CN109652423A - 一种水稻开花期调控蛋白及其在育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻开花期调控蛋白及其在育种中的应用，本发明提供了OsLFT1蛋白的氨基酸序列、编码OsLFT1蛋白的OsLFT1核苷酸序列、OsLFT1基因启动子的核苷酸序列。本发明首次克隆了水稻OsLFT1基因，构建了OsLFT1超表达的植物表达载体，OsLFT1启动子启动GUS报告基因的植物表达载体，创制了OsLFT1超表达和OsLFT1启动子启动GUS报告基因的水稻转基因株系，获得了矮化并晚花的水稻育种材料，深入研究了OsLFT1在水稻中的功能。本发明克隆的OsFLT1基因和创制的矮化和开花期改变的水稻育种材料，在水稻矮化育种，提高水稻抗倒伏的能力；在生育期不同的水稻品种选育，解决杂交稻花期不遇，提高水稻的产量和品质等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种水稻开花期调控蛋白及其在育种中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体是涉及一种水稻开花期调控蛋 白及其在育种中的应用。

背景技术

开花期是水稻由营养生长向生殖生长转换的标志。开花期的早晚决定水 稻的产量及地区适应性。水稻只有在适宜生长发育阶段和季节里开花，才能实现 高产和优质。开展水稻成花分子机制的研究，创制生育期不同的水稻种质资源， 对培育生育期不同的水稻品种至关重要。

内源因素和外界的环境条件相互作用，共同调节水稻从营养生长向生殖 生长的转换，即开花。在适宜的条件下，水稻通过生物钟感知外界环境条件(例 如：温度和日照长度)的变化，并产生信号诱导开花相关基因的表达，激活编码 成花素的基因表达，促进开花。因此，水稻开花期的调控是一个重要的、多基因 参与的、复杂的生命过程。

近年来，关于水稻开花期调控分子机制的研究，已经取得一些进展。但 是，水稻开花期调控的分子机制还远不清楚。克隆新的调控水稻开花期的基因， 解析其作用机制，对于我们全面揭示水稻开花期调控的分子机理和基因网络，利 用人工手段改变和调节水稻开花期，指导成熟期不同的水稻品种选育，调节播种 期，保证杂种优势利用过程中杂交种子生产的父本和母本的花期相遇，提高水稻 的适应性和产量，具有重要的理论和实践意义。

参考文献

1)Clough，SJ等，(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana，Plant J 16，735-743。

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Li D，等(2105)Differential transformation efficiency of Japonica ricevarieties developed in northern China，Crop Breed Appl Biot 15，162-168。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种水稻开花期调 控蛋白及其在育种中的应用，通过克隆水稻中OsLFT1基因，获得了OsLFT1基 因的核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列；获得了OsLFT1基因的启动子序列；研 究了OsLFT1基因的功能，发现OsLFT1蛋白质调控水稻的开花期，创制了生育 期不同的育种材料，进而调控水稻的产量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种水稻开花期调控蛋白及 其在育种中的应用，其技术要点是：

本发明提供了一种水稻开花期调控基因和该基因编码的蛋白质，所述调控基因命 名为OsLFT1基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；该基因编码 的蛋白质具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。

发明还提供了所述OsLFT1基因序列和OsLFT1蛋白质序列的获得方法， 具体步骤如下：提取水稻幼苗中的总RNA，进行反转录，以cDNA为模板，利 用OsLFT1F引物(序列见SEQID NO.4)和OsLFT1R引物(序列见SEQ ID NO. 5)，PCR扩增OsLFT1基因，琼脂糖凝胶电泳分离上述RT-PCR产物，回收OsLFT1 基因的片段，经测序，即获得OsLFT1基因的核苷酸序列和OsLFT1蛋白质的氨 基酸序列。

本发明提供了一种水稻开花期调控基因的启动子，所述调控基因的启动 子命名为OsLFT1基因启动子，所述OsLFT1基因启动子序列见SEQ ID NO.3。

获得OsLFT1基因启动子序列的具体技术方案如下：以提取的水稻基因 组DNA为模板，用OsLFT1pF引物(序列见SEQ ID NO.6)和OsLFT1pR引物 (序列见SEQ ID NO.7)，PCR扩增OsLFT1基因的启动子，用琼脂糖凝胶电泳 分离上述PCR产物，回收OsLFT1基因启动子的片段，经测序，即获得OsLFT1 基因启动子的核苷酸序列。

本发明提供了OsLFT1基因的表达模式和编码蛋白质的亚细胞定位。

本发明还提供了利用荧光定量RT-PCR检测OsLFT1表达模式的具体技术 方案；包括以下步骤：采取水稻不同组织和器官、不同发育阶段、昼夜不同时间 点的样品，提取总RNA、反转录，获得cDNA，以合成的cDNA为模板，用 OsLFT1ReF引物(序列见SEQ ID NO.8)和OsLFT1ReR(序列见SEQ ID NO.9) 引物，检测OsLFT1基因的表达模式。

