JP2011067157A - 藻類由来のマンニトール合成関連遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アヤギヌから精製した酵素の部分アミノ酸配列の決定と、その配列情報を基に設計したプライマーを利用したPCRなどにより、アヤギヌからM1PDH遺伝子およびM1Pase遺伝子を取得することに成功した。これら遺伝子の導入により、植物内や微生物内におけるマンニトール合成を効率的に行うことが可能となり、引いては、これら生物のストレス耐性を向上させることが可能である。
【選択図】なし
Description
<1> 藻類由来のマンニトール-1-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域からなるDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
<2> 藻類由来のマンニトール-1-リン酸ホスファターゼをコードする下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:3に記載の塩基配列のコード領域からなるDNA
(c)配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
<3> <1>に記載のDNAおよび/もしくは<2>に記載のDNAを含むベクター。
<4> <1>に記載のDNAおよび/もしくは<2>に記載のDNA、または<3>に記載のベクターが導入された形質転換体。
<5> 植物または微生物である、<4>に記載の形質転換体。
<6> ストレス耐性が向上している、<5>に記載の形質転換体。
250: 252-258,1996.)に記載の方法で形質転換が可能である。プロモーターとして、例えば、GDPプロモーターを用い、目的遺伝子とプロモーターを組み込んだプラスミドをエレクトロポレーション法により、アガリスクに導入することができる。枯草菌においては、例えば、B. subtilisの形質転換技術が確立されている。pHY300PLK(タカラバイオ)などの市販ベクターに本発明のDNAを挿入して、エレクトロポレーション法によりB. subtilisに導入することができる。また、酵母においては、市販の試薬キット(酵母形質転換用試薬:和光純薬工業)を用いて簡便に本発明のDNAが挿入されたプラスミドを形質転換することが可能である。
アヤギヌM1PDHの部分配列(MTKQDYLYTLLEQSTSNTNAVIVGQ/配列番号:7およびAQYVIEDKFTMGRPFLEKVGVQFVDDVAPFERMKMRILNGAHATLCFP/配列番号:8)を同定し、この配列を基に設計した縮重プライマーLEP1-1s(5’-ATGACNAARCARGAYTAYYTNTAYAC-3’/配列番号:9)、LEP12-3a(5’-CYTTNAYHATNCMCATRTTCA-3’/配列番号:10)を用いて、増幅したcDNAをテンプレートとしてPCRを行った。PCR条件は先述と同様で、アニーリング温度のみ48℃に変更した。1.5%アガロースゲルを用いた電気泳動により結果を確認した。精製したPCR産物の塩基配列を決定するために、TAクローニングを行った。本操作は、pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)を使い、添付のプロトコールに従って行った。インサートチェックをするために、マスタープレートの数コロニーを対象にコロニーPCRを行った。PCR反応液にDNA液を入れる代わりにコロニーを直接加えた。プライマーはSeq-F(5’-GGCCCGACGTCGCATGCTC-3’/配列番号:11)、Seq-R2(5’-GAGTTCGATACGTAGGTTGCG-3’/配列番号:12)、Sigma Taqポリメラーゼを使用した。目的のインサートを持ったコロニーをマスタープレートから3mlのLB培地に移して37℃のインキュベーターで振盪しながら18時間培養した。アルカリSDS法によりプラスミドの精製を行った。精製したプラスミドDNAをテンプレートとして、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、California、USA)を用い、プロトコールに従ってサイクルシーケンスを行った。1μlの精製したテンプレートDNA、片側のプライマー(SeqFもしくはSeqR2)を1μl、BigDyeを0.5μl、MQ水を13.5μlの計20μlを加えてサーマルサイクラーでサイクルシーケンスを行った。シーケンス結果を基に遺伝子特異的プライマー、MPDH-11F(5’-ACGTTTGCAGAGTCCGGAATATTCGC-3’/配列番号:13)、MPDH-11R(5’-CATACCGAGAAGCCCTGCAGCGTA-3’/配列番号:14)を設計した。
アヤギヌM1Paseの部分アミノ酸配列(LSIVWDMDGVLLDSEPIHVIVENELVGAYGKD/配列番号:17およびAAAAIDADPKDCVAFEDAPSGVRAADAAGMXR/配列番号:18)を同定し、この配列を基に設計した縮重プライマーLEP6-s(5’-ATHGTNTGGGAYATGGAYGG-3’/配列番号:19)とLEP8-a(5’-YTTNGGRTCNGCRTCDAT-3’/配列番号:20)を用いて、増幅したcDNAをテンプレートとしてPCRを行った。PCR条件は先述と同様で、アニーリング温度のみ55℃に変更した。1.5%アガロースゲルを用いた電気泳動により、バンドを確認した。先述と同様の方法で、PCR産物を精製し、クローニングし、シーケンスまで行った。得られた配列から、遺伝子特異的プライマーM1Pase-1F(5’-GGTACTGTTGGATTCGGAACC-3’/配列番号:21)およびM1Pase-1R(5’-AGCTGCAGCCTTGAGGAACA-3'/配列番号:22)を設計した。さらにその内側にM1Pase-2F(5’-TTCACGTGATAGTTGAGAACGAA-3'/配列番号:23)とM1Pase-2R(5’-GGTTTCCCGTTCGTCACGTC-3’/配列番号:24)を設計した。全長配列を得るために、LEP6-sとGeneRacer3’Primerを用いた3’RACE、およびGeneRacer5’PrimerとLEP8-asを用いた5’RACEを行い、さらにそれぞれのPCR産物をテンプレートとして、nested PCRを行った。nested PCRは、3’RACEはM1Pase-1FとGeneRacer 3’nested Primer(5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’/配列番号:25)で、5’RACEはGeneRacer 5’nested PrimerとM1Pase-1R(5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’/配列番号:26)で行った。3’RACEに関しては、nested PCRの産物をテンプレートとしてさらに、M1Pase-2FとGeneRacer 3’nested Primerを用いたnested PCRを行った。得られた産物から、目的のバンドを切出してクローニングし、先述と同様の手順でシーケンスまで行った。3’RACEおよび5’RACEの結果を合わせ、全長配列を得た。全長を増幅するプライマー、M1Pase-4F(5’-AACTTTTCATCAACATCTATCAGCAG-3’/配列番号:27)とM1Pase-4R(5’-GAAAGTCATTTACTGGTCAAATCAA-3'/配列番号:28)を設計し、ゲノムDNAとcDNAをテンプレートとしてPCRを行い、シーケンスすることにより、塩基配列の精度とイントロンの有無を確認した。
Claims (6)
- 藻類由来のマンニトール-1-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域からなるDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA - 藻類由来のマンニトール-1-リン酸ホスファターゼをコードする下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:3に記載の塩基配列のコード領域からなるDNA
(c)配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA - 請求項1に記載のDNAおよび/もしくは請求項2に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項1に記載のDNAおよび/もしくは請求項2に記載のDNA、または請求項3に記載のベクターが導入された形質転換体。
- 植物または微生物である、請求項4に記載の形質転換体。
- ストレス耐性が向上している、請求項5に記載の形質転換体。
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