CN109748959B

CN109748959B - 花青素合成相关蛋白SlANT1L及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN109748959B
Application number: CN201711089440.9A
Authority: CN
Inventors: 李传友; 孙传龙; 邓磊; 蒋红玲; 李常保
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN109748959A

Abstract

本发明公开了花青素合成相关蛋白SlANT1L及其编码基因与应用。本发明所提供的花青素合成相关蛋白SlANT1L为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。实验证明，与番茄品种Alisa Craig相比，T0代转SlANT1L基因番茄果实中的总花青素含量大大增加。花青素合成相关蛋白SlANT1L及其编码基因在调控植物花青素合成中具有重要的理论意义和实用价值。本发明在农业领域具有重要的应用和市场前景。

Description

花青素合成相关蛋白SlANT1L及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及花青素合成相关蛋白SlANT1L及其编码基因与应用。

背景技术

花青素是自然界植物组织，尤其是花器官呈现绚丽色彩的主要原因，也是公认的植物组织特有的具有促进健康功能的抗氧化剂。病理学研究表明，花青素能够保护人体免受自由基等有害物质的损伤，在心脑血管疾病以及乳腺癌等疾病的预防方面具有显著效果。

番茄(Solanum lycopersicum)是世界范围内广泛种植的蔬菜和水果兼用类作物，深受各国消费者喜爱。普通栽培番茄来源于野生醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)，其主要营养物质为番茄红素，番茄红素属于脂溶性抗氧化物质。某些野生番茄材料的果实可以积累水溶性抗氧化物质花青素。为了提高番茄营养价值，育种家通过杂交和多代回交，将智利番茄(Solanum Chilense)中调控花青素合成的染色体片段导入普通栽培番茄中，培育出了可以在番茄果皮中积累花青素的番茄材料，如Indigo Rose等。因此，挖掘番茄花青素合成相关基因具有重要的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物中的花青素含量。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种花青素合成相关蛋白。

本发明所提供的花青素合成相关蛋白，名称为蛋白质SlANT1L，来源于番茄品种Indigo Rose，为如下1)或2)或3)或4)：

1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物花青素合成相关的蛋白质；

4)与序列表中序列2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于植物且与植物花青素合成相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由262个氨基酸残基组成。

为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述3)中的蛋白质SlANT1L，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述3)中的蛋白质SlANT1L可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述3)中的蛋白质SlANT1L的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述4)中，使用的术语“同源性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的序列表中序列2所示的氨基酸序列具有80％，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述编码蛋白质SlANT1L的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)所示的DNA分子：

(a1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码所述蛋白质SlANT1L的DNA分子；

(a4)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于植物且编码所述蛋白质SlANT1L的DNA分子；

(a5)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质SlANT1L的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子可为编码所述蛋白质SlANT1L的基因及其调控序列形成的核酸分子。

其中，序列表中序列1由789个核苷酸组成，序列表中序列1所示的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质SlANT1L的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质SlANT1L的核苷酸序列75％或者更高同源性的核苷酸，只要编码蛋白质SlANT1L且与植物花青素合成相关，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的核苷酸序列。

含有编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为将编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子(即序列表中序列1所示的DNA分子)通过含有编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子的表达盒插入出发质粒得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为实施例2中提及的超表达载体pK7WGF2-SlANT1L。

所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)具体可为根癌农杆菌LBA4404。

所述重组微生物具体可为LBA4404/pK7WGF2-SlANT1L。LBA4404/pK7WGF2-SlANT1L是将所述超表达载体pK7WGF2-SlANT1L转化根癌农杆菌LBA4404得到的重组农杆菌。

所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述SlANT1L基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

所述蛋白质SlANT1L，或，编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子，或，含有编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物花青素合成中的应用也属于本发明的保护范围。所述调控植物花青素合成可为促进植物花青素合成。

所述蛋白质SlANT1L，或，编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子，或，含有编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育花青素含量改变的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述花青素含量改变可为花青素含量提高。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括向受体植物中导入提高所述蛋白质SlANT1L表达和/或活性的物质，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的花青素含量提高。

上述方法中，所述“向受体植物中导入提高所述蛋白质SlANT1L表达和/或活性的物质”可通过向受体植物中导入编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子实现。

上述方法中，所述编码蛋白质SlANT1L的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)所示的DNA分子：

(a1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

上述方法中，使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的核苷酸序列。

上述方法中，所述“向受体植物中导入编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为实施例提及的超表达载体pK7WGF2-SlANT1L。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质SlANT1L的含量和/或活性，从而提高植物的花青素含量。

