcca aaggcaacgc aacgggcggt agcgaagaag cggccaaatt caaaaaggca 1200

ggcctcgagc accaccacca ccaccactga 1230

Claims

1.体外多酶催化反应制备甘露醇的方法，其特征在于：

将含有300 g/L可溶性淀粉、5 mM pH 5.5的乙酸钠缓冲液、0.5 mM氯化镁和1 U/mL异淀粉酶，其余为水的1 mL反应混合物，在85℃处理12个小时，得到的液体为300 g/L经异淀粉酶处理的可溶性淀粉溶液；

将含有10 g/L经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、10 mM氯化镁、15 mM磷酸二氢钠、100 mM甲酸钠、0.1 mM NAD⁺、200 mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液、2 U/mL αGP、2 U/mL PGM、1 U/mLPGI、1 U/mL M1PDH、1 U/mL M1Pase、1 U/mL FDH，其余为水的1 mL反应混合物在37℃下孵育18 h，然后向体系中加入4GT、PPGK和六偏磷酸钠，使4GT 的含量为1 U/mL、PPGK的含量为1 U/mL 和六偏磷酸钠的含量为5 mM，37℃继续反应至30 h，得到甘露醇；

所述4GT的氨基酸序列如序列表中序列8所示；

所述PPGK的氨基酸序列如序列表中序列9所示。