本发明还提供了利用GUS染色的方法分析OsLFT1基因表达模式的方法； 具体步骤如下：(1)PCR扩增基因：以水稻的基因组DNA为模板，PCR扩增 OsLFT1启动子，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收OsLFT1启动子的 DNA片段；(2)连接T-载体，将获得的OsLFT1启动子连入T-载体(pMD18-T vector,Takara,Cat.No.D101A)，用热激法转化大肠杆菌的TOP10细胞，经过提 取质粒，酶切鉴定，测序等步骤，获得正确的OsLFT1启动子在T-载体中的质粒； (3)连接植物双元表达载体：将OsLFT1启动子从T-载体中酶切下来，连入已 经含有35S和GUS基因的植物双元表达载体(pCambia 1300)中，用热激法转化 大肠杆菌TOP10细胞，经过提取质粒，酶切鉴定，获得正确的OsLFT1p:GUS 植物双元表达载体；(4)转化农杆菌：用冻融法将OsLFT1p:GUS植物双元表达 载体转入农杆菌EHA105中，提取质粒，将提取的质粒再转入大肠杆菌TOP10 中，酶切鉴定，获得正确的OsLFT1p:GUS的植物双元表达载体的农杆菌菌种； (5)转化水稻：利用农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化法，将构建好的OsLFT1p:GUS植物双元表达载体转入水稻，利用抗性筛选和PCR相结合的方法 获得OsLFT1p:GUS转基因株系；(6)GUS染色：在T3代，对OsLFT1p:GUS 转基因株系的不同组织和器官进行染色，并拍照。

本发明还提供了获得OsLFT1蛋白质亚细胞定位的技术方案；具体步骤如 下：(1)PCR扩增基因：以水稻的cDNA为模板，PCR扩增OsLFT1基因，用 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收OsLFT1基因的DNA片段；(2)连接 T-载体：将获得的OsLFT1基因连入T-载体(pMD18-T vector,Takara,Cat.No. D101A)，用热激法转化大肠杆菌TOP10细胞，经过提取质粒，酶切鉴定，测序 等步骤，获得正确的OsLFT1基因在T-载体中的质粒；(3)连接植物双元表达载 体：将OsLFT1基因从T-载体中酶切下来，连入已经含有35S和GFP基因的植 物双元表达载体(pCambia 1300)中，用热激法转化大肠杆菌的TOP10细胞，经 过提取质粒，酶切鉴定，获得正确的35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体；(4) 转化农杆菌。用冻融法将35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体转入农杆菌 GV3101中，提取质粒，将提取的质粒再转入大肠杆菌TOP10中，酶切鉴定，获 得正确的35S:GFP-OsLFT1的植物双元表达载体的农杆菌菌种；(5)转化拟南芥。 利用农杆菌介导的拟南芥蘸花遗传转化法，将构建好的35S:GFP-OsLFT1植物双 元表达载体转入拟南芥中，获得拟南芥35S:GFP-OsLFT1转基因植株；(6)GFP 荧光信号观察：在T3代，利用35S:GFP-OsLFT1拟南芥的转基因植株7天幼苗 的根尖和13天幼苗叶片为试材，利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光信号，获 得OsLFT1的亚细胞定位。

本发明提出OsLFT1蛋白质调控水稻株高、开花期及其在育种中的应用； 具体步骤如下：

(1)创制35S:GFP-OsLFT1水稻转基因株系：利用农杆菌介导的水稻成熟胚遗 传转化法，将构建好的35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体转入水稻，获得 35S:GFP-OsLFT1水稻转基因株系；

(2)检测OsLFT1的表达水平：利用荧光定量RT-PCR和RT-PCR的方法，检测 35S:GFP-OsLFT1转基因株系中OsLFT1基因的表达水平，获得OsLFT1超表达 株系；

(3)调查开花期等农艺性状：用未转入35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体的 水稻为对照，于田间每7天调查水稻叶片数和开花期；于成熟期调查水稻株高， OsLFT1超表达株系的出叶速度不变，株高变矮，开花期延迟；

(4)调查产量相关性状：用未转入35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体的水稻 为对照，于成熟期调查有效穗数、穗部性状和粒型，OsLFT1超表达株系的穗变 大、粒长和粒宽增加、千粒重增加、产量增加，为重要的水稻育种材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明在粳型水稻品种沈农9816中首次克隆了OsLFT1基因和OsLFT1基 因的启动子，同时构建了35S:GFP-OsLFT1和OsLFT1p:GUS植物双元表达载体， 明确了OsLFT1基因的表达模式和亚细胞定位，为水稻基因工程的研究提供了基 因资源。

(2)本发明首次获得了OsLFT1基因超表达株系，在粳型水稻品种SN9816 中超表达水稻OsLFT1基因可以使水稻的植株变矮抗倒伏、开花期延迟、穗型和 粒型变大、提高水稻产量，具有良好的应用价值。

(3)本发明解析水稻株高和开花期调控的分子机制，在抗倒伏和生育期 不同的水稻品种选育，解决杂交稻花期不遇，提高水稻的适应性、产量和品质等 方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为OsLFT1基因表达模式分析

其中：A.OsLFT1基因在不同组织器官中的表达模式，B.OsLFT1基因的昼夜 节律表达模式，C.OsLFT1基因不同生长发育时期的表达模式；

图2为植物双元表达载体的构建

其中：A.水稻OsLFT1基因CDS的PCR扩增，B.水稻35S:GFP-OsLFT1植物 双元表达载体的构建，C.OsLFT1基因启动子(OsLFT1p)的PCR扩增，D. OsLFT1p:GUS植物表达载体的构建；

图3为GUS染色

其中A.发芽的种子，B.根，C.茎，D.茎节，E.叶，F.叶鞘，G.穗；

图4为OsLFT1基因亚细胞定位

其中：A.拟南芥叶片中的亚细胞定位，B.拟南芥根部的亚细胞定位；

图5为超表达株系的表达水平分析

其中：A.利用semi-RT-PCR方法检测OsLFT1和GFP基因的表达水平，B.利 用qRT-PCR方法检测OsLFT1基因的表达水平，WT：SN9816；SL3-5,SL5-1, SL7-1,SL8-3,SL12-2,SL16-2,SL17-4,SL19-7,SL20-2,SL21-1,SL22-2,SL24-2 是独立的水稻OsLFT1超表达株系；