上述植物育种方法中，所述“增加植物中所述蛋白质SlANT1L的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质SlANT1L的含量和/或活性的效果。

上述任一所述植物可为c1)至c5)中的任一种：c1)单子叶植物；c2)双子叶植物；c3)茄科植物；c4)番茄；c5)番茄品种Alisa Craig。

上述任一所述花青素具体可为总花青素。

上文中，同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

实验证明，利用本发明提供的蛋白质SlANT1L及其编码基因能提高植物的花青素含量：与番茄品种Alisa Craig相比，T0代转SlANT1L基因番茄果实中的总花青素含量大大增加。因此，蛋白质SlANT1L及其编码基因在调控植物花青素合成中具有重要的理论意义和实用价值。本发明在农业领域具有重要的应用和市场前景。

附图说明

图1为超表达载体pK7WGF2-SlANT1L的结构示意图。

图2为T0代转SlANT1L基因番茄DNA水平的鉴定。

图3为T0代转SlANT1L基因番茄的表型鉴定。

图4为T0代转SlANT1L基因番茄的总花青素含量结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

番茄品种Indigo Rose为Johnn’s Selected Seeds公司的产品。在下文中，番茄品种Indigo Rose简称为Indigo Rose。Indigo Rose的果皮有大量花青素积累，绿熟期的果实呈紫黑色。

番茄品种Alisa Craig为美国番茄遗传资源中心(网址为：http://tgrc.ucdavis.edu/)的产品。在下文中，番茄品种Alisa Craig简称为Alisa Craig。AlisaCraig的果皮没有花青素积累，绿熟期的果实呈绿色。

入门载体pQB和载体pK7WGF2均为Addgene载体库(网址为：http://www.addgene.org/)的产品。KOD-Plus DNA聚合酶为TOYOBO公司的产品。Gateway LR试剂盒和CloneJET PCR Cloning试剂盒为Thermo Fisher Scientific公司的产品。PCR产物纯化试剂盒为Omega公司的产品。根癌农杆菌LBA4404感受态细胞为北京华越洋生物科技有限公司的产品，产品目录号为02261512。快捷型植物基因组DNA提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品。Taq PCR StarMix为GenStar公司的产品。载体pJET1.2为CloneJET PCRCloning试剂盒中的组件。

YEB液体培养基：将5g酵母提取物、5g蛋白胨、5g牛肉浸膏、0.5g七水硫酸镁和1g蔗糖溶于蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值为5.7。121℃高压灭菌15min。

YEB抗体平板：将5g酵母提取物、5g蛋白胨、5g牛肉浸膏、0.5g七水硫酸镁、8g琼脂和1g蔗糖溶于蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值为5.7；121℃高压灭菌15min；冷却至55℃时，加入已过滤除菌的壮观霉素、链霉素和利福平并使其在培养基中的浓度依次为50μg/mL、500μg/mL和50μg/mL，最后倒入培养皿，冷却后得到YEB抗体平板。

MS固体培养基：将4.33g MS粉末和30g蔗糖溶于少量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值为5.9。121℃高压灭菌15min。

MS盐溶液：将4.33g MS盐粉末和30g蔗糖溶于少量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值为5.9。121℃高压灭菌15min。

MS粉末为北京华越洋生物科技有限公司的产品，产品目录号为M519。

MS盐粉末为北京华越洋生物科技有限公司的产品，产品目录号为M524。

实施例1、SlANT1L基因的获得

获得SlANT1L基因的步骤如下：

1、提取Indigo Rose绿熟期果皮的总RNA，然后反转录，得到Indigo Rose的cDNA。

2、完成步骤1后，以Indigo Rose的cDNA为模板，采用引物SlANT1L-OF：5’-ATGAATATTGCCAAGACATTG-3’(序列表中序列3)和引物SlANT1L-OR：5’-CTAATTAAATAGATTCCATAGGTCA-3’(序列表中序列4)组成的引物对进行PCR扩增，得到约789bp的PCR扩增产物。

反应体系(50μL)：由KOD Plus Buffer(KOD-Plus DNA聚合酶中的组件)5μL、dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为2mM)5μL、MgCl₂水溶液(浓度为25mM)2μL、引物SlANT1L-OF水溶液(浓度为10μM)1.5μL、引物SlANT1L-OR水溶液(浓度为10μM)1.5μL、Indigo Rose的cDNA(含10-20ng cDNA)1μL、KOD-Plus DNA聚合酶1μL和双蒸水33μL组成。

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，68℃延伸60s，共35个循环；68℃延伸10min。