图6为超表达株系开花期和株高的观察

其中：A.水稻OsLFT1超表达株系的开花期，B.开花期调查结果，C.出叶速 度调查结果，D.株高调查结果，WT：SN9816；SL3-5,SL5-1,SL7-1,SL8-3，SL12-2， SL16-2，SL17-4，SL19-7，SL20-2，SL21-1，SL22-2，SL24-2是独立的OsLFT1 超表达株系；

图7为超表达株系产量相关性状的观察

其中：A.穗型，B.千粒重，C.粒长，D.粒长调查结果，E.粒宽，F.粒宽调查 结果。WT：SN9816；SL5-1,SL8-3，SL21-1是独立的OsLFT1超表达株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例并结合附图对本发明做进一步的详细说明。但具体 实施例仅是用于说明并不对本发明做任何限定。实施例中所用到的试剂均由市售。

实施例1：

本发明首次克隆了水稻OsLFT1基因，获得了OsLFT1基因的核苷酸序列、蛋白 质的氨基酸序列、启动子的序列，发现超表达OsLFT1基因可以降低株高、延迟 水稻的开花期，从而提高产量。

获得OsLFT1基因序列

利用RNAiso Plus(RNAiso Plus；Takara；Cat.No.9108)浸提剂，根据试剂盒的操 作流程提取在28℃，14小时光照，10小时黑暗的条件下，培养30天的沈农9816 (SN9816)水稻幼苗中的总RNA。利用RNase-free DNase(RQ1RNase-Free DNase；Promega；Cat.No.M6101)，根据试剂盒的操作流程中方法，去除水稻总 RNA中的DNA。利用反转录试剂盒(RevertAidfirst-strand cDNAsynthesis kit； Thermo Scientific；Cat.No.K1621)，根据试剂盒操作流程将去除DNA污染的总 RNA进行反转录(RT，即合成第一条cNDA链)。以cDNA为模板，利用OsLFT1F 引物(5’-atgaacccggcgccgtcgagg-3’)和OsLFT1R引物(5’-ttagtcggctggtctgttccttgatg-3’)，Fast Pfu高保真DNA聚合酶(FastPfuDNA Polymerase,Transgen Biotech,AP)，根据试剂盒操作流程，建立PCR的反应体系， 设定PCR反应条件，PCR扩增OsLFT1基因。上述RT-PCR产物利用琼脂糖凝 胶电泳分离，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit,Omega,Cat.No. D2500-02)，根据试剂盒操作流程，回收OsLFT1基因的片段。送华大基因公司 测序，即获得北方粳稻品种SN9816中OsLFT1基因的核苷酸序列(见序列列表 中OsLFT1基因的核苷酸序列)和OsLFT1蛋白质的氨基酸序列(见序列列表中 OsLFT1蛋白质的氨基酸序列)。

所述OsLFT1基因的核苷酸序列：

atgaacccggcgccgtcgagggcgccgcagcggcagcagcgcggaggggagatgtcggcg

cgctacggcggcgggctgcagttcttcgctgacgccccgccggcgggggtggaggggggc

gccgcgaccgcgcggacgttcttcccggtgccgggcgggggaggggagcagcagccgccg

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aagatgaaggccccactgagcttcgctagcagcaggcagggctccggcggcctctcccag

atatccgaggacggcatcccggacctcactgacagcatccatggcgccgctcatcatcat

gggcgctccgaggagaacgtctccacccacgaccacgtcgtccgctccttctcctccggt

gggttctcgatcgggtcatgggaggactccaactccatcgtgttctccacgtcgacgggc

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caagcatcaaggaacagaccagccgactaa。

所述OsLFT1蛋白质的氨基酸序列：

SerGluGlnAsnSerPheAsxHisMetAsnProAlaProSerArgAlaProGlnArgGln

GlnArgGlyGlyGluMetSerAlaArgTyrGlyGlyGlyLeuGlnPhePheAlaAspAla

ProProAlaGlyValGluGlyGlyAlaAlaThrAlaArgThrPhePheProValProGly

GlyGlyGlyGluGlnGlnProProGluArgAlaMetArgGlnGlnHisTyrGlyGlyGly

GlySerGlyAlaAlaGluIleSerLeuGlyHisGlyHisGlyHisGlyGlyLysHisHis

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PheSerSerSerAlaArgProAlaGlySerSerLeuGlyGluValArgHisGlyAlaMet

SerSerSerSerAsnAsnAsnLysLysMetLysAlaProLeuSerPheAlaSerSerArg

GlnGlySerGlyGlyLeuSerGlnIleSerGluAspGlyIleProAspLeuThrAspSer

IleHisGlyAlaAlaHisHisHisGlyArgSerGluGluAsnValSerThrHisAspHis

ValValArgSerPheSerSerGlyGlyPheSerIleGlySerTrpGluAspSerAsnSer

IleValPheSerThrSerThrGlyLysSerGlyAlaHisGlyAsnAspAspIleIleAla

ThrLeuSerAsnTyrGluSerGlnLeuValAlaProArgGluMetAlaGlyValGluLys

TyrLeuGlnMetGlnHisAspGlnValProPheArgValArgAlaLysArgGlyCysAla

ThrHisProArgSerIleAlaGluArgGluArgArgThrArgIleSerGluLysLeuArg

LysLeuGlnAlaLeuValProAsnMetAspLysGlnThrSerThrSerAspMetLeuAsp

LeuAlaValAspHisIleLysGlyLeuGlnSerGlnLeuGlnThrLeuLysGluAspLys

GluLysCysThrCysSerCysLysGlnAlaSerArgAsnArgProAlaAsp

2.获得OsLFT1基因启动子序列

利用CTAB方法提取培养7天SN9816水稻幼苗的基因组DNA。PCR扩增 OsLFT1的启动子。以提取的SN9816基因组DNA为模板，用OsLFT1pF(5’- agtggcatatgagggtggac-3’)和OsLFT1pR(5’-atgaacccggcgccgtcgagg-3’)引物， Fast Pfu高保真DNA聚合酶(FastPfuDNA Polymerase,Transgen Biotech,AP)， PCR扩增OsLFT1基因的启动子。PCR的反应体系和条件参见试剂盒操作流程。 上述RT-PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳分离，根据琼脂糖凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit,Omega,Cat.No.D2500-02)操作流程，回收OsLFT1基因启动子 的片段。送华大基因公司测序，即获得北方粳稻品种SN9816中OsLFT1基因启 动子的核苷酸序列(见序列列表中OsLFT1基因启动子的核苷酸序列)。

所述OsLFT1基因启动子的核苷酸序列：

agtggcatatgagggtggacaatttcaaactagtggcatagagggaaaaagccaattttc

agtggcatataagggacaaggctaatttggcatgcatatagagaattctccctaggatat

ataggtggccgcacgttggcgtcggatggttggccgcgggcgcgctgggcgtcgtcctcc

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gcttcccttcatctctgtccgtgcttggatggcaatgcctgcctgcctgcctgagctggc

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tgcaagtaggagaagacctacttaaacaactcttccattattacaagcttataaatacga

taacaacaggtgacgtacaactgagcaactgtcgatccaaatgcaacgaaccctgtgcgc

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cgtcatcgggacgagagagagacgacgtcgtcgtcgtcgcgcgcgcgggccagcgcccca

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acgcagcgcccccgcgcggagaagctagctaggtactcctgtctggttagctagctagct

atagctagaagcctagcac。

所述CTAB提取基因组DNA的方法：采取500mg培养7天SN9816幼 苗的叶片，放于研钵中，加入液氮充分研磨，移入2ml EP管中。向装有冻粉的 EP管中加入800μl 2×CTAB提取液(配方见下表)，置于65℃烘箱中30-60min， 每隔10-15min左右颠倒摇匀一次。加入800μl氯仿，上下颠倒混匀，静置10min， 12000rpm，室温，离心10min。将上清液移入新的EP管中加入800μl异丙醇， 颠倒混匀，室温静置30min。12000rpm，离心10min，EP管底部会出现白色沉淀。倒掉上清液，加入1ml 70％无水乙醇，上下颠倒，12000rpm，离心10min。 倒掉上清液，晾干，加入300μl ddH₂O，备用。

表1.2×CTAB基因组DNA提取液的配制

备注：(a)请用专门的试剂提取植物基因组DNA，防止污染。(b)CTAB的全 称：Cetyltrimethylammonium bromide(sigma)。

表达模式分析

利用荧光定量RT-PCR(TB green premix Ex Taq,Takara,Cat.No.RR420A)的方 法，检测了不同组织和器官、昼夜、不同生长发育时期OsLFT1的表达模式。 OsLFT1在叶、叶鞘等组织器官中均有表达(图1A)；其表达在晚上9点表达水 平出现高峰，(图1B)在播种后60天左右表达较高(图1C)。

具体操作流程如下：采取SN9816不同组织和器官、不同发育阶段、昼夜 不同时间点的样品，利用上面所述的实施例中提取total RNA、去除污染的DNA、 反转录，获得cDNA。以合成的cDNA为模板，用OsLFT1ReF(5’- gctagaagcctagcacatgaacc-3’)和OsLFT1ReR(5’-ccgaactgatggaaatggtg-3’)引 物，利用TB green premix Ex Taq(TB green premix ExTaq,Takara,Cat.No. RR420A)，根据试剂盒操作流程，用ABI公司的荧光定量PCR仪(7500Fast Real-Time PCR instrument,Applied Biosystems)，检测OsLFT1基因的表达模式。

具体的PCR反应体系如下：SYBR premix Ex Taq(2X)10μl，ROX Reference DyeII(50X)0.4μl，ddH₂O 6μl，1.25μM正向和反向引物混合物1.6 μl；1:5稀释后的cDNA 2μl。PCR仪的反应条件如下：Stage 1：95℃，10sec； Stage 2：95℃，3sec；60℃，30sec；72℃，34sec；共40循环。

构建35S:GFP-OsLFT1和OsLFT1p:GUS植物双元表达载体

4.1 OsLFT1基因和启动子的获得。以北方粳稻品种SN9816的cDNA为模板， PCR扩增OsLFT1的CDS；以SN9816的基因组DNA为模板，PCR扩增OsLFT1 启动子。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit,Omega,Cat.No.D2500-02)将OsLFT1基因从琼脂糖凝胶中回收 回来(图2A和2C)。