3、完成步骤2后，采用PCR产物纯化试剂盒回收步骤2得到的PCR扩增产物，得到回收片段。

4、采用CloneJET PCR Cloning试剂盒将步骤3得到的回收片段和载体pJET1.2连接，得到重组质粒pJET1.2-SlANT1L。

由北京睿博兴科公司对重组质粒pJET1.2-SlANT1L进行测序。测序结果表明，重组质粒pJET1.2-SlANT1L中含有序列表中序列1所示的核苷酸序列。序列表中序列1所示的基因命名为SlANT1L基因，其编码的蛋白命名为SlANT1L蛋白或蛋白质SlANT1L，氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、T0代转SlANT1L基因番茄的获得和总花青素含量的测定

一、超表达载体pK7WGF2-SlANT1L的构建

1、同实施例1中步骤1。

2、同实施例1中步骤2。

3、同实施例1中步骤3。

4、将步骤3得到的回收片段和入门载体pQB连接，得到重组质粒pQB-SlANT1L。

5、采用Gateway LR试剂盒将重组质粒pQB-SlANT1L和载体pK7WGF2进行LR反应，LR反应产物即为超表达载体pK7WGF2-SlANT1L。

由北京睿博兴科公司对超表达载体pK7WGF2-SlANT1L进行测序。测序结果表明，超表达载体pK7WGF2-SlANT1L中含有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

超表达载体pK7WGF2-SlANT1L的结构示意图见图1。

超表达载体pK7WGF2-SlANT1L表达序列表中序列2所示的蛋白质SlANT1L。

二、重组农杆菌的制备

1、LBA4404/pK7WGF2-SlANT1L的制备

(1)取1μg超表达载体pK7WGF2-SlANT1L，加入100μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，液氮中速冻3min，然后加入1mL YEB培养基，28℃、200rpm培养2-4h。

(2)完成步骤(1)后，10000g离心30s，弃上清，得到沉淀。

(3)完成步骤(2)后，取沉淀，加入0.1mL YEB培养基悬浮，然后均匀涂布于YEB抗体平板上，28℃黑暗培养2-3d。

(4)完成步骤(3)后，挑单菌落，然后分别接种于含50μg/mL壮观霉素、500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基，28℃、200rpm培养过夜，得到培养菌液。

(5)以引物GFP-F：5’-CAGTGCTTCAGCCGCTACCC-3’和引物SlANT1L-R：5’-CCAGAGCAAAGTCACCTCTCTT-3’为引物，分别以步骤(4)得到的培养菌液为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果该PCR扩增产物中含有大小为720bp的DNA片段，则相应的单菌落为阳性的重组农杆菌；如果该PCR扩增产物中不含有大小为720bp的DNA片段，则相应的单菌落不为阳性的重组农杆菌。

将阳性的重组农杆菌命名为LBA4404/pK7WGF2-SlANT1L。

三、T0代转SlANT1L基因番茄的获得

光暗交替培养即光照培养和暗培养交替。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。

1、外植体的制备

(1)取Ailsa Craig种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡2min，用10％(10mg/100mL)NaClO水溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗7遍，最后播种于种子生长培养基上，25℃光暗交替培养(光照培养时的光照强度为800-1200Lx)。

(2)待步骤(1)中的种子萌发7d，在无菌条件下用剪刀切取子叶中部，再置于含1mg/L吲哚乙酸和1.75mg/L玉米素核苷的MS固体培养基上，25℃光暗交替培养(光照培养时的光照强度为800-1200Lx)1d，得到外植体。

2、农杆菌浸染液的制备

(1)将LBA4404/pK7WGF2-SlANT1L接种于YEB抗体平板上，28℃培养3d，进行活化。

(2)将步骤(1)活化的LBA4404/pK7WGF2-SlANT1L单克隆接种于50mL含50μg/mL壮观霉素、500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基，28℃、200rpm培养16h，得到培养菌液。

(3)取培养菌液，4℃、4000rpm离心10min，收集沉淀。

(4)取沉淀，用40mL MS盐溶液重悬，即得到农杆菌侵染液。

3、T0代转SlANT1L基因番茄的获得

(1)取步骤1制备的外植体，置于离心管，然后加入步骤2制备的农杆菌浸染液，轻轻颠倒离心管20次，再直立静置15min。

(2)完成步骤(1)后，将所述外植体转移至含1mg/L吲哚乙酸和1.75mg/L玉米素核苷的MS固体培养基，然后25℃光暗交替培养48h(光照培养时的光照强度为100-200Lx)。

(3)完成步骤(2)后，将所述外植体转移至含1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L壮观霉素的MS固体培养基，然后25℃光暗交替培养(光照培养时的光照强度为800-1200Lx)，直至长出2-3cm长的再生芽。