所述PCR扩增DNA片段的方法：以cDNA或基因组DNA为模板，用正 向引物(primerF)和反向引物(primer R)，Fast Pfu高保真DNA聚合酶 (FastPfuDNA Polymerase,Transgen Biotech,AP)PCR扩增基因。PCR反应体系 (50μl Reaction)如下：cDNA 3μl，5×Fast Pfu Buffer，10μl，dNTP 4μl，Primer F 0.5μl，Primer R 0.5μl，Fast Pfu 0.5μl，ddH₂O，31.5μl。PCR反应的条件如下：94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec，循环35次，72℃5min， 16℃2min。

载体的连接和鉴定。将获得的OsLFT1基因和OsLFT1启动子连入T-载体 (pMD18-Tvector,Takara,Cat.No.D101A)，根据所述T载体连接方法操作流程， 用热激法转入大肠杆菌TOP10中，将OsLFT1和OsLFT1启动子连入T-载体， 在37℃条件下，倒置培养12h。挑取阳性菌落于2×YT液体培养基中，在37℃， 250rpm条件下，摇培12h。提取质粒，酶切鉴定，测序，获得正确的OsLFT1 基因和OsLFT1启动子在T-载体中的质粒。

所述热激转化法：从-80℃冰箱拿出感受态细胞，置于冰上融化，在超净 台内将连接产物或质粒加入感受态细胞内，轻弹混匀。冰浴30分钟。42℃(水 浴)热击90秒。冰浴5分钟。超净台内加入1ml无抗性液体培养基，37℃，150 rpm，摇培1小时。4000rpm，室温，离心5min。去上清，留约200μl液体， 吹吸混匀，涂于相应抗性平板上。晾干，37℃，倒置培养过夜。

所述提取质粒方法：挑取单菌落，接种于3-5ml含有相应抗生素的液体 培养基中，摇培过夜；用1.5ml或2ml管集菌，13krpm，离心1min；去掉上 清液；加入溶菌液(溶液I)300μl，涡旋震荡，将菌体混匀；加入菌体裂解液 (溶液II)300μl，颠倒混匀，在室温条件下，静置2min；加入冰浴的溶液III 300 μl，颠倒混匀，可见絮状沉淀；加入900μl的1:1的酚仿混合液，混匀，13krpm， 离心5-10min；将上清液移入新的EP管中；加入800-900μl的异丙醇，混匀， 室温沉淀10-30min，或直接离心，13krmp，离心10min；弃掉上清液，有70％ 的乙醇洗涤，13krmp，离心5min；弃掉上清液，空气干燥；加水30μl，重悬 质粒，储存于-20℃，备用。

所述酶切反应体系：20μl反应体系，加入质粒DNA 2μl，10×Buffer 2μl， Enzmy A0.5μl，Enzmy B 0.5μl，RNaseA 0.1μl，ddH₂O 14.9μl。置于 37℃，1-2小时，用琼脂糖凝胶电泳检测。

植物双元表达载体的连接和鉴定。将OsLFT1和OsLFT1启动子从T-载体 中酶切下来，连入已经含有35S和GFP或GUS的植物双元表达载体(pCambia 1300)中。用热激法转化大肠杆菌的TOP10细胞，在37℃条件下，倒置培养12 h。挑取阳性菌落于2×YT液体培养基中，在37℃，250rpm条件下，摇培12h。 提取质粒，酶切鉴定，获得正确的含有35S:GFP-OsLFT1和OsLFT1p:GUS植物 双元表达载体(图2B和2D)。

农杆菌的转化和鉴定。将35S:GFP-OsLFT1和OsLFT1p:GUS植物双元表 达载体用冻融法转化农杆菌EHA105细胞，在28℃条件下，倒置培养36-48h。 挑取阳性菌落于2×YEB液体培养基中，在28℃，250rpm条件下，摇培36-48 h。提取质粒，将提取的质粒反转到大肠杆菌的TOP 10中，酶切鉴定，获得正确 的35S:GFP-OsLFT1和OsLFT1p:GUS的植物双元表达载体的农杆菌菌种。

所述冻融法转化法：从-80℃冰箱拿出感受态细胞，置于冰上融化。在超 净台内将10μl质粒加入感受态细胞内，轻弹混匀。冰浴30min。液氮冰冻5min， 立即37℃(水浴)热击5min。冰上冷却5min。超净台内加入800μl无抗性 液体培养基(无抗或利福平抗性)，28℃，150rpm，3-4个小时。4000rpm室温 离心5分钟。去上清，留约200μl液体，吹吸混匀，涂于相应抗性平板上。晾 干，28℃培养，48小时。

创制水稻OsLFT1超表达株系

利用农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化法(Li et al，2015)，将构建好的 35S:GFP-OsLFT1和OsLFT1p:GUS植物双元表达载体转入北方粳稻品种SN9816。 利用抗性筛选和PCR相结合的方法获得35S:GFP-OsLFT1和OsLFT1p:GUS的转 基因株系。

染色

在T3代，利OsLFT1p:GUS水稻转基因株系的各个器官进行GUS染色(Jefferson 等，1987)，并拍照。OsLFT1在胚芽、根、茎、茎节、叶、叶鞘、花序等组织 器官中GUS报告基因表达，可以将底物变为蓝色(图3)。

亚细胞定位

利用农杆菌介导的拟南芥蘸花法(Clough，1998)，将35S:GFP-OsLFT1植物双 元表达载体转入拟南芥中，获得拟南芥恒定转化的转基因植株，利用激光共聚焦 显微镜观察7天幼苗的根和叶片中GFP的荧光信号，并作DAPI染色。OsLFT1 基因编码的蛋白质定位在细胞核中，是核蛋白(图4)。

超表达株系中OsLFT1表达水平检测

在T3代，提取野生型(SN9816)和35S:GFP-OsLFT1的转基因株系的total RNA， 利用RT-PCR扩增OsLFT1的表达水平，获得10余株OsLFT1超表达株系(图5)。

超表达株系株高和开花期等农艺性状的观察

在自然长日照条件下，对10余株OsLFT1超表达株系进行了农艺性状的观察。 OsLFT1超表达株系开花期延迟(图6A和6B)、出叶速度不变(图6C)、植株 矮化(图6D)。这些矮化和开花期改变的材料可以用于培育抗倒伏、不同生育期 的水稻新品种，提高水稻产量。

超表达株系产量相关性状的观察

在自然长日照条件下，对OsLFT1超表达株系进行了产量相关性状的观察。 OsLFT1超表达株系的穗型变大(图7A)、粒数增加(图7B)、籽粒变长(图7C 和7D)、变宽(图7E和7F)、千粒重增加，可以显著增加水稻的产量。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种水稻开花期调控蛋白及其在育种中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgaacccgg cgccgtcgag ggcgccgcag cggcagcagc gcggagggga gatgtcggcg 60

cgctacggcg gcgggctgca gttcttcgct gacgccccgc cggcgggggt ggaggggggc 120

gccgcgaccg cgcggacgtt cttcccggtg ccgggcgggg gaggggagca gcagccgccg 180

gagcgcgcga tgaggcagca gcactacggc ggcggcggga gtggtgcggc cgagatctcg 240

ctggggcacg gccacggcca cggcggcaag caccatttcc atcagttcgg cgtcgaggcg 300

aaggacggtg gcggcggcgg cgaccagtcg gggtttctga cgcggcacaa cagctcgcct 360

cccgggttct tctcgagccc cgtcatggac aacggtttct catcgagtgc tagaccagca 420

ggatcatcac tcggtgaggt tcgccatggc gccatgagca gcagcagcaa caacaacaag 480

aagatgaagg ccccactgag cttcgctagc agcaggcagg gctccggcgg cctctcccag 540

atatccgagg acggcatccc ggacctcact gacagcatcc atggcgccgc tcatcatcat 600

gggcgctccg aggagaacgt ctccacccac gaccacgtcg tccgctcctt ctcctccggt 660

gggttctcga tcgggtcatg ggaggactcc aactccatcg tgttctccac gtcgacgggc 720

aaatcaggag cgcacggcaa cgacgacatc atcgccaccc ttagcaacta cgaatctcag 780

cttgttgcgc ccagggagat ggctggcgta gagaaatacc tgcagatgca gcacgaccag 840

gtgccattca gagtacgggc caagcgtgga tgcgcgacgc acccacggag catcgcagag 900

agggagagaa gaacgaggat cagcgagaag ctcaggaagt tgcaggccct ggtgcccaac 960

atggacaagc aaacgagtac ttcagacatg ctggacttag cagttgatca catcaaggga 1020

ctgcagagcc agctgcagac tctgaaggaa gacaaggaga aatgcacctg cagctgcaag 1080

caagcatcaa ggaacagacc agccgactaa 1110

<210> 2

<211> 369

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Asn Pro Ala Pro Ser Arg Ala Pro Gln Arg Gln Gln Arg Gly Gly

1 5 10 15

Glu Met Ser Ala Arg Tyr Gly Gly Gly Leu Gln Phe Phe Ala Asp Ala

20 25 30

Pro Pro Ala Gly Val Glu Gly Gly Ala Ala Thr Ala Arg Thr Phe Phe

35 40 45

Pro Val Pro Gly Gly Gly Gly Glu Gln Gln Pro Pro Glu Arg Ala Met

50 55 60

Arg Gln Gln His Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ala Glu Ile Ser

65 70 75 80

Leu Gly His Gly His Gly His Gly Gly Lys His His Phe His Gln Phe

85 90 95

Gly Val Glu Ala Lys Asp Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gln Ser Gly Phe

100 105 110

Leu Thr Arg His Asn Ser Ser Pro Pro Gly Phe Phe Ser Ser Pro Val

115 120 125

Met Asp Asn Gly Phe Ser Ser Ser Ala Arg Pro Ala Gly Ser Ser Leu

130 135 140

Gly Glu Val Arg His Gly Ala Met Ser Ser Ser Ser Asn Asn Asn Lys

145 150 155 160

Lys Met Lys Ala Pro Leu Ser Phe Ala Ser Ser Arg Gln Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Leu Ser Gln Ile Ser Glu Asp Gly Ile Pro Asp Leu Thr Asp Ser

180 185 190

Ile His Gly Ala Ala His His His Gly Arg Ser Glu Glu Asn Val Ser

195 200 205

Thr His Asp His Val Val Arg Ser Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Ile

210 215 220

Gly Ser Trp Glu Asp Ser Asn Ser Ile Val Phe Ser Thr Ser Thr Gly

225 230 235 240

Lys Ser Gly Ala His Gly Asn Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ser Asn

245 250 255

Tyr Glu Ser Gln Leu Val Ala Pro Arg Glu Met Ala Gly Val Glu Lys

260 265 270

Tyr Leu Gln Met Gln His Asp Gln Val Pro Phe Arg Val Arg Ala Lys

275 280 285

Arg Gly Cys Ala Thr His Pro Arg Ser Ile Ala Glu Arg Glu Arg Arg

290 295 300

Thr Arg Ile Ser Glu Lys Leu Arg Lys Leu Gln Ala Leu Val Pro Asn

305 310 315 320

Met Asp Lys Gln Thr Ser Thr Ser Asp Met Leu Asp Leu Ala Val Asp

325 330 335

His Ile Lys Gly Leu Gln Ser Gln Leu Gln Thr Leu Lys Glu Asp Lys

340 345 350

Glu Lys Cys Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Ser Arg Asn Arg Pro Ala