(4)完成步骤(3)后，将所述再生芽切下并转移至含200mg/L特美汀和50mg/L壮观霉素的MS固体培养基，然后25℃光暗交替培养(光照培养时的光照强度为800-1200Lx)，直至生根，即得到T0代转SlANT1L基因番茄。

将其中6个T0代转SlANT1L基因番茄依次命名为SlANT1L-1至SlANT1L-6。

四、T0代转SlANT1L基因番茄DNA水平的鉴定

待测番茄植株为SlANT1L-1的植株、SlANT1L-2的植株、SlANT1L-3的植株、SlANT1L-4的植株、SlANT1L-5的植株、SlANT1L-6的植株或Ailsa Craig的植株。

(1)采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒提取待测番茄植株的基因组DNA。

(2)以待测番茄植株的基因组DNA为模板，采用步骤二1中(5)的引物GFP-F和引物SlANT1L-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果该PCR扩增产物中含有大小为720bp的DNA片段，则相应的T0代转SlANT1L基因番茄为T0代阳性转SlANT1L基因番茄；如果该PCR扩增产物中不含有大小为720bp的DNA片段，则相应的T0代转SlANT1L基因番茄为阴性转SlANT1L基因番茄。

反应体系(20μL)：由Taq PCR StarMix 10μL、引物GFP-F水溶液(浓度为10μM)0.8μL、引物SlANT1L-R水溶液(浓度为10μM)0.8μL、待测番茄植株的基因组DNA(含10-20ng DNA)1.5μL和双蒸水6.9μL组成。

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。

(3)按照步骤(2)的方法，将“待测番茄植株的基因组DNA”替换为超表达载体pK7WGF2-SlANT1L，其它步骤均不变。作为阳性对照。

部分实验结果见图2(M为DNA Marker，1为超表达载体pK7WGF2-SlANT1L，2为AilsaCraig的植株，3为SlANT1L-1的植株，4为SlANT1L-2的植株，5为SlANT1L-3的植株，6为SlANT1L-4的植株，7为SlANT1L-5的植株，8为SlANT1L-6的植株)。实验结果，以SlANT1L-3的植株或Ailsa Craig的植株的基因组DNA为模板，获得的PCR扩增产物中不含有大小为720bp的DNA片段；而以SlANT1L-1的植株的基因组DNA、SlANT1L-2的植株的基因组DNA、SlANT1L-4的植株的基因组DNA、SlANT1L-5的植株的基因组DNA、SlANT1L-6的植株的基因组DNA或超表达载体pK7WGF2-SlANT1L为模板，获得的PCR扩增产物中含有大小为720bp的DNA片段。因此，SlANT1L-1、SlANT1L-2、SlANT1L-4、SlANT1L-5和SlANT1L-6均为阳性T0代转SlANT1L基因番茄。

六、T0代转SlANT1L基因番茄的表型鉴定

待测番茄为SlANT1L-1、SlANT1L-2、SlANT1L-4、SlANT1L-5、SlANT1L-6或AilsaCraig。

1、待待测番茄生长至25d，观察整株植株的颜色。

部分实验结果见图3中A(从左至右依次为Ailsa Craig的植株、SlANT1L-1的植株和SlANT1L-2的植株)。结果表明，Ailsa Craig的植株颜色为绿色，SlANT1L-1、SlANT1L-2、SlANT1L-4、SlANT1L-5和SlANT1L-6的植株颜色为紫黑色。

2、待待测番茄生长至绿熟期，观察果实的颜色。

部分实验结果见图3中B(从左至右依次为Ailsa Craig的果实、SlANT1L-1的果实和SlANT1L-2的果实)。结果表明，Ailsa Craig的果实呈绿色，SlANT1L-1的果实、SlANT1L-2的果实、SlANT1L-4的果实、SlANT1L-5的果实和SlANT1L-6的果实呈不同程度的紫黑色。

六、T0代转SlANT1L基因番茄的总花青素含量的测定

检测待测番茄果实中的总花青素含量。总花青素含量的测定方法记载于如下文献中：Zhang,B.，Hu,Z.，Zhang,Y.，Li,Y.，Zhou,S.，and Chen,G.(2012).A putativefunctional MYB transcription factor induced by low temperature regulatesanthocyanin biosynthesis in purple kale(Brassica Oleracea var.acephalaf.tricolor).Plant Cell Rep 31，281-289.

部分实验结果见图4(WT为Ailsa Craig，1为SlANT1L-1，2为SlANT1L-2)。结果表明，Ailsa Craig的果实中无花青素，而SlANT1L-1的果实、SlANT1L-2的果实、SlANT1L-4的果实、SlANT1L-5的果实和SlANT1L-6的果实中花青素含量大大提高(如SlANT1L-1的果实的花青素含量为8.8mg/g FW，SlANT1L-2的果实的花青素含量为16.53mg/g FW)。

上述结果表明，过表达SlANT1L基因能显著提高番茄的总花青素含量。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所北京市农林科学院

<120> 番茄花青素合成蛋白SlANT1L及其编码基因与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum cv.Indigo Rose）

<400> 1

atgaatattg ccaagacatt gggagtgaga aaaggttcat ggactgaaga tgaagatatt 60

cttttgagga aatgtattga caagtatgga gaaggaaagt ggcatcttgt tccttttaga 120

gctggtctaa atagatgtcg aaagagttgt agactgaggt ggttgaatta tctaaggcca 180

catatcaaga gaggtgactt tgctatggat gaaatagatc tcattttgag acttcacaag 240

cttctaggca atagatggtc acttattgct gggagacttc cgggaagaac agcaaacgat 300

gtgaaaaact attggaacac acacctacac aagaagttat taataactcc tcagatacaa 360

gagaataagt acaataaaac cctcaagatt atcactgaaa gcactatact acgaccacga 420

ccaagacctc gacctcgaac attctcaagt gaaaataata tttcttggtg cactaacaat 480

agtatgatca caaacacatt agacaaagat gacgaacaac gcaacaaaga aatcgcagta 540

aatatttgtg agaagccaac aagagaaaca ccgtcatcgt ctatagacga tgatggagtt 600

aaatggtgga caaatttact ggaaaattgg aaagaatttg aggaagaagc aacagcagta 660

ttgaactttg aggaagaaaa taagttgtta ccaaatttgt tgtgtgagga acataattca 720

acaaccatgc aacatggaga aaatgatgac ttttcagttg atattgacct atggaatcta 780

tttaattag 789

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 番茄（Solanum lycopersicum cv.Indigo Rose）

<400> 2

Met Asn Ile Ala Lys Thr Leu Gly Val Arg Lys Gly Ser Trp Thr Glu

1 5 10 15

Asp Glu Asp Ile Leu Leu Arg Lys Cys Ile Asp Lys Tyr Gly Glu Gly

20 25 30

Lys Trp His Leu Val Pro Phe Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys

35 40 45

Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro His Ile Lys Arg

50 55 60

Gly Asp Phe Ala Met Asp Glu Ile Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Lys

65 70 75 80

Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg

85 90 95

Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu His Lys Lys

100 105 110

Leu Leu Ile Thr Pro Gln Ile Gln Glu Asn Lys Tyr Asn Lys Thr Leu

115 120 125

Lys Ile Ile Thr Glu Ser Thr Ile Leu Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg

130 135 140

Pro Arg Thr Phe Ser Ser Glu Asn Asn Ile Ser Trp Cys Thr Asn Asn

145 150 155 160

Ser Met Ile Thr Asn Thr Leu Asp Lys Asp Asp Glu Gln Arg Asn Lys

165 170 175

Glu Ile Ala Val Asn Ile Cys Glu Lys Pro Thr Arg Glu Thr Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Ile Asp Asp Asp Gly Val Lys Trp Trp Thr Asn Leu Leu Glu

195 200 205

Asn Trp Lys Glu Phe Glu Glu Glu Ala Thr Ala Val Leu Asn Phe Glu

210 215 220

Glu Glu Asn Lys Leu Leu Pro Asn Leu Leu Cys Glu Glu His Asn Ser

225 230 235 240

Thr Thr Met Gln His Gly Glu Asn Asp Asp Phe Ser Val Asp Ile Asp

245 250 255

Leu Trp Asn Leu Phe Asn

260

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgaatattg ccaagacatt g 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ctaattaaat agattccata ggtca 25

Claims

1.蛋白质SlANT1L或编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子在调控番茄花青素合成中的应用；

所述蛋白质SlANT1L为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。

2.蛋白质SlANT1L或编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子在培育花青素含量改变的转基因番茄中的应用。

3.如权利要求1或2所述应用，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

4.一种培育转基因植物的方法，包括向受体植物中导入提高蛋白质SlANT1L表达和/或活性的物质，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的花青素含量提高；所述“向受体植物中导入提高蛋白质SlANT1L表达和/或活性的物质”通过向受体植物中导入编码所述蛋白质SlANT1L的核酸分子实现；

所述蛋白质SlANT1L为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述植物为番茄。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

6.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中蛋白质SlANT1L的含量和/或活性，从而提高植物的花青素含量；

所述植物为番茄。