355 360 365

Asp

<210> 3

<211> 1999

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

agtggcatat gagggtggac aatttcaaac tagtggcata gagggaaaaa gccaattttc 60

agtggcatat aagggacaag gctaatttgg catgcatata gagaattctc cctaggatat 120

ataggtggcc gcacgttggc gtcggatggt tggccgcggg cgcgctgggc gtcgtcctcc 180

tgtctgtccc agtgtccccc tctcgcgctc gccaacttgg gcagttgggc gttgtttatc 240

gcgaggcttc cgtaccaggt gggcataaat ctatacgcca acttggagcg gccggtagac 300

cacggctagc taggggggat gcatggagac tccaaaagcg cggccaagtt gcagttgctt 360

gcttcccttc atctctgtcc gtgcttggat ggcaatgcct gcctgcctgc ctgagctggc 420

tgcctcgtcc actcgtacag tcacagtcat cgtcggaagc tagccggtga tctctcaaat 480

agtactagaa gttgtacgcc gtcgtagcaa gtgcggactg catgtggccg tggtgcggcc 540

gggagcagcg ctcgtgcgtg acatgaattc tgggcccttc tgcttttgga tgtgcagtat 600

gcatgggggc gattataagc gcatcaagtg cactgtgata gtactgtagt acgactgtac 660

gagagacccg actcctgagg attcttggcc aaaactggta ctaccacctg aatgcgcagt 720

agcttgtttg gaagctgacc gaggaaagag agggaaaaat cacgcgcctg tagttctgaa 780

agttttggga aagagataga ttgaacagaa gagagtacac aaacggagag ttagcgtaat 840

acacgagaac tagcatacaa agtacatacg gtctcgagag acgattgaac agaatttccc 900

gtcatgcatg tacggacttg gagtgtatat agctaatgct aaacttgcca cttgaccagc 960

ttgtaccaca ggagtacgta catgctagtg tgctactgtc atcacatcgg tcctagatgc 1020

tcgctggttt gtgattctat aaaccgtatc tagctcaaac aaagccggcc gctaaacacg 1080

cacgcgcgta tgtttaatta actagacaga gtcacaagac aaggacagaa gaccacgggt 1140

tgcaagtagg agaagaccta cttaaacaac tcttccatta ttacaagctt ataaatacga 1200

taacaacagg tgacgtacaa ctgagcaact gtcgatccaa atgcaacgaa ccctgtgcgc 1260

attcgaggca ccgatcgatc tcatccccta taacgcccgg acccacccgg gccccgatgg 1320

ctgatcgatt aaccactagc tggatcaccc aaaccgtcgg cgcggttgtg tatagtccga 1380

gcagcgcggc gccggtgtgg tggtggtggt ggtggccgac tggccgcggt ttcccaaatg 1440

cgcagcgcgc gaggggtccc gcacgcctcc cgcgtccccg catgaccgag cgcgcgcgcg 1500

cgtcatcggg acgagagaga gacgacgtcg tcgtcgtcgc gcgcgcgggc cagcgcccca 1560

gccagttgcc gcttacagta agagggggga gtgtatagta cgatccactt gtcgtccacg 1620

tcgtccgcac cgcaccccat ctcgctaccc atcccccacc cgcgcgcgcg cgcacggcgc 1680

acggcctcca cacgccccgg cccccgagac cgtatcacga gcgcgcgcgg gcgtccagct 1740

tttctcccac gattccacga agccaccacc aatatttccg gtcgtccgat cccccctacc 1800

cctctccgct gatcagtcgc tcgctcgctc gctggctgac tgcgcccgcg cccgctttgc 1860

tgcgctcccc cggcacgcga cgacgaaaag accggcctca aaagcgacac cacgcagcag 1920

acgcagcgcc cccgcgcgga gaagctagct aggtactcct gtctggttag ctagctagct 1980

atagctagaa gcctagcac 1999

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

atgaacccgg cgccgtcgag g 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 引物(primer)

<400> 5

ttagtcggct ggtctgttcc ttgatg 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物(primer)

<400> 6

agtggcatat gagggtggac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 引物(primer)

<400> 7

atgaacccgg cgccgtcgag g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 引物(primer)

<400> 8

gctagaagcc tagcacatga acc 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物(primer)

<400> 9

ccgaactgat ggaaatggtg 20

Claims (6)

1.一种水稻开花期调控蛋白，其特征是：所述调控蛋白为OsLFT1蛋白，由OsLFT1基因编码，所述OsLFT1基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；由OsLFT1基因编码的OsLFT1蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种水稻开花期调控蛋白，其特征是：所述OsLFT1基因序列和OsLFT1蛋白序列的获得方法，具体步骤如下：提取水稻幼苗中的总RNA，进行反转录，以cDNA为模板，利用OsLFT1F引物（序列见SEQ ID NO. 4）和OsLFT1R引物（序列见SEQ ID NO. 5），PCR扩增OsLFT1基因，琼脂糖凝胶电泳分离上述RT-PCR产物，回收OsLFT1基因的片段，经测序，即获得OsLFT1基因的核苷酸序列和OsLFT1蛋白质的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种水稻开花期调控蛋白，其特征是：所述OsLFT1基因的启动子序列见SEQ ID NO. 3；

获得OsLFT1 基因启动子序列的具体技术方案如下：以提取的水稻基因组DNA为模板，用OsLFT1pF引物（序列见SEQ ID NO. 6）和OsLFT1pR引物（序列见SEQ ID NO. 7），PCR扩增OsLFT1基因的启动子，用琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR产物，回收OsLFT1基因启动子的片段，经测序，即获得OsLFT1基因启动子的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的一种水稻开花期调控蛋白，其特征是：所述OsLFT1基因的表达模式和编码蛋白质的亚细胞定位如下：

利用荧光定量RT-PCR检测OsLFT1表达模式包括以下步骤：采取水稻不同组织和器官、不同发育阶段、昼夜不同时间点的样品，提取总RNA、反转录，获得cDNA，以合成的cDNA为模板，用OsLFT1ReF引物(序列见SEQ ID NO. 8) 和OsLFT1ReR (序列见SEQ ID NO. 9) 引物，检测OsLFT1基因的表达模式；

利用GUS染色的方法分析OsLFT1基因表达模式的方法；具体步骤如下：（1）PCR扩增基因：以水稻的基因组DNA为模板，PCR扩增OsLFT1启动子，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收OsLFT1启动子的DNA片段；（2）连接T-载体，将获得的OsLFT1启动子连入T-载体（pMD18-T vector, Takara, Cat. No. D101A），用热激法转化大肠杆菌的TOP10细胞，经过提取质粒，酶切鉴定，测序等步骤，获得正确的OsLFT1启动子在T-载体中的质粒；（3）连接植物双元表达载体：将OsLFT1启动子从T-载体中酶切下来，连入已经含有35S和GUS基因的植物双元表达载体 (pCambia 1300) 中，用热激法转化大肠杆菌TOP10细胞，经过提取质粒，酶切鉴定，获得正确的OsLFT1p:GUS植物双元表达载体；（4）转化农杆菌：用冻融法将OsLFT1p:GUS植物双元表达载体转入农杆菌EHA105中，提取质粒，将提取的质粒再转入大肠杆菌TOP10中，酶切鉴定，获得正确的OsLFT1p:GUS的植物双元表达载体的农杆菌菌种；（5）转化水稻：利用农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化法，将构建好的OsLFT1p:GUS植物双元表达载体转入水稻，利用抗性筛选和PCR相结合的方法获得OsLFT1p:GUS转基因株系；（6）GUS染色：在T3代，对OsLFT1p:GUS转基因株系的不同组织和器官进行染色，并拍照；获得OsLFT1蛋白质亚细胞定位的技术方案；具体步骤如下：（1）PCR扩增基因：以水稻的cDNA为模板，PCR扩增OsLFT1基因，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收OsLFT1基因的DNA片段；（2）连接T-载体：将获得的OsLFT1基因连入T-载体（pMD18-T vector, Takara, Cat. No.D101A），用热激法转化大肠杆菌TOP10细胞，经过提取质粒，酶切鉴定，测序等步骤，获得正确的OsLFT1基因在T-载体中的质粒；（3）连接植物双元表达载体：将OsLFT1基因从T-载体中酶切下来，连入已经含有35S和GFP基因的植物双元表达载体 (pCambia 1300) 中，用热激法转化大肠杆菌的TOP10细胞，经过提取质粒，酶切鉴定，获得正确的35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体；（4）转化农杆菌；用冻融法将35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体转入农杆菌GV3101中，提取质粒，将提取的质粒再转入大肠杆菌TOP10中，酶切鉴定，获得正确的35S:GFP-OsLFT1的植物双元表达载体的农杆菌菌种；（5）转化拟南芥；利用农杆菌介导的拟南芥蘸花遗传转化法，将构建好的35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体转入拟南芥中，获得拟南芥35S:GFP-OsLFT1转基因植株；（6）GFP荧光信号观察：在T3代，利用35S:GFP-OsLFT1拟南芥的转基因植株7天幼苗的根尖和13天幼苗叶片为试材，利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光信号，获得OsLFT1的亚细胞定位。

5.一种水稻开花期调控蛋白及其在育种中的应用，其特征是：所述OsLFT1蛋白具有调控水稻株高、开花期的作用。

6.根据权利要求5所述的一种水稻开花期调控蛋白及其在育种中的应用，其特征是：所述OsLFT1蛋白在育种中的应用方法：

具体步骤如下：

（1）创制35S:GFP-OsLFT1水稻转基因株系：利用农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化法，将构建好的35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体转入水稻，获得35S:GFP-OsLFT1水稻转基因株系；

（2）检测OsLFT1的表达水平：利用荧光定量RT-PCR和RT-PCR的方法，检测35S:GFP-OsLFT1转基因株系中OsLFT1基因的表达水平，获得OsLFT1超表达株系；

（3）调查开花期等农艺性状：用未转入35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体的水稻为对照，于田间调查每7天调查水稻叶片数和开花期；于成熟期调查水稻株高，OsLFT1超表达株系的出叶速度不变，株高变矮，开花期延迟；

（4）调查产量相关性状：用未转入35S:GFP-OsLFT1植物双元表达载体的水稻为对照，于成熟期调查有效穗数、穗部性状和粒型，OsLFT1超表达株系的穗变大、粒长和粒宽增加、千粒重增加、产量增加，为重要的水稻育种材